SJAMP对血小板胞内游离钙水平的影响△
作者：郭涛 沈迪 宋善俊 魏文宁
单位：同济医科大学附属协和医院 血研所
关键词：SJAMP；血小板；胞内游离钙
临床血液学杂志990102
摘要 目的：探讨Ca2+在SJAMP诱导血小板聚集中的 作用。方法：以Fura-2为钙荧光探针，应用双波长法测定了SJAMP对血小板胞内游离钙水平 的影响。结果：发现SJAMP在100 μg/ml时对血小板胞浆游离钙的影响最为显著，可使正常 人血小板胞内钙水平从71.30±7.66 nmol/L升至93.96±10.24 nmol/L( n=10)，在胞外存在1 mmol/L Ca2+时，SJAMP引起胞内游离钙升高幅度更大，可达 116.72±10.66 nmol/L(n=10)。另一方面，SJAMP对血小板胞内游离钙的影响 ，与其它诱导剂相比，其升高幅度较小且时限较长，同时如果血小板预先与环氧化酶抑制剂 孵育，则SJAMP对血小板胞内钙的升高作用明显受抑。结论：推测SJAMP对血小板胞内钙的影 响可能是一花生四烯酸及其代谢物有关的过程。
, 百拇医药
Effect of SJAMP on Platelet Cytosolic Free Ca2+
Guo Tao,Shen Di,Song Sanjun，et al
The Institute of Hematology Tongji Medical University，430022
Abstract Using the method of dual-wavelength measur ement of platelet 〔Ca2+〕i and Fura-2 as the Ca2+ fluorophore pro be,we measured the effect of Acidic Mucopolysaccharide from Sticopus Japonicus S elenka (SJAMP) on platelet 〔Ca2+〕i.The results showed that the most sign ificant increase in platelets 〔Ca2+〕i was seen when the concentration of SJAMP was 100 μg/ml and the elevation of normal platelet 〔Ca2+〕i was 93.96±10.24 nmol/L (n=10).In the presence of extracellular Ca2+ (1 mmol/L),the magnitude of platelets 〔Ca2+〕i could reach 116.72 ±10.66 nmol/L (n=10).On the other hand,the magnitude of increased plate lets 〔Ca2+〕i reaching the highest level was longer when compared with ot her platelet aggregation agents.In the mean time,if platelets was first incubate d with cyclo-oxygenase inhibitor,the rise of 〔Ca2+〕i evoked by SJAMP wa s inhibited.The results indicated that the mechanism of the rise of 〔Ca2+ 〕i induced by SJAMP might be dependent upon the generation of prostaglandin end peroxides and/or TXA2
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Key words SJAMP Platelet Cytosolic free Ca2+
SJAMP作为一种新型血小板诱聚剂，近年来研究发现，其诱导 人血小板聚集曲线呈典型的Ⅱ相聚集，并需外源性纤维蛋白原及Ca2+。超微结构分析 提示，SJAMP作用于血小板时，有血小板激活的一系列形态学表现，并且在血小板表面有可 能存在SJAMP结合位点。这一位点与GPⅢa有关〔1〕。但其聚集机制仍未明了，本文 旨在通过测定SJAMP作用于血小板时〔Ca2+〕i水平的变化，探讨Ca2+在SJAM P诱导血小板聚集中的作用。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器 岛津RF-5000型荧光分光光度计， 恒温摇床，70型离子交换纯水器(上海医学原子仪器厂)，DDL-5型低速冷冻离心机(上海安 亭科学仪器厂)。Sepharose 2B(Pharmacial Fine Chemicals,Sweden)，Fura-2/AM(中国医 学科学院药物研究所)、BSA(Sigma)、HEPES(GIBCO)、Tritonx-100(Sigma)、EGTA(Serva) 、DMSO(Sigma)、SJAMP(天津药物研究所)、ADP(Sigma)、胶原(Chrono-log)、凝血酶(Sigm a)、乙酰水杨酸ASA(武汉第四制药厂)。
