跨上皮电位差对蛙直肠上皮顶膜氯通道的作用
作者：黄天应 王子栋
单位：黄天应 桂林医学院生理室 广西桂林市 541001；王子栋 暨南大学医学院生理室
关键词：氯通道；跨上皮电位差；蛙直肠上皮；上皮电压钳
华夏医学990105 摘要 氯离子跨紧密上皮转运主要采取细胞通路，其转运调控的关键部位是上皮细胞顶膜氯通道。应用上皮电压钳技术、高钾除极化技术和Ussing上皮组织灌流系统结合测定氯离子通量，观察跨上皮电位差对氯离子跨蛙直肠上皮转运的影响。实验结果表明跨上皮电位差对氯离子跨蛙直肠上皮吸收是必不可少的。跨上皮电位差作为转运驱动力外，还能激活蛙直肠上皮细胞顶膜的氯通道。
中图分类号 Q48
Effects of the Transepithelial Voltage on the Apical Chloride Channels of Frog (Rana Temporaria) Rectal Epithelium
, http://www.100md.com
Huang Tianying
Dept.of Physiology,Guilin Medical College,Guilin 541001
Wang Zidong
Dept. of Physiology,Medical College of Jinan University,Guangzhou 510632
Abstract The transportation of chloride ion across the tight epithelia mainly passes through the transcellular pathway with the key position of regulation or control in the apical chloride channels of epithelial cell.This study is to observe the effects of the transepithelial voltage on the transportation of chloride ion across the frog rectal epithelium by using the techniques of epithelial voltage-clamp,high K+ depolarization and Ussing's tissue perfusing system with chloride ion flux determinations.The experimental results showed that the transepithelial voltage is essential to the absorption of chloride ion across the frog rectal epithelium,because it could activate the chloride channels in the apical membrane of frog rectal epithelial cells besides as a driving force.
, 百拇医药
Key words chloride channel;epithelial voltage-clamp;transepithelial voltage;frog rectal epithelium
目前大量研究资料表明，Cl-跨紧密吸收上皮转运主要是经过细胞通路进行。上皮细胞顶膜存在大量的电导性Cl-通道，而细胞间连接紧密，阻抗很大。跨上皮电位差是Cl-跨上皮转运的主要驱动力。然而，本实验观察到在上皮细胞基侧膜高K+除极化的情况下，跨上皮电位差除了作为Cl-转运的驱动力外，对上皮细胞顶膜Cl-通道具有一定的激活作用。
1 方法和材料[1]
1.1 动物 青蛙(Rana Temporaria)，体重(60～90g)，滴水养殖1周。
, http://www.100md.com
1.2 主要仪器 电压钳、数字式电流仪及电位计(日本)；CL925氯分析仪和恒流泵等(中国)。灌流液：(成分mM,pH值7.5)；含Ba2+KCl任氏液(105 KCl 2.5 KHCO3 1.0 CaCl2 5.0 BaCl2)，NaCl任氏液(115 NaCl 2.5 KHCO3 1.0 CaCl2)[2,3]。
1.3 实验方法 常规破坏蛙的脑髓,剖腹取出直肠,沿系膜切开,用任氏液洗掉肠内容物，标本放入任氏液中备用。实验应Ussing's chamber作为灌流小室(面积为1.1886cm2)[4,5]。
2 结果
在不同实验条件下，分别测量上皮基膜侧灌流液的氯离子浓度变化作为氯离子跨上皮通量的指标。结果发现，应用NaCl任氏液灌流直肠上皮短路化或应用含Ba2+KCl任氏液灌流时，基膜侧氯离子浓度没有变化，说明这种情况没有Cl-跨上皮转运；在KCl任氏液灌流，跨上皮电位差箝制在20mV(顶膜侧为负电位)的条件下，基膜侧Cl-浓度明显升高，表明Cl-跨上皮转运对跨上皮电位差有依赖性如表1所示。实验还观察到，应用含Ba2+KCl任氏液灌流时，不同水平的跨上皮电位差对跨上皮电导具有不同的影响。当跨上皮电位差箝制在10mV(顶膜侧为负电位)水平时，跨上皮电导相当稳定如图1所示。以跨上皮电位差等于10mV作为对照，观察跨上皮电位差分别为25mV、50mV、70mV、100mV时，跨上皮电导的变化如图2所示。可见大于50mV跨上皮电位差对跨上皮电导具有增强效应。
