福建省畲族人群永久性淋巴母细胞株的建立*
作者：王明权 蒋龙富 林 炜 林妙灵 姜 芬
单位：王明权 蒋龙富 林 炜 林妙灵 姜 芬 福建医科大学生物学教研室(福州 350004)
关键词：淋巴母细胞；细胞株；畲族
福建医科大学学报990110 目的 建立畲族的永久性淋巴母细胞株以探讨基因组结构及其健康素质以及遗传结构，同时为畲族纯系基因组的保存提供一种行之有效的手段。 方法 按照经典的建株方法，以携带EB病毒的B95-8细胞转化畲族青少年的外周血淋巴细胞，其中男性15例，女性15例，平均年龄15.51±1.07岁。 结果 经培养筛选，目前能连续传代的培养物有12份。染色体观察，未发现核型在数目和结构上有明显变化。 结论 所建成的这些细胞株可进一步为遗传学及分子生物学的研究提供随时可取的实验材料。
Establishment of Lymphoblastoid Cell Strains from She Population in Fujian of China
, http://www.100md.com
Wang Mingquan, Jiang Longfu, Lin Wei, et al
(Department of Biology, Fujian Medical University, Fuzhou, 350004)
Objective To provide an effective method to preserve the genomic structure, and to study the health quality and genetic structure of the She people who distribute only in some limited areas of Fujian and Zhejiang province as well. Methods Following the classic procedure, transformed peripheral B lymphocytes(PBLs) derived from She adolescent(15 male cases, and 15 female cases, with an average of 15.51±1.07 years-old) by B95-8 cells hosted with Epstein-Barr virus(EBV). Results So far, 12 B lymphocyte-derived cell strains have been established successfully by means of EBV-transforming method, and the number and structure of the chromosomes have no obvious change. According to consulting references, no similar study has been reported yet. Conclusion The established cell strains can be used as available material in genetics, and molecular biology and other related studies.
, 百拇医药
Key words lymphoblast; cell strains; She people
建立不同民族的永久性淋巴细胞库，是研究民族的起源与演化、人类基因组计划、不同民族健康素质的遗传结构以及流行病学等研究的重要条件。
畲族主要分布于我国福建、浙江一带。笔者进行畲族人群淋巴母细胞株的建库工作，经过3年多的努力，到目前为止已成功地建立了12株淋巴母细胞株。据文献查新，尚未发现在畲族人群的研究中有类似的报道。所建成的这些细胞株可进一步开展遗传学及分子生物学的实验研究。
1 材料与方法
1.1 供血者
供血者为福州民族中学的学生，采血标准为连续三代直系血亲均为畲族的个体，其中男性15例，女性15例，平均年龄15.51±1.07岁。
, http://www.100md.com
1.2 试剂配制
1.2.1 淋巴细胞分离液
淋巴细胞分离液购自上海化学试剂采购供应站。
1.2.2 完全培养基
RPMI 1640培养基(Gibco BRL)，内含20%胎牛血清(Sigma)，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml，L-谷氨酰胺2 mmol/L，Hepes 10 mmol/L。
1.2.3 环孢素A
环孢素A(sandimmune，Sandoz)浓缩液，以磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)配制为母液
(1 mg/ml)，吸取母液2 ml到RPMI 1640培养基8 ml中，即为工作液(200 μg/ml)，0.22 μm滤膜过滤除菌，-20°C保存备用。