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1.2 步骤 ①血小板胞内钙测定：以Fura-2为钙荧光 探针，应用双波长法测定。②以不同浓度的SJAMP 10～200 μg/ml测定其对血小板胞内钙的 影响，寻找影响血小板胞内钙的最佳SJAMP浓度。③在胞外存在零钙及1 mmol/L Ca2+ 时，检测最佳SJAMP浓度对血小板胞内钙的影响。④将获取的PRP与1 mmol/L ASA共同孵育半 小时后，检测ASA对SJAMP诱导血小板胞内钙变化的影响。⑤其它诱聚剂ADP(终浓度为10 μm ol/L)，胶原(终浓度为5 μg/ml)，凝血酶(终浓度为0.3 U/ml)，对血小板胞内钙的影 响。
2 结果
①以不同浓度的SJAMP作用于正常人血小板时，发现在100 μg/ml浓度时，对血小 板胞内钙的影响最为显著。同时这也与SJAMP诱导正常人PRP发生聚集时所需的最佳浓度相一 致，提示Ca2+的变化可作为血小板活化的一个重要指标之一。图1为SJAMP对血小板胞 内钙影响的浓度曲线。②在测定体系中胞外钙浓度为零时，加入100μg/ml SJAMP，其变化 水平达93.96±10.24 nmol/L(n=10)，而在胞外存在1 mmol/L Ca2+时， 加入SJAMP可使血小板胞内钙水平达116.72±10.66 nmol/L(n=10)，说明胞外 钙的存在，可加大SJAMP诱导血小板胞内钙升高的幅度，提示SJAMP诱导血小板〔Ca2+ 〕i的变化有胞外钙参与。血小板预先与ASA共同孵育后，胞外零钙时，加入SJAMP(100 μg/ ml)后，其胞内钙水平无明显变化。SJAMP对正常人血小板胞内钙影响的结果见表1。③其它 诱聚剂对血小板〔Ca2+〕i水平影响，均较SJAMP明显，结果见表2。④SJAMP对胞内钙 影响的曲线，与诱聚剂ADP相比，其上升幅度较小，且所需时间较长。结果见图2。
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图1 不同浓度SJAMP对正常人血小板胞内钙水平的影响
表1 SJAMP对正常人血小板胞内游离钙的影响 1 静息状态下
〔Ca2+ 〕i水平
71.30±7.66 nmol/L
(n=20)
2 胞外零钙时，加入SJAMP(100 μg/ml)
93.96±10.24 nmol/L(n=10)
3 胞外存在1 mmol/L,Ca2+，加入SJAMP (100 μg/ ml)
116.72±10.66 nmol/L(n=10)
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4 预先与ASA孵育后，加入SJAMP(100 μg/ml)
76.52±8.31 nmol/L(n=10)
与1比较 P<0.001，与3比较 P<0.001表2 不同诱聚剂对〔Ca2+〕i的影响 诱聚剂
n值
〔Ca2+〕i水平
SJAMP(100 μg/ml)
10
93.96 ±10.19
ADP(10 μmol/L)
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5
128.14±10.31
胶原(5 μg/ml)
5
226.28±31.40
凝血酶(0.3 u/ml)
5
697.16±114.11
〔Ca2+〕i的浓度单位均为nmol/L，**P<0.001，与SJAMP引起的〔Ca2+〕i比较
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图2 SJAMP，ADP对血小板胞内钙的影响
3 讨论
血小板活化涉及到诱聚剂与血小板表面受体相互作用、细胞外信息通过第二信使 传递至胞内，血小板的变形、聚集、释放等〔2〕。而SJAMP是一种氨基多糖，被认为 是一种新型的血小板诱聚剂。既往的研究认为SJAMP能够引起正常人血小板激活的超微结构 改变〔3〕，其诱导的血小板聚集依赖于外源性纤维蛋白原及Ca2+，且花生四 烯酸及其代谢物为SJAMP引起的血小板聚集所必需〔4〕。在SJAMP对血小板胞内游离 钙影响的研究中，结果发现：以不同浓度的SJAMP作用于人血小板，其对血小板胞内游离钙 的影响与SJAMP诱导的血小板聚集的最佳浓度类似(在100 μg/ml左右)，过高浓度的SJAMP对 胞内游离钙影响的程度反而下降。这说明SJAMP引起的胞内钙变化与血小板的聚集间存在一 定的关联。在SJAMP浓度为100 μg/ml时，SJAMP可引起血小板胞内游离钙水平的轻度升高， 而在胞外存在1 mmol/L Ca2+条件下，SJAMP引起胞内游离钙升高幅度更大，说明胞外 钙可能是通过某种通道进入胞内而参与了SJAMP对血小板胞内钙的升高。由于在正常情况下 ，血小板胞内游离钙水平的升高与一系列生物学效应包括聚集、释放等密切相关〔5〕 ，所以SJAMP诱导人血小板聚集，胞外钙的存在除与保持血小板表面GP Ⅱb/Ⅲa的正常构 型相关以外，参与胞内钙水平的升高，可能是其诱导血小板聚集的钙依赖的原因之一。