, 百拇医药
3 讨论
紧密吸收上皮对氯化钠的转运过程，早在1958年Ussing等就提出了经典的离子转运模型[4]。他们认为紧密上皮组织细胞间的紧密连结对离子通透性等于零；离子转运采取跨细胞通路；跨上皮电位差主要是Na+主动吸收产生的；这个电位差是阴离子被动吸收的直接驱动力。Cl-跨上皮细胞吸收应由两个基本的跨膜步骤组成[6]。①经上皮细胞顶膜的氯离子通道进入细胞内；②经上皮细胞基侧膜上的协同转运系统[7]或高电导的氯通道排出细胞外[8]。普通任氏液灌流条件下，氯电导占基侧膜离子总电导的50%以上[8]。
Fig.1 The time-course of transepithelial conductance (Gt) across frog rectal epithelium (n=23) when transepithelial voltage (Vt) is held at 20mV (apical side is negative) and bathing medium is Ba2+KCl Ringer's solution.
, http://www.100md.com
Fig.2 Effect of transepithelial voltage (Vt) on the transepithelial conductance (Gt) across frog rectal epithelium,when bathing medium is Ba2+KCl Ringer solution.Each bar (blank bar:control Vt=10mV;black bar: Vt=25,50,75,100mV) represents the mean of determinations.Compared with control value,significance is indicated with *P<0.05;**P<0.01.
Table 1 Influence of transepithelial voltage (Vt) on the basolateral Cl- concentration of frog rectal epithelium (
±s) time & effect
, http://www.100md.com
Na+ Ringer'
short-circuited
(n=16)
K+ Ringer's
Vt=0mV
(n=19)
K+ Ringer's
Vt=20mV
(n=23)
beginning
, 百拇医药 after 1h
effect
115.6±0.7
115.8±0.8
0.2*
115.7±0.9
116.0±0.8
0.3*
115.5±1.0
117.7±1.0
2.2**
, 百拇医药
Value are mean±SD.n is the number of preprarations.The bathing medium is NaCl or Ba2+KCl Ringer's and the significant difference is indicated with *P>0.05;**P<0.01.
本实验观察到在短路化状态下和应用KCl任氏液灌流时，蛙直肠上皮对氯离子均没有吸收作用；而跨上皮电位差出现时，蛙直肠上皮对Cl-才具有内向转运的功能如表1所示。说明跨上皮电位差是氯离子跨蛙直肠上皮吸收的必要条件。这与经典的离子转运模型相符。应用氯化钾任氏液灌流，上皮细胞顶膜K+通道被Ba2+阻断的情况下[2]，发现跨上皮钳位电压为10mV(顶膜侧为负电位)水平时，跨上皮电导相当稳定如图1所示。此时跨上皮电导被认为就是上皮顶膜氯离子通道的电导，因为上皮细胞基侧膜由于高钾除极化作用，其电阻远远小于上皮顶膜的电阻[9]。可见，在跨上皮电位差较小的情况下，蛙直肠上皮顶膜氯通道总电导保持稳定状态。然而，实验将跨上皮钳位电位差从10mV提高到大于50mV的不同水平时，跨上皮电导明显增高，而且潜伏期短暂，如图2所示。说明上皮超极化或上皮顶膜去极化即跨顶膜电位差下降，上皮细胞顶膜对氯离子的通透性增加，因为这种实验条件下，唯有氯离子携带电荷跨上皮转运。同时也提示蛙直肠上皮细胞顶膜存在电压依从性氯通道，这种氯通道的功能状态受跨顶膜电位差的调控或影响。
, 百拇医药
作者简介：黄天应(1963～)，男，1991年毕业于暨南大学医学院，获硕士学位，现任桂林医学院生理教研室讲师。
参考文献
[1] 黄天应,王子栋.β-肾上腺素能化合物对Cl-跨蛙直肠上皮转运的影响.中国应用生理学杂志,1998,14(3):244
[2] De Wolf I,Driessche W V,Nagel W.Forskolin activates gated Cl- channels in frog skin.Am J Physiol,1989,25(Cell Physiol.25):C1239～1249
[3] Thompson S M,Yuichi Suzuki,Schultz S G.The electrophysiology of rabbit descending colon,J Membrane Biol,1982,66:41～54