, 百拇医药
1.2.4 EB病毒悬液的制备
培养B95-8细胞(上海医科大学生物学教研室惠赠)，以内含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，待繁殖的细胞数量较多时，饥饿1周左右，然后收获培养液于离心管中，反复冻融3次，以1000 r/min离心10 min，取上清，0.22 μm滤膜过滤除菌，分装，-20°C保存备用。
1.2.5 转化培养基
完全培养基内，补加环孢素A 0.05 ml (200 μg/ml)，EB病毒悬液3 ml。
1.2.6 细胞冻存液
细胞冻存液为二甲基亚砜8 ml，胎牛血清92 ml。
1.3 建株
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建株方法参照夏蓓莉等的方法[1]，略有修改。即无菌抽取外周血7～10 ml，肝素抗凝，室温存放24～72 h。将全血与等体积RPMI 1640培养液小心混匀，取上述混合血沿管壁小心滴加到盛有淋巴细胞分离液2 ml的离心管液面上，静置10 min后以2500 r/min 离心30 min。收集淋巴细胞转入另支离心管中，以不含血清的RPMI 1640培养基洗涤细胞，1000 r/min离心10 min，重复洗涤细胞两次。然后接种细胞到25 ml培养瓶内，使转化培养基内的细胞密度为(1～2)×105/ml。每个培养瓶内加入细胞悬液1.0 ml，EB病毒悬液3.0 ml，200 μg/ml环孢素A 0.05 ml，置于37°C，5% CO2培养箱(PCO2 160Z，福建省机械科学研究院研制)内培养。5天左右开始观察，根据培养液pH和细胞生长状况以及转化克隆的多少进行半量换液。一旦转化细胞形成的细胞团明显增多，培养液变为黄色，补加新鲜培养液1～2 ml，进行分瓶培养，并视细胞生长情况和培养液pH决定是否换液，待繁殖6代左右，进行染色体制备观察，并冻存细胞。
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1.4 染色体制备
取培养的细胞悬液2 ml转入25 ml培养瓶内，加入新鲜培养液3 ml继续培养，待细胞处于对数生长期时，以常规空气干燥法制备染色体标本。
2 结 果
所有血样在接种5～9天后，倒置显微镜下观察，可见淋巴细胞出现不同程度的体积增大、透亮，并形成活跃运动的伪足的转化淋巴母细胞(图1)，常常有数目众多、大小不等的转化淋巴细胞聚集在一起而形成的转化克隆细胞群(图2)。
图1 形态各异、旺盛生长的转化细胞群
图2 转化细胞伸展的活跃伪足
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通过常规空气干燥法制备培养细胞的染色体，发现建株前后染色体的形态和数目没有明显的变化(图3)。
图3 转化淋巴母细胞的染色体
目前通过上述方法已成功地建立畲族人群来源的淋巴母细胞株共12份，在体外已连续传代培养7次以上。至此，畲族人群的淋巴母细胞株已基本建立，这些细胞株已可基本满足遗传学及分子生物学的进一步研究。
3 讨 论
目前由于经济的迅猛发展、人口流动规模的日益扩大以及不同人种与民族之间的通婚越来越密切，使各个民族与民族隔离群体正在通过分散、融合而迅速地消失。畲族作为我国闽浙一带的一支少数民族，因其分布地域的局限性，尚保存其特有的基因组。
外周血淋巴细胞作为最常用的人类遗传学研究材料，具有寿命短的缺陷，而多次取材以探讨细胞培养条件，又存在着诸多的不便。近年来发展起来的EB病毒转化人类淋巴细胞以建立淋巴母细胞株的技术，由于只需要少量的外周血，即可建成永久性淋巴母细胞株，目前已在免疫学、遗传学、细胞生物学及分子生物学研究中得到了日益广泛的应用。
, 百拇医药
EB病毒可选择性地转化B淋巴细胞。文献报道以携带EB病毒的B95-8细胞转化人类外周血淋巴细胞的成功率在10%～90%以上，但假如供血个体在早期曾经遭受EB病毒感染，则由于T记忆淋巴细胞的免疫应答作用，而攻击培养物内已转化的B淋巴细胞，使已转化的B细胞发生退化而死亡，因此转化率相对较未经病毒感染者的转化率要低一些。环孢素A可在细胞的G0/G1期选择性地抑制T淋巴细胞中RNA聚合酶Ⅱ的活性而阻断T细胞的增殖，掩盖T细胞对EB病毒的免疫应答作用，防止已转化的B淋巴细胞因T淋巴细胞的攻击而退化[2]。在接种培养过程的早期同时引入EB病毒和环孢素A被认为是高效建株的关键[3]。本文在建株过程中曾经建立了22株可连续传代的培养物，尽管在转化过程中都同时引入了EB病毒和环孢素A，但先后有10株发生了退化，推测可能是由于个体间差异造成的。
大多数EB病毒基因组以环型质粒的形式存在于转化的细胞内，因此在核型上会增加一条额外的亚中部[4]或中部或近端部着丝粒的染色体[5]，或染色体结构在长臂或短臂上有缺失或重排现象[4]。也有实验表明在某些转化细胞内EB病毒的DNA可能直接整合到宿主基因组内[3]。本文的情况似乎更倾向于后者，有待进一步实验验证。
