缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用
作者：关养时 吕新生
单位：关养时 吕新生 湖南医科大学附属湘雅医院普外科(长沙 410078)
关键词：肝缺血再灌注损伤；缺血预处理；大鼠
福建医科大学学报990107 目的 探讨缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。 方法 在大鼠肝脏持续60 min缺血及30 min再灌注之前，先进行5，10，15 min 的缺血及等长时间的再灌注。 于再灌注30 min完成时取标本测定肝功能、抗氧化酶、脂质过氧化物及形态学研究。 结果 持续60 min 缺血及30 min再灌注后，肝功能明显受损，抗氧化酶活力显著下降，肝组织大片坏死；5 min的缺血预处理能明显改善肝功能、提高抗氧化酶活力,减少肝细胞坏死；10 min效果次之；15 min反而加重肝脏损害。 结论 5 min的缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，它可能为肝脏缺血再灌注损伤的防治提供一种简单有效的新方法。
, http://www.100md.com
Protective Effect of Ischemic Preconditioning on Ischemic Reperfusion Injury of Liver
Guan Yangshi, Lu Xinsheng
(Department of General Surgery, Xiangya Hospital,Affiliated to Hunan Medical University , Changsha, 410078)
Objective To study the protective effect of ischemic preconditioning(PC) on ischemia-reperfusion injury of liver. Methods Liver of the rat was subjected to prolonged 90 min ischemia and 30 min reperfusion preceded by 5,10,15min ischemic periods and reperfusion periods. The samples for studing liver function,antioxidant enzymes, product of lipid peroxidant were gained at the time when 30 min reperfusion was completed. Results After 90 min ischemia and 30 min reperfusion,the values of AST,ALT,LDH were markedly inereased,the activites of antioxidant enzymes were significant decreased, and patch necrosis of hepatocytes could be seen microscopically; 5 min preconditioning markedly improved liver function,increased the activites of antioxidant enzymes and reduced necrosis of hepatocytes;the effect of 10 min preconditioning takes the second place;15 min preconditioning made the damages of liver heavier. Conclusion 5 min preconditioning can protect the rat liver from ischemia-reperfusion injury and it may provide a simple, effecteve, new method for the treatment and prevention of ischemia-reperfusion injury in liver.
, 百拇医药
Key words liver ischemia-reperfusion injury; ischemic preconditioning; rat
1986年，Murry等[1]在研究狗心缺血再灌注损伤时发现，多次短暂的阻断冠脉，对心肌并没有产生积累性损伤，反而提高了心肌对随后而来的较长时程缺血的耐受力，他们称这一现象为缺血预处理(PC)。此后，许多作者相继在多种动物模型上证实了缺血预处理的心肌保护作用，效果肯定[2]，并已应用到临床心脏手术[3]。本实验观察不同时间的缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响，旨在探讨缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤是否具有保护作用，同时寻找适合的预处理时间，并探讨其机制。
1 材料与方法
1.1 动物模型 雄性SD大鼠60只，体重180～220 g，参照Jaeschke和Metzger法[4,5]制备成右肝全部缺血、左肝部分缺血后再灌注大鼠模型。
, 百拇医药
1.2 预处理方案 本实验共设5组(n=12)。假手术组(S组)：仅行假手术；缺血再灌注组(IR组)：肝脏持续缺血60 min，再灌注30 min；预处理组分为3个：在肝脏持续缺血之前分别进行5 min缺血及5 min的再灌注(PC5组)、10 min缺血及10 min的再灌注(PC10组)、15 min缺血及15 min的再灌注(PC15组)。各组在30 min再灌注完成时取右肝标本及下腔静脉血标本备用。
1.3 肝功能测定 谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)，采用全自动生化分析仪(西门子公司)测定。
1.4 抗氧化酶 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)和脂质过氧化产物(MDA)测定，按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测试。
1.5 形态学研究 将新鲜标本一部分用10%甲醛固定后送病理室行石蜡切片检查，另一部分切成1 cm×1 cm×1 cm用3%戊二醛液固定后送电镜室检查肝细胞超微结构。
, 百拇医药
1.6 统计学分析 全部数据以均数±标准差表示。两组间均数的比较用t检验；均数间的两两比较用q检验，全部资料采用SYSTAT软件在计算机上操作完成。
2 结 果
2.1 各组肝功能(AST、ALT、LDH )检测结果见表1。
表1 各组AST,ALT,LDH浓度(U/L) 分 组
AST
ALT
LDH
S组
38.33±8.38
129.00±13.07
, http://www.100md.com
1072.33±140.71
IR组
932.88±99.78☆
1951.04±146.46☆
2939.53±138.23☆
PC5组
503.70±105.73☆△
1172.69±134.75☆△
2390.86±230.27☆△
, http://www.100md.com
PC10组
835.94±65.04☆★△
1428.56±139.66☆★△
2710.60±109.53☆★△
PC15组
923.14±91.88☆★△
2472.08±321.80☆★△
3367.18±277.19☆★△
S组：假手术组； IR组：缺血再灌注组； PC组：缺血预处理组. AST：谷草转氨酶； ALT：谷丙转氨酶； LDH：乳酸脱氢酶. 与S组比较，☆：P<0.05； 与PC5组比较，★：P<0.05； 与IR组比较，△：P<0.05 (表2相同).