, 百拇医药
[4] Ussing H H,Zerahn K.Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin.Acta Physiol Scand,1951,23:110～127
[5] 王子栋.上皮细胞离子转运的模型.生物医学工程通报，1988，2(1)：28～34
[6] Heming T A,Copello J A,Cohn J A.Regulation of CAMP-activated apical memebrane chloride conductance in gallbladder epithelium.J Gen Physiol,1994,103:1～18
[7] O'Grady S M,Palfrey H C,Field M.Characteristics and function of Na-K-Cl cotransport in epithelial tissues.Am J Physiol,1987,253(Cell Physiol.22):C177～192
, http://www.100md.com
[8] Miley H E,Alexander P D,Sau Wei Li,et al.Chloride conductance in freshly isolated pigmented ciliary body epithelial cells.J Physiol Lond,1995,489:97
[9] Giraldez F,Sepulveda F V,Sheppard D N.Achloride conductance activated by adenosine 3',5'-cyclic monophosphate in teh apical membrane of Necturus enterocytes.J Physiol,1988,395:597～623
(收稿 1998-12-30), 百拇医药
单位：黄天应 桂林医学院生理室 广西桂林市 541001；王子栋 暨南大学医学院生理室
关键词：氯通道；跨上皮电位差；蛙直肠上皮；上皮电压钳
华夏医学990105 摘要 氯离子跨紧密上皮转运主要采取细胞通路，其转运调控的关键部位是上皮细胞顶膜氯通道。应用上皮电压钳技术、高钾除极化技术和Ussing上皮组织灌流系统结合测定氯离子通量，观察跨上皮电位差对氯离子跨蛙直肠上皮转运的影响。实验结果表明跨上皮电位差对氯离子跨蛙直肠上皮吸收是必不可少的。跨上皮电位差作为转运驱动力外，还能激活蛙直肠上皮细胞顶膜的氯通道。
中图分类号 Q48
Effects of the Transepithelial Voltage on the Apical Chloride Channels of Frog (Rana Temporaria) Rectal Epithelium
, http://www.100md.com
Huang Tianying
Dept.of Physiology,Guilin Medical College,Guilin 541001
Wang Zidong
Dept. of Physiology,Medical College of Jinan University,Guangzhou 510632
Abstract The transportation of chloride ion across the tight epithelia mainly passes through the transcellular pathway with the key position of regulation or control in the apical chloride channels of epithelial cell.This study is to observe the effects of the transepithelial voltage on the transportation of chloride ion across the frog rectal epithelium by using the techniques of epithelial voltage-clamp,high K+ depolarization and Ussing's tissue perfusing system with chloride ion flux determinations.The experimental results showed that the transepithelial voltage is essential to the absorption of chloride ion across the frog rectal epithelium,because it could activate the chloride channels in the apical membrane of frog rectal epithelial cells besides as a driving force.