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(致谢：本文得到了上海医科大学生物学教研室、福建省卫生厅、福建省民族工作委员会、福州民族中学以及福安民族中学的大力支持，特此表示感谢。)
*：福建省卫生厅科研基金资助项目(94191)
参考文献
[1]夏蓓莉, 左 伋. 环孢菌素A对建立EB病毒转化的B淋巴细胞系的促进作用. 上海医科大学学报, 1996;23126
[2]Brack C, Mattaj I W, Gautshi J. Cyclosporin A is a differential inhibitor of eukaryotic RNA polymerase. Exp Cell Res, 1984;151:314
[3]戴和平, 夏家辉, 潘 乾, 等. 一种高效的人类淋巴细胞建株方法. 遗传, 1995;17(2): 34
[4]Roncella S, Dunia R. Establishment of an EBV-positive lymphoblastoid cell line that grows as a lymphoma in nude mice and express membrane CD2 molecules. Int J Cancer, 1990;45:299
[5]Hus TC. Mammalian chromosome. News Letter, 19970;4:198
(收稿：1998-05-27 修回：1998-12-23), 百拇医药
单位：王明权 蒋龙富 林 炜 林妙灵 姜 芬 福建医科大学生物学教研室(福州 350004)
关键词：淋巴母细胞；细胞株；畲族
福建医科大学学报990110 目的 建立畲族的永久性淋巴母细胞株以探讨基因组结构及其健康素质以及遗传结构，同时为畲族纯系基因组的保存提供一种行之有效的手段。 方法 按照经典的建株方法，以携带EB病毒的B95-8细胞转化畲族青少年的外周血淋巴细胞，其中男性15例，女性15例，平均年龄15.51±1.07岁。 结果 经培养筛选，目前能连续传代的培养物有12份。染色体观察，未发现核型在数目和结构上有明显变化。 结论 所建成的这些细胞株可进一步为遗传学及分子生物学的研究提供随时可取的实验材料。
Establishment of Lymphoblastoid Cell Strains from She Population in Fujian of China
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Wang Mingquan, Jiang Longfu, Lin Wei, et al
(Department of Biology, Fujian Medical University, Fuzhou, 350004)
Objective To provide an effective method to preserve the genomic structure, and to study the health quality and genetic structure of the She people who distribute only in some limited areas of Fujian and Zhejiang province as well. Methods Following the classic procedure, transformed peripheral B lymphocytes(PBLs) derived from She adolescent(15 male cases, and 15 female cases, with an average of 15.51±1.07 years-old) by B95-8 cells hosted with Epstein-Barr virus(EBV). Results So far, 12 B lymphocyte-derived cell strains have been established successfully by means of EBV-transforming method, and the number and structure of the chromosomes have no obvious change. According to consulting references, no similar study has been reported yet. Conclusion The established cell strains can be used as available material in genetics, and molecular biology and other related studies.
