凝胶阻滞检测核蛋白-DNA结合方法的探讨
作者：谢小薰 肖绍文 Swisshelmjia K
单位：广西医科大学组织胚胎学教研室 南宁 530021
关键词：凝胶阻滞分析；核蛋白；维甲类X受体
广西医科大学学报990111 摘要 目的：探讨改良的凝胶阻滞法用于核蛋白-DNA结合的检测。方法：培养人真皮成纤维细胞，用维甲酸刺激不同时段，抽提其核蛋白，与32P-标记维甲酸反应元件(RARE)及维甲类X受体α、β(RXR α、β)抗体结合，进行凝胶阻滞分析。结果：细胞于不同状态可出现迁移率不同的条带，加入RXR β抗体可产生新的上移条带。结论：改良后的凝胶阻滞法较简单灵敏，可用于核蛋白-DNA结合的检测。
中国图书资料分类法分类号 R446.61
IMPROVEMENT OF GEL RETARDATION ASSAYS FOR THE STUDY OF
, 百拇医药
BINDING OF NUCLEAR PROTEIN AND DNA
Xie Xiaoxun,Xiao Shaowen*,Swisshelmjia K**(Dept.of Histology &
Embryology Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:To improve a gel retardation Assay for the study of binding in the nuclear protein and DNA.Method:Cultured fibroblasts were stimulated with Retinoic acid in different time courses,nuclear protein was isolated and binded with 32P labeled retinoic acid responsive element and antibody to Retinoid X Receptors α,β (RXR α,β),and then gel retardation assays were performed.Result:There were different bands which resulted from different mobility in electrophoresis when the cells were in different conditions.A new supershift band appeared after incubating the antibody to RXR β with nuclear protein.Conclusion:The improved gel retardation assays suitable for the study in dinding of nuclear protein and DNA are simple and sensitive.
, 百拇医药
Key words gel retardation assays;nuclear protein;retinoid X Receptors(RXR)
*Dept.of Neurosurgery
**Experimantal Center of Surgery,Columblia University,NY USA 10032
核受体为一类配体依赖性转录调节蛋白，与相应的配体结合后，可识别靶基因上的特定DNA序列即配体反应元件，从而调节靶基因的表达，引起生物效应。目前一些基因上的反应元件的DNA序列已清楚，但由于各类核受体中有不同的亚型，亚型中存在不同的异构体，它们之间可相互结合形成二聚体，以助于与靶基因上的反应元件结合，不同的细胞或同一细胞不同的条件均可出现不同的核受体-DNA结合，致使生物学效应非常复杂。本文报告对传统的凝胶阻滞法进行改良，运用于对维甲类X受体(RXR)与维甲酸反应元件(β2 RARE)结合的研究，可望用于多种核蛋白与DNA结合的确定，为核受体的研究奠定基础。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1细胞培养：人真皮成纤维细胞置于含体积分数10%小牛血清的DMEM液中培养，体积分数为5%CO2，37℃。细胞在维甲酸刺激前，先饥饿48 h(即置于体积分数为0.5%小牛血清的DMEM液中)，然后用全反式维甲酸(AT-RA，Sigma产品)刺激细胞于不同的时段。