, 百拇医药
Key words chloride channel;epithelial voltage-clamp;transepithelial voltage;frog rectal epithelium
目前大量研究资料表明，Cl-跨紧密吸收上皮转运主要是经过细胞通路进行。上皮细胞顶膜存在大量的电导性Cl-通道，而细胞间连接紧密，阻抗很大。跨上皮电位差是Cl-跨上皮转运的主要驱动力。然而，本实验观察到在上皮细胞基侧膜高K+除极化的情况下，跨上皮电位差除了作为Cl-转运的驱动力外，对上皮细胞顶膜Cl-通道具有一定的激活作用。
1 方法和材料[1]
1.1 动物 青蛙(Rana Temporaria)，体重(60～90g)，滴水养殖1周。
, http://www.100md.com
1.2 主要仪器 电压钳、数字式电流仪及电位计(日本)；CL925氯分析仪和恒流泵等(中国)。灌流液：(成分mM,pH值7.5)；含Ba2+KCl任氏液(105 KCl 2.5 KHCO3 1.0 CaCl2 5.0 BaCl2)，NaCl任氏液(115 NaCl 2.5 KHCO3 1.0 CaCl2)[2,3]。
1.3 实验方法 常规破坏蛙的脑髓,剖腹取出直肠,沿系膜切开,用任氏液洗掉肠内容物，标本放入任氏液中备用。实验应Ussing's chamber作为灌流小室(面积为1.1886cm2)[4,5]。
2 结果
在不同实验条件下，分别测量上皮基膜侧灌流液的氯离子浓度变化作为氯离子跨上皮通量的指标。结果发现，应用NaCl任氏液灌流直肠上皮短路化或应用含Ba2+KCl任氏液灌流时，基膜侧氯离子浓度没有变化，说明这种情况没有Cl-跨上皮转运；在KCl任氏液灌流，跨上皮电位差箝制在20mV(顶膜侧为负电位)的条件下，基膜侧Cl-浓度明显升高，表明Cl-跨上皮转运对跨上皮电位差有依赖性如表1所示。实验还观察到，应用含Ba2+KCl任氏液灌流时，不同水平的跨上皮电位差对跨上皮电导具有不同的影响。当跨上皮电位差箝制在10mV(顶膜侧为负电位)水平时，跨上皮电导相当稳定如图1所示。以跨上皮电位差等于10mV作为对照，观察跨上皮电位差分别为25mV、50mV、70mV、100mV时，跨上皮电导的变化如图2所示。可见大于50mV跨上皮电位差对跨上皮电导具有增强效应。
, 百拇医药
3 讨论
紧密吸收上皮对氯化钠的转运过程，早在1958年Ussing等就提出了经典的离子转运模型[4]。他们认为紧密上皮组织细胞间的紧密连结对离子通透性等于零；离子转运采取跨细胞通路；跨上皮电位差主要是Na+主动吸收产生的；这个电位差是阴离子被动吸收的直接驱动力。Cl-跨上皮细胞吸收应由两个基本的跨膜步骤组成[6]。①经上皮细胞顶膜的氯离子通道进入细胞内；②经上皮细胞基侧膜上的协同转运系统[7]或高电导的氯通道排出细胞外[8]。普通任氏液灌流条件下，氯电导占基侧膜离子总电导的50%以上[8]。
Fig.1 The time-course of transepithelial conductance (Gt) across frog rectal epithelium (n=23) when transepithelial voltage (Vt) is held at 20mV (apical side is negative) and bathing medium is Ba2+KCl Ringer's solution.
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Fig.2 Effect of transepithelial voltage (Vt) on the transepithelial conductance (Gt) across frog rectal epithelium,when bathing medium is Ba2+KCl Ringer solution.Each bar (blank bar:control Vt=10mV;black bar: Vt=25,50,75,100mV) represents the mean of determinations.Compared with control value,significance is indicated with *P<0.05;**P<0.01.