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Key words lymphoblast; cell strains; She people
建立不同民族的永久性淋巴细胞库，是研究民族的起源与演化、人类基因组计划、不同民族健康素质的遗传结构以及流行病学等研究的重要条件。
畲族主要分布于我国福建、浙江一带。笔者进行畲族人群淋巴母细胞株的建库工作，经过3年多的努力，到目前为止已成功地建立了12株淋巴母细胞株。据文献查新，尚未发现在畲族人群的研究中有类似的报道。所建成的这些细胞株可进一步开展遗传学及分子生物学的实验研究。
1 材料与方法
1.1 供血者
供血者为福州民族中学的学生，采血标准为连续三代直系血亲均为畲族的个体，其中男性15例，女性15例，平均年龄15.51±1.07岁。
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1.2 试剂配制
1.2.1 淋巴细胞分离液
淋巴细胞分离液购自上海化学试剂采购供应站。
1.2.2 完全培养基
RPMI 1640培养基(Gibco BRL)，内含20%胎牛血清(Sigma)，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml，L-谷氨酰胺2 mmol/L，Hepes 10 mmol/L。
1.2.3 环孢素A
环孢素A(sandimmune，Sandoz)浓缩液，以磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)配制为母液
(1 mg/ml)，吸取母液2 ml到RPMI 1640培养基8 ml中，即为工作液(200 μg/ml)，0.22 μm滤膜过滤除菌，-20°C保存备用。
, 百拇医药
1.2.4 EB病毒悬液的制备
培养B95-8细胞(上海医科大学生物学教研室惠赠)，以内含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，待繁殖的细胞数量较多时，饥饿1周左右，然后收获培养液于离心管中，反复冻融3次，以1000 r/min离心10 min，取上清，0.22 μm滤膜过滤除菌，分装，-20°C保存备用。
1.2.5 转化培养基
完全培养基内，补加环孢素A 0.05 ml (200 μg/ml)，EB病毒悬液3 ml。
1.2.6 细胞冻存液
细胞冻存液为二甲基亚砜8 ml，胎牛血清92 ml。
1.3 建株
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建株方法参照夏蓓莉等的方法[1]，略有修改。即无菌抽取外周血7～10 ml，肝素抗凝，室温存放24～72 h。将全血与等体积RPMI 1640培养液小心混匀，取上述混合血沿管壁小心滴加到盛有淋巴细胞分离液2 ml的离心管液面上，静置10 min后以2500 r/min 离心30 min。收集淋巴细胞转入另支离心管中，以不含血清的RPMI 1640培养基洗涤细胞，1000 r/min离心10 min，重复洗涤细胞两次。然后接种细胞到25 ml培养瓶内，使转化培养基内的细胞密度为(1～2)×105/ml。每个培养瓶内加入细胞悬液1.0 ml，EB病毒悬液3.0 ml，200 μg/ml环孢素A 0.05 ml，置于37°C，5% CO2培养箱(PCO2 160Z，福建省机械科学研究院研制)内培养。5天左右开始观察，根据培养液pH和细胞生长状况以及转化克隆的多少进行半量换液。一旦转化细胞形成的细胞团明显增多，培养液变为黄色，补加新鲜培养液1～2 ml，进行分瓶培养，并视细胞生长情况和培养液pH决定是否换液，待繁殖6代左右，进行染色体制备观察，并冻存细胞。
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1.4 染色体制备
取培养的细胞悬液2 ml转入25 ml培养瓶内，加入新鲜培养液3 ml继续培养，待细胞处于对数生长期时，以常规空气干燥法制备染色体标本。
2 结 果