1.2 核蛋白的抽提：冷PBS将培养的细胞冲洗两遍，于冰上用适量的PBS将细胞刮脱，4℃离心去上清液，用细胞体积5倍的Buffer A(含10 mmol/L Hepes pH 7.9,1.5 mmol/L KCl,2 mmol/L DTT)将细胞打散，再次离心去上清液后，加入细胞体积3倍的Buffer A，冰育10 min，用均化器将细胞冲击10次，此步骤的目的是通过Buffer A使细胞肿胀，然后借助机械的方法将细胞破裂，通过离心获细胞核。取细胞核体积的3/4倍的Buffer C(20 mmol/L Hepes pH 7.9,20% glycerol,0.5 mmol/L NaCl,1.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L EDTA,2 mmol/L DTT)，将胞核悬浮，冰育30 min，其间每5 min震荡一次，目的是使细胞核破裂，为了确定胞核破裂的比率，可取一滴含胞核的Buffer C在镜下观察。接着将Buffer C离心，上清液中即含有核蛋白，为去除以上各步液体中残留的盐，获取较纯的核蛋白，用Buffer D(含20 mmol/L Hepes pH7.9,20% glycerol,100 mmol/L KCl,0.2 mmol/L EDTA,5 mmol/L MgCl2,2 mmol/L DTT)进行透析，Buffer D的用量应较大，约为核蛋白Buffer C液的100倍，透析时间约4～12 h,4℃，透析完毕，再次离心取上清液，置-70℃或液氮保存。
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1.3 探针标记：商业合成维甲酸反应元件(β2 RARE)寡核苷酸(GGGTAGGGTTCACCGAAATTCACT-
CG)，32P-rATP进行末端标记。标记好的探针活性至少应为1×105/μg CPM。
1.4 凝胶阻滞分析(gel retardation assays)[1]
1.4.1 核蛋白与探针的结合反应：取3～5 μg核蛋白，1 μg poly dI-dc,0.5～1 ng32P标记的β2 RARE至结合缓冲液(10 mmol/L EDTA，2.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L DTT)，DNA-核蛋白结合反应液总体积为25 μl，室温孵育20 min。
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1.4.2 核蛋白-探针复合物凝胶阻滞分析：β2 RARE-核蛋白复合物在0.5×TBE缓冲液中经质量分数为5%聚丙烯酰胺凝胶电泳1～1.5 h，将胶翻转置滤纸上，真空干燥，65℃，1 h。-70℃进行放射自显影。
1.4.3 抗体-核蛋白-探针结合反应及凝胶阻滞分析：分别加入2 μl RXR β抗体(Affinity Bioreagent,Inc产品)RXR α抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc产品)与核蛋白孵育，4℃，16 h。然后按上述步骤进行抗体-核蛋白-探针结合反应和凝胶阻滞分析。
2 结果和讨论
2.1核蛋白抽提是该实验的主要一步，虽较费时耗力，但如果一次抽提较大量的核蛋白，小量分装存放于低温下，可长时间多次使用，故仍较方便。为防止核蛋白的分解，所有操作(包括离心)应在低温下进行，液体配制后不需消毒，室温下可存放，液体用前需预冷并按量加DDT即可。
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2.2 关于凝胶电泳：该试验需进行两次电泳，第一次目的为确定核蛋白是否与已知的反应元件结合；如图1所示，对照组有明显的条带Ⅰ(第2行)；用RA刺激细胞不同时段(第4、6、8、10行)，出现了较条带Ⅰ迁移缓慢的条带Ⅱ，说明RA诱导产生了正常情况下不明显或不存在的β2 RARE-核蛋白结合复合体，即条带Ⅱ；进一步则要确定这些能与β2 RARE结合的核蛋白性质，需进行第二次电泳，选用不同的核蛋白抗体分别与这些核蛋白孵育，再与探针结合后进行电泳，如果核蛋白中存在有与抗体相对应的特异性蛋白，由于大分子复合物的形成，电泳上则出现迁移阻滞，产生超滞后现象(supershift)；如图2所示，加入RXR β抗体的核蛋白组出现新的上移条带SS(第4、7行)RXR α抗体则无此作用，说明与β2 RARE结合的核蛋白中含RXR β，而不含RXR α。由此可见，通过不同的核蛋白抗体重复以上试验，可逐一明确何种核受体与反应元件结合，该法与过去类似的方法比较[2]，省去了将核蛋白-DNA复合物由凝胶转至NC膜，再与探针杂交洗膜这一步，因而省时省力，不足之处为同位素使用易造成污染。
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图1 凝胶阻滞分析图谱
注：未经RA刺激的对照组(第2行)，RA刺激细胞1、4、6、24 h的实验组(第4、6、8、10)；组间对照组(第3、5、7、9、11)
图2 抗体-核蛋白-β2 RARE复合物凝胶阻滞分析图谱
注：未经RA刺激的对照组核蛋白(第2、4行)；RA刺激4 h组(第5、6、7)，加入抗体RXR β组(4、7行)，出现新的上条带SS；加入抗体RXR α组第(3、6行)