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预先以环氧化酶抑制剂ASA与血小板孵育后，测定SJAMP对血小板胞内钙的影响，发现其对胞 内钙的升高作用明显受抑。提示在SJAMP介导的这一对胞内钙影响的效应中，花生四烯酸及 其代谢物即前列腺素内过氧化物和(或)TXA2，在这一过程中起着重要作用，并进一步解释 了为什么SJAMP诱导的血小板聚集对环氧化酶抑制剂敏感的原因。在SJAMP对血小板胞内钙的 影响中，还发现SJAMP对胞内钙的影响在时间上与常规诱聚剂的作用有不同之处，即其引起 胞内钙水平升高所需时间较长且幅度较小，对环氧化酶抑制剂敏感。提示SJAMP引起的胞内 钙水平的升高，是其通过某种中间环节引起花生四烯酸的释放，通过代谢形成的TXA2反作 用于血小板的结果。同时也说明，与其它诱聚剂相比，SJAMP对胞内钙水平的影响较小。
△ 国家自然科学基金资助课题(基金号39370322 )
邮政编码：武汉市，430022
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参考文献
[1] 胡俊斌，沈迪，魏文宁，等.刺参酸性粘多糖与洗涤的人 血小板的结合.中国药理学报，1990，110：47
[2] Siess W.Molecular mechanisms of platelet activation.Physiol Rev,1989,6 9:58
[3] 胡豫，沈迪，魏文宁，等.刺参酸性粘多糖聚集功能缺陷症的血小板超微结构.中 华血液学杂志。1990，11：197
[4] 李家增，连俊一.刺参酸性粘多糖对人和兔血小板的聚集作用.中华血液学杂志， 1987，8：469
[5] Rink T,J Sage SO.Calcium signaling in human platelets.Annu Rev Physiol .1990,52
(1998-08-25 收稿 1998-10-23 修回), http://www.100md.com
单位：同济医科大学附属协和医院 血研所
关键词：SJAMP；血小板；胞内游离钙
临床血液学杂志990102
摘要 目的：探讨Ca2+在SJAMP诱导血小板聚集中的 作用。方法：以Fura-2为钙荧光探针，应用双波长法测定了SJAMP对血小板胞内游离钙水平 的影响。结果：发现SJAMP在100 μg/ml时对血小板胞浆游离钙的影响最为显著，可使正常 人血小板胞内钙水平从71.30±7.66 nmol/L升至93.96±10.24 nmol/L( n=10)，在胞外存在1 mmol/L Ca2+时，SJAMP引起胞内游离钙升高幅度更大，可达 116.72±10.66 nmol/L(n=10)。另一方面，SJAMP对血小板胞内游离钙的影响 ，与其它诱导剂相比，其升高幅度较小且时限较长，同时如果血小板预先与环氧化酶抑制剂 孵育，则SJAMP对血小板胞内钙的升高作用明显受抑。结论：推测SJAMP对血小板胞内钙的影 响可能是一花生四烯酸及其代谢物有关的过程。
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Effect of SJAMP on Platelet Cytosolic Free Ca2+
Guo Tao,Shen Di,Song Sanjun，et al
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Abstract Using the method of dual-wavelength measur ement of platelet 〔Ca2+〕i and Fura-2 as the Ca2+ fluorophore pro be,we measured the effect of Acidic Mucopolysaccharide from Sticopus Japonicus S elenka (SJAMP) on platelet 〔Ca2+〕i.The results showed that the most sign ificant increase in platelets 〔Ca2+〕i was seen when the concentration of SJAMP was 100 μg/ml and the elevation of normal platelet 〔Ca2+〕i was 93.96±10.24 nmol/L (n=10).In