所有血样在接种5～9天后，倒置显微镜下观察，可见淋巴细胞出现不同程度的体积增大、透亮，并形成活跃运动的伪足的转化淋巴母细胞(图1)，常常有数目众多、大小不等的转化淋巴细胞聚集在一起而形成的转化克隆细胞群(图2)。
图1 形态各异、旺盛生长的转化细胞群
图2 转化细胞伸展的活跃伪足
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通过常规空气干燥法制备培养细胞的染色体，发现建株前后染色体的形态和数目没有明显的变化(图3)。
图3 转化淋巴母细胞的染色体
目前通过上述方法已成功地建立畲族人群来源的淋巴母细胞株共12份，在体外已连续传代培养7次以上。至此，畲族人群的淋巴母细胞株已基本建立，这些细胞株已可基本满足遗传学及分子生物学的进一步研究。
3 讨 论
目前由于经济的迅猛发展、人口流动规模的日益扩大以及不同人种与民族之间的通婚越来越密切，使各个民族与民族隔离群体正在通过分散、融合而迅速地消失。畲族作为我国闽浙一带的一支少数民族，因其分布地域的局限性，尚保存其特有的基因组。
外周血淋巴细胞作为最常用的人类遗传学研究材料，具有寿命短的缺陷，而多次取材以探讨细胞培养条件，又存在着诸多的不便。近年来发展起来的EB病毒转化人类淋巴细胞以建立淋巴母细胞株的技术，由于只需要少量的外周血，即可建成永久性淋巴母细胞株，目前已在免疫学、遗传学、细胞生物学及分子生物学研究中得到了日益广泛的应用。
, 百拇医药
EB病毒可选择性地转化B淋巴细胞。文献报道以携带EB病毒的B95-8细胞转化人类外周血淋巴细胞的成功率在10%～90%以上，但假如供血个体在早期曾经遭受EB病毒感染，则由于T记忆淋巴细胞的免疫应答作用，而攻击培养物内已转化的B淋巴细胞，使已转化的B细胞发生退化而死亡，因此转化率相对较未经病毒感染者的转化率要低一些。环孢素A可在细胞的G0/G1期选择性地抑制T淋巴细胞中RNA聚合酶Ⅱ的活性而阻断T细胞的增殖，掩盖T细胞对EB病毒的免疫应答作用，防止已转化的B淋巴细胞因T淋巴细胞的攻击而退化[2]。在接种培养过程的早期同时引入EB病毒和环孢素A被认为是高效建株的关键[3]。本文在建株过程中曾经建立了22株可连续传代的培养物，尽管在转化过程中都同时引入了EB病毒和环孢素A，但先后有10株发生了退化，推测可能是由于个体间差异造成的。
大多数EB病毒基因组以环型质粒的形式存在于转化的细胞内，因此在核型上会增加一条额外的亚中部[4]或中部或近端部着丝粒的染色体[5]，或染色体结构在长臂或短臂上有缺失或重排现象[4]。也有实验表明在某些转化细胞内EB病毒的DNA可能直接整合到宿主基因组内[3]。本文的情况似乎更倾向于后者，有待进一步实验验证。
, http://www.100md.com
(致谢：本文得到了上海医科大学生物学教研室、福建省卫生厅、福建省民族工作委员会、福州民族中学以及福安民族中学的大力支持，特此表示感谢。)
*：福建省卫生厅科研基金资助项目(94191)
参考文献
[1]夏蓓莉, 左 伋. 环孢菌素A对建立EB病毒转化的B淋巴细胞系的促进作用. 上海医科大学学报, 1996;23126
[2]Brack C, Mattaj I W, Gautshi J. Cyclosporin A is a differential inhibitor of eukaryotic RNA polymerase. Exp Cell Res, 1984;151:314
[3]戴和平, 夏家辉, 潘 乾, 等. 一种高效的人类淋巴细胞建株方法. 遗传, 1995;17(2): 34
[4]Roncella S, Dunia R. Establishment of an EBV-positive lymphoblastoid cell line that grows as a lymphoma in nude mice and express membrane CD2 molecules. Int J Cancer, 1990;45:299
[5]Hus TC. Mammalian chromosome. News Letter, 19970;4:198
(收稿：1998-05-27 修回：1998-12-23), 百拇医药