2.3 关于组间对照的设置，为了防止由放射性元素非特异性结合所致的假阳性出现，验证DNA与蛋白结合的特异性，一般都要进行竞争性抑制实验，尤其是在第一次电泳时，因为尚不明确核蛋白与探针结合的情况。方法是在反应体系中先加入过量的未标记探针(常为标记探针量的100倍)与核蛋白结合，其它条件同实验组。原理为加入过量的未标记探针预先与核蛋白孵育后，使特异的蛋白与未标记的探针结合而耗尽，随后，虽加入标记的探针，但因核蛋白中已无相应的特异蛋白，故胶片上无显影带，呈阴性结果；与实验组出现的显影带比较，说明这些显影带是由特异性核蛋白与探针结合所致的特异性显影带。图1中第3、5、7、9、11行为组间对照组，显示了条带Ⅰ、Ⅱ已基本消失或减弱，虽然第7、9行条带Ⅱ未完全消失，可能与加入的未标记探针量不足有关。
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综上所述，该法的基本原理是通过核蛋白-DNA复合物和抗体-核蛋白-DNA复合物在电泳上迁移率的不同进行分析比较，实践证明较简单灵敏，用于确定何种蛋白与DNA结合是非常可行的。
作者简介：肖绍文：广西医科大学第一附属医院神经外科 南宁 530021
Swisshelmjia K：美国哥伦比亚大学外科中心实验室 NY 10032
参考文献
1 Tsou HC,Xie Xiaoxun,Yao YJ,et al.Expression of Retinoid X Receptors in human dermal fibroblast.Exp Cell Res,1997,236:493
2 王 鑫，刘 旭，章静波，等.红细胞终末分化期出现与珠蛋白基因表达增强子HS2序列特异结合的蛋白因子.解剖学报，1994，25(5)：379
收稿日期：1998-06-16, 百拇医药
单位：广西医科大学组织胚胎学教研室 南宁 530021
关键词：凝胶阻滞分析；核蛋白；维甲类X受体
广西医科大学学报990111 摘要 目的：探讨改良的凝胶阻滞法用于核蛋白-DNA结合的检测。方法：培养人真皮成纤维细胞，用维甲酸刺激不同时段，抽提其核蛋白，与32P-标记维甲酸反应元件(RARE)及维甲类X受体α、β(RXR α、β)抗体结合，进行凝胶阻滞分析。结果：细胞于不同状态可出现迁移率不同的条带，加入RXR β抗体可产生新的上移条带。结论：改良后的凝胶阻滞法较简单灵敏，可用于核蛋白-DNA结合的检测。
中国图书资料分类法分类号 R446.61
IMPROVEMENT OF GEL RETARDATION ASSAYS FOR THE STUDY OF
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BINDING OF NUCLEAR PROTEIN AND DNA
Xie Xiaoxun,Xiao Shaowen*,Swisshelmjia K**(Dept.of Histology &
Embryology Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:To improve a gel retardation Assay for the study of binding in the nuclear protein and DNA.Method:Cultured fibroblasts were stimulated with Retinoic acid in different time courses,nuclear protein was isolated and binded with 32P labeled retinoic acid responsive element and antibody to Retinoid X Receptors α,β (RXR α,β),and then gel retardation assays were performed.Result:There were different bands which resulted from different mobility in electrophoresis when the cells were in different conditions.A new supershift band appeared after incubating the antibody to RXR β with nuclear protein.Conclusion:The improved gel retardation assays suitable for the study in dinding of nuclear protein and DNA are simple and sensitive.