the presence of extracellular Ca2+ (1 mmol/L),the magnitude of platelets 〔Ca2+〕i could reach 116.72 ±10.66 nmol/L (n=10).On the other hand,the magnitude of increased plate lets 〔Ca2+〕i reaching the highest level was longer when compared with ot her platelet aggregation agents.In the mean time,if platelets was first incubate d with cyclo-oxygenase inhibitor,the rise of 〔Ca2+〕i evoked by SJAMP wa s inhibited.The results indicated that the mechanism of the rise of 〔Ca2+ 〕i induced by SJAMP might be dependent upon the generation of prostaglandin end peroxides and/or TXA2
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Key words SJAMP Platelet Cytosolic free Ca2+
SJAMP作为一种新型血小板诱聚剂，近年来研究发现，其诱导 人血小板聚集曲线呈典型的Ⅱ相聚集，并需外源性纤维蛋白原及Ca2+。超微结构分析 提示，SJAMP作用于血小板时，有血小板激活的一系列形态学表现，并且在血小板表面有可 能存在SJAMP结合位点。这一位点与GPⅢa有关〔1〕。但其聚集机制仍未明了，本文 旨在通过测定SJAMP作用于血小板时〔Ca2+〕i水平的变化，探讨Ca2+在SJAM P诱导血小板聚集中的作用。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器 岛津RF-5000型荧光分光光度计， 恒温摇床，70型离子交换纯水器(上海医学原子仪器厂)，DDL-5型低速冷冻离心机(上海安 亭科学仪器厂)。Sepharose 2B(Pharmacial Fine Chemicals,Sweden)，Fura-2/AM(中国医 学科学院药物研究所)、BSA(Sigma)、HEPES(GIBCO)、Tritonx-100(Sigma)、EGTA(Serva) 、DMSO(Sigma)、SJAMP(天津药物研究所)、ADP(Sigma)、胶原(Chrono-log)、凝血酶(Sigm a)、乙酰水杨酸ASA(武汉第四制药厂)。
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1.2 步骤 ①血小板胞内钙测定：以Fura-2为钙荧光 探针，应用双波长法测定。②以不同浓度的SJAMP 10～200 μg/ml测定其对血小板胞内钙的 影响，寻找影响血小板胞内钙的最佳SJAMP浓度。③在胞外存在零钙及1 mmol/L Ca2+ 时，检测最佳SJAMP浓度对血小板胞内钙的影响。④将获取的PRP与1 mmol/L ASA共同孵育半 小时后，检测ASA对SJAMP诱导血小板胞内钙变化的影响。⑤其它诱聚剂ADP(终浓度为10 μm ol/L)，胶原(终浓度为5 μg/ml)，凝血酶(终浓度为0.3 U/ml)，对血小板胞内钙的影 响。
2 结果
①以不同浓度的SJAMP作用于正常人血小板时，发现在100 μg/ml浓度时，对血小 板胞内钙的影响最为显著。同时这也与SJAMP诱导正常人PRP发生聚集时所需的最佳浓度相一 致，提示Ca2+的变化可作为血小板活化的一个重要指标之一。图1为SJAMP对血小板胞 内钙影响的浓度曲线。②在测定体系中胞外钙浓度为零时，加入100μg/ml SJAMP，其变化 水平达93.96±10.24 nmol/L(n=10)，而在胞外存在1 mmol/L Ca2+时， 加入SJAMP可使血小板胞内钙水平达116.72±10.66 nmol/L(n=10)，说明胞外 钙的存在，可加大SJAMP诱导血小板胞内钙升高的幅度，提示SJAMP诱导血小板〔Ca2+ 〕i的变化有胞外钙参与。血小板预先与ASA共同孵育后，胞外零钙时，加入SJAMP(100 μg/ ml)后，其胞内钙水平无明显变化。SJAMP对正常人血小板胞内钙影响的结果见表1。③其它 诱聚剂对血小板〔Ca2+〕i水平影响，均较SJAMP明显，结果见表2。④SJAMP对胞内钙 影响的曲线，与诱聚剂ADP相比，其上升幅度较小，且所需时间较长。结果见图2。
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图1 不同浓度SJAMP对正常人血小板胞内钙水平的影响