, 百拇医药
2.2 各组抗氧化酶活力(SOD、CAT、GSH-PX)见表2。
表2 各组抗氧化酶活力 分 组
SOD(U/L)
CAT(U/g)
GSH-PX(U/L)
S组
163.12±12.77
70.78±10.23
15.28±1.26
IR组
117.67±17.08☆
, http://www.100md.com
34.49±7.62☆
10.58±1.40☆
PC5组
152.59±12.14☆△
62.54±10.20☆△
13.68±1.37☆△
PC10组
110.53±15.97☆★△
44.12±7.22☆★△
, http://www.100md.com
9.90±1.62☆★△
PC15组
116.47±15.15☆★△
38.57±8.57☆★△
10.56±1.36☆★△
SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； GSH-PX：谷胱甘肽过氧化酶.
2.3 脂质过氧化物(MDA) PC5组(4.67±0.42 μmol/L)明显低于PC10组(5.02±0.58 μmol/L)、PC15组(5.33±0.47 μmol/L)和IR组(5.21±0.41 μmol/L)(P<0.05)。
, 百拇医药
2.4 形态学研究
光镜 IR组可见大片肝组织坏死，并见散在中性白细胞浸润，PC5组上述损伤最轻，PC10组次之，PC15组与IR组无区别。
电镜 IR组见肝细胞内线粒体高度肿胀，核膜破坏、中断，核均质化，提示肝细胞死亡；PC5组、PC10组线粒体肿胀、内质网扩张、核膜核仁无明显改变；PC15组与IR组相同。
3 讨 论
缺血预处理是由一个或几个短暂的缺血及再灌注过程产生的，这种短暂的缺血时间随器官而异[2]，心肌实验多采用3～5 min，脑一般为1～2 min，骨骼肌为5 min。短暂的缺血并不产生代谢产物堆积，也不会造成高能磷酸储备的减少[6,7]，但是，它能通过某种途径启动内源性的保护机制，从而减轻随后而来的较长时程的缺血损害。本实验发现3组不同时间的预处理对肝脏缺血再灌注损伤产生的作用也不一样，5 min的缺血预处理具有明显的保护作用，10 min者次之，15 min者不但没有保护作用反而加重了肝脏损害。这可能是由于随着缺血时间的延长，代谢产物堆积，造成组织细胞损伤，使内源性的保护机制不能启动。作者认为肝脏缺血预处理的时间以5 min为宜。
, 百拇医药
缺血预处理通过什么途径启动内源性保护机制尚未完全明确，目前认为与腺苷、蛋白激酶C、K-ATP通道有关[8]。肝组织缺血时产生大量的氧自由基，损害肝细胞，尤其是窦状隙内皮细胞，因为窦状隙内皮细胞缺乏丰富的抗氧化酶，更容易受到氧自由基的攻击[9]，而它受损后更进一步加重肝细胞损害[10]。实验证明，外源性抗氧化酶(SOD-POE)可以减轻肝脏缺血再灌注损伤[11]。本实验结果表明，经过5 min的缺血预处理的大鼠肝脏，其抗氧化酶的活力明显高于其他组，肝功能损害、病理改变均明显减轻。因此，作者认为缺血预处理可能通过增加内源性抗氧化酶活