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Key words gel retardation assays;nuclear protein;retinoid X Receptors(RXR)
*Dept.of Neurosurgery
**Experimantal Center of Surgery,Columblia University,NY USA 10032
核受体为一类配体依赖性转录调节蛋白，与相应的配体结合后，可识别靶基因上的特定DNA序列即配体反应元件，从而调节靶基因的表达，引起生物效应。目前一些基因上的反应元件的DNA序列已清楚，但由于各类核受体中有不同的亚型，亚型中存在不同的异构体，它们之间可相互结合形成二聚体，以助于与靶基因上的反应元件结合，不同的细胞或同一细胞不同的条件均可出现不同的核受体-DNA结合，致使生物学效应非常复杂。本文报告对传统的凝胶阻滞法进行改良，运用于对维甲类X受体(RXR)与维甲酸反应元件(β2 RARE)结合的研究，可望用于多种核蛋白与DNA结合的确定，为核受体的研究奠定基础。
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1 材料和方法
1.1细胞培养：人真皮成纤维细胞置于含体积分数10%小牛血清的DMEM液中培养，体积分数为5%CO2，37℃。细胞在维甲酸刺激前，先饥饿48 h(即置于体积分数为0.5%小牛血清的DMEM液中)，然后用全反式维甲酸(AT-RA，Sigma产品)刺激细胞于不同的时段。
1.2 核蛋白的抽提：冷PBS将培养的细胞冲洗两遍，于冰上用适量的PBS将细胞刮脱，4℃离心去上清液，用细胞体积5倍的Buffer A(含10 mmol/L Hepes pH 7.9,1.5 mmol/L KCl,2 mmol/L DTT)将细胞打散，再次离心去上清液后，加入细胞体积3倍的Buffer A，冰育10 min，用均化器将细胞冲击10次，此步骤的目的是通过Buffer A使细胞肿胀，然后借助机械的方法将细胞破裂，通过离心获细胞核。取细胞核体积的3/4倍的Buffer C(20 mmol/L Hepes pH 7.9,20% glycerol,0.5 mmol/L NaCl,1.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L EDTA,2 mmol/L DTT)，将胞核悬浮，冰育30 min，其间每5 min震荡一次，目的是使细胞核破裂，为了确定胞核破裂的比率，可取一滴含胞核的Buffer C在镜下观察。接着将Buffer C离心，上清液中即含有核蛋白，为去除以上各步液体中残留的盐，获取较纯的核蛋白，用Buffer D(含20 mmol/L Hepes pH7.9,20% glycerol,100 mmol/L KCl,0.2 mmol/L EDTA,5 mmol/L MgCl2,2 mmol/L DTT)进行透析，Buffer D的用量应较大，约为核蛋白Buffer C液的100倍，透析时间约4～12 h,4℃，透析完毕，再次离心取上清液，置-70℃或液氮保存。
, 百拇医药
1.3 探针标记：商业合成维甲酸反应元件(β2 RARE)寡核苷酸(GGGTAGGGTTCACCGAAATTCACT-
CG)，32P-rATP进行末端标记。标记好的探针活性至少应为1×105/μg CPM。
1.4 凝胶阻滞分析(gel retardation assays)[1]
1.4.1 核蛋白与探针的结合反应：取3～5 μg核蛋白，1 μg poly dI-dc,0.5～1 ng32P标记的β2 RARE至结合缓冲液(10 mmol/L EDTA，2.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L DTT)，DNA-核蛋白结合反应液总体积为25 μl，室温孵育20 min。
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1.4.2 核蛋白-探针复合物凝胶阻滞分析：β2 RARE-核蛋白复合物在0.5×TBE缓冲液中经质量分数为5%聚丙烯酰胺凝胶电泳1～1.5 h，将胶翻转置滤纸上，真空干燥，65℃，1 h。-70℃进行放射自显影。