Table 1 Influence of transepithelial voltage (Vt) on the basolateral Cl- concentration of frog rectal epithelium (
±s) time & effect, http://www.100md.com
Na+ Ringer'
short-circuited
(n=16)
K+ Ringer's
Vt=0mV
(n=19)
K+ Ringer's
Vt=20mV
(n=23)
beginning
, 百拇医药 after 1h
effect
115.6±0.7
115.8±0.8
0.2*
115.7±0.9
116.0±0.8
0.3*
115.5±1.0
117.7±1.0
2.2**
, 百拇医药
Value are mean±SD.n is the number of preprarations.The bathing medium is NaCl or Ba2+KCl Ringer's and the significant difference is indicated with *P>0.05;**P<0.01.
本实验观察到在短路化状态下和应用KCl任氏液灌流时，蛙直肠上皮对氯离子均没有吸收作用；而跨上皮电位差出现时，蛙直肠上皮对Cl-才具有内向转运的功能如表1所示。说明跨上皮电位差是氯离子跨蛙直肠上皮吸收的必要条件。这与经典的离子转运模型相符。应用氯化钾任氏液灌流，上皮细胞顶膜K+通道被Ba2+阻断的情况下[2]，发现跨上皮钳位电压为10mV(顶膜侧为负电位)水平时，跨上皮电导相当稳定如图1所示。此时跨上皮电导被认为就是上皮顶膜氯离子通道的电导，因为上皮细胞基侧膜由于高钾除极化作用，其电阻远远小于上皮顶膜的电阻[9]。可见，在跨上皮电位差较小的情况下，蛙直肠上皮顶膜氯通道总电导保持稳定状态。然而，实验将跨上皮钳位电位差从10mV提高到大于50mV的不同水平时，跨上皮电导明显增高，而且潜伏期短暂，如图2所示。说明上皮超极化或上皮顶膜去极化即跨顶膜电位差下降，上皮细胞顶膜对氯离子的通透性增加，因为这种实验条件下，唯有氯离子携带电荷跨上皮转运。同时也提示蛙直肠上皮细胞顶膜存在电压依从性氯通道，这种氯通道的功能状态受跨顶膜电位差的调控或影响。
, 百拇医药
作者简介：黄天应(1963～)，男，1991年毕业于暨南大学医学院，获硕士学位，现任桂林医学院生理教研室讲师。
参考文献
[1] 黄天应,王子栋.β-肾上腺素能化合物对Cl-跨蛙直肠上皮转运的影响.中国应用生理学杂志,1998,14(3):244
[2] De Wolf I,Driessche W V,Nagel W.Forskolin activates gated Cl- channels in frog skin.Am J Physiol,1989,25(Cell Physiol.25):C1239～1249
[3] Thompson S M,Yuichi Suzuki,Schultz S G.The electrophysiology of rabbit descending colon,J Membrane Biol,1982,66:41～54
, 百拇医药
[4] Ussing H H,Zerahn K.Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin.Acta Physiol Scand,1951,23:110～127
[5] 王子栋.上皮细胞离子转运的模型.生物医学工程通报，1988，2(1)：28～34
[6] Heming T A,Copello J A,Cohn J A.Regulation of CAMP-activated apical memebrane chloride conductance in gallbladder epithelium.J Gen Physiol,1994,103:1～18
[7] O'Grady S M,Palfrey H C,Field M.Characteristics and function of Na-K-Cl cotransport in epithelial tissues.Am J Physiol,1987,253(Cell Physiol.22):C177～192
, http://www.100md.com
[8] Miley H E,Alexander P D,Sau Wei Li,et al.Chloride conductance in freshly isolated pigmented ciliary body epithelial cells.J Physiol Lond,1995,489:97
[9] Giraldez F,Sepulveda F V,Sheppard D N.Achloride conductance activated by adenosine 3',5'-cyclic monophosphate in teh apical membrane of Necturus enterocytes.J Physiol,1988,395:597～623
(收稿 1998-12-30), 百拇医药