表1 SJAMP对正常人血小板胞内游离钙的影响 1 静息状态下
〔Ca2+ 〕i水平
71.30±7.66 nmol/L
(n=20)
2 胞外零钙时，加入SJAMP(100 μg/ml)
93.96±10.24 nmol/L(n=10)
3 胞外存在1 mmol/L,Ca2+，加入SJAMP (100 μg/ ml)
116.72±10.66 nmol/L(n=10)
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4 预先与ASA孵育后，加入SJAMP(100 μg/ml)
76.52±8.31 nmol/L(n=10)
与1比较 P<0.001，与3比较 P<0.001表2 不同诱聚剂对〔Ca2+〕i的影响 诱聚剂
n值
〔Ca2+〕i水平
SJAMP(100 μg/ml)
10
93.96 ±10.19
ADP(10 μmol/L)
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5
128.14±10.31
胶原(5 μg/ml)
5
226.28±31.40
凝血酶(0.3 u/ml)
5
697.16±114.11
〔Ca2+〕i的浓度单位均为nmol/L，**P<0.001，与SJAMP引起的〔Ca2+〕i比较
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图2 SJAMP，ADP对血小板胞内钙的影响
3 讨论
血小板活化涉及到诱聚剂与血小板表面受体相互作用、细胞外信息通过第二信使 传递至胞内，血小板的变形、聚集、释放等〔2〕。而SJAMP是一种氨基多糖，被认为 是一种新型的血小板诱聚剂。既往的研究认为SJAMP能够引起正常人血小板激活的超微结构 改变〔3〕，其诱导的血小板聚集依赖于外源性纤维蛋白原及Ca2+，且花生四 烯酸及其代谢物为SJAMP引起的血小板聚集所必需〔4〕。在SJAMP对血小板胞内游离 钙影响的研究中，结果发现：以不同浓度的SJAMP作用于人血小板，其对血小板胞内游离钙 的影响与SJAMP诱导的血小板聚集的最佳浓度类似(在100 μg/ml左右)，过高浓度的SJAMP对 胞内游离钙影响的程度反而下降。这说明SJAMP引起的胞内钙变化与血小板的聚集间存在一 定的关联。在SJAMP浓度为100 μg/ml时，SJAMP可引起血小板胞内游离钙水平的轻度升高， 而在胞外存在1 mmol/L Ca2+条件下，SJAMP引起胞内游离钙升高幅度更大，说明胞外 钙可能是通过某种通道进入胞内而参与了SJAMP对血小板胞内钙的升高。由于在正常情况下 ，血小板胞内游离钙水平的升高与一系列生物学效应包括聚集、释放等密切相关〔5〕 ，所以SJAMP诱导人血小板聚集，胞外钙的存在除与保持血小板表面GP Ⅱb/Ⅲa的正常构 型相关以外，参与胞内钙水平的升高，可能是其诱导血小板聚集的钙依赖的原因之一。
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预先以环氧化酶抑制剂ASA与血小板孵育后，测定SJAMP对血小板胞内钙的影响，发现其对胞 内钙的升高作用明显受抑。提示在SJAMP介导的这一对胞内钙影响的效应中，花生四烯酸及 其代谢物即前列腺素内过氧化物和(或)TXA2，在这一过程中起着重要作用，并进一步解释 了为什么SJAMP诱导的血小板聚集对环氧化酶抑制剂敏感的原因。在SJAMP对血小板胞内钙的 影响中，还发现SJAMP对胞内钙的影响在时间上与常规诱聚剂的作用有不同之处，即其引起 胞内钙水平升高所需时间较长且幅度较小，对环氧化酶抑制剂敏感。提示SJAMP引起的胞内 钙水平的升高，是其通过某种中间环节引起花生四烯酸的释放，通过代谢形成的TXA2反作 用于血小板的结果。同时也说明，与其它诱聚剂相比，SJAMP对胞内钙水平的影响较小。
△ 国家自然科学基金资助课题(基金号39370322 )
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参考文献
[1] 胡俊斌，沈迪，魏文宁，等.刺参酸性粘多糖与洗涤的人 血小板的结合.中国药理学报，1990，110：47
[2] Siess W.Molecular mechanisms of platelet activation.Physiol Rev,1989,6 9:58
[3] 胡豫，沈迪，魏文宁，等.刺参酸性粘多糖聚集功能缺陷症的血小板超微结构.中 华血液学杂志。1990，11：197
[4] 李家增，连俊一.刺参酸性粘多糖对人和兔血小板的聚集作用.中华血液学杂志， 1987，8：469
[5] Rink T,J Sage SO.Calcium signaling in human platelets.Annu Rev Physiol .1990,52
(1998-08-25 收稿 1998-10-23 修回), http://www.100md.com