1.4.3 抗体-核蛋白-探针结合反应及凝胶阻滞分析：分别加入2 μl RXR β抗体(Affinity Bioreagent,Inc产品)RXR α抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc产品)与核蛋白孵育，4℃，16 h。然后按上述步骤进行抗体-核蛋白-探针结合反应和凝胶阻滞分析。
2 结果和讨论
2.1核蛋白抽提是该实验的主要一步，虽较费时耗力，但如果一次抽提较大量的核蛋白，小量分装存放于低温下，可长时间多次使用，故仍较方便。为防止核蛋白的分解，所有操作(包括离心)应在低温下进行，液体配制后不需消毒，室温下可存放，液体用前需预冷并按量加DDT即可。
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2.2 关于凝胶电泳：该试验需进行两次电泳，第一次目的为确定核蛋白是否与已知的反应元件结合；如图1所示，对照组有明显的条带Ⅰ(第2行)；用RA刺激细胞不同时段(第4、6、8、10行)，出现了较条带Ⅰ迁移缓慢的条带Ⅱ，说明RA诱导产生了正常情况下不明显或不存在的β2 RARE-核蛋白结合复合体，即条带Ⅱ；进一步则要确定这些能与β2 RARE结合的核蛋白性质，需进行第二次电泳，选用不同的核蛋白抗体分别与这些核蛋白孵育，再与探针结合后进行电泳，如果核蛋白中存在有与抗体相对应的特异性蛋白，由于大分子复合物的形成，电泳上则出现迁移阻滞，产生超滞后现象(supershift)；如图2所示，加入RXR β抗体的核蛋白组出现新的上移条带SS(第4、7行)RXR α抗体则无此作用，说明与β2 RARE结合的核蛋白中含RXR β，而不含RXR α。由此可见，通过不同的核蛋白抗体重复以上试验，可逐一明确何种核受体与反应元件结合，该法与过去类似的方法比较[2]，省去了将核蛋白-DNA复合物由凝胶转至NC膜，再与探针杂交洗膜这一步，因而省时省力，不足之处为同位素使用易造成污染。
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图1 凝胶阻滞分析图谱
注：未经RA刺激的对照组(第2行)，RA刺激细胞1、4、6、24 h的实验组(第4、6、8、10)；组间对照组(第3、5、7、9、11)
图2 抗体-核蛋白-β2 RARE复合物凝胶阻滞分析图谱
注：未经RA刺激的对照组核蛋白(第2、4行)；RA刺激4 h组(第5、6、7)，加入抗体RXR β组(4、7行)，出现新的上条带SS；加入抗体RXR α组第(3、6行)
2.3 关于组间对照的设置，为了防止由放射性元素非特异性结合所致的假阳性出现，验证DNA与蛋白结合的特异性，一般都要进行竞争性抑制实验，尤其是在第一次电泳时，因为尚不明确核蛋白与探针结合的情况。方法是在反应体系中先加入过量的未标记探针(常为标记探针量的100倍)与核蛋白结合，其它条件同实验组。原理为加入过量的未标记探针预先与核蛋白孵育后，使特异的蛋白与未标记的探针结合而耗尽，随后，虽加入标记的探针，但因核蛋白中已无相应的特异蛋白，故胶片上无显影带，呈阴性结果；与实验组出现的显影带比较，说明这些显影带是由特异性核蛋白与探针结合所致的特异性显影带。图1中第3、5、7、9、11行为组间对照组，显示了条带Ⅰ、Ⅱ已基本消失或减弱，虽然第7、9行条带Ⅱ未完全消失，可能与加入的未标记探针量不足有关。
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综上所述，该法的基本原理是通过核蛋白-DNA复合物和抗体-核蛋白-DNA复合物在电泳上迁移率的不同进行分析比较，实践证明较简单灵敏，用于确定何种蛋白与DNA结合是非常可行的。
作者简介：肖绍文：广西医科大学第一附属医院神经外科 南宁 530021
Swisshelmjia K：美国哥伦比亚大学外科中心实验室 NY 10032
参考文献
1 Tsou HC,Xie Xiaoxun,Yao YJ,et al.Expression of Retinoid X Receptors in human dermal fibroblast.Exp Cell Res,1997,236:493
2 王 鑫，刘 旭，章静波，等.红细胞终末分化期出现与珠蛋白基因表达增强子HS2序列特异结合的蛋白因子.解剖学报，1994，25(5)：379
收稿日期：1998-06-16, 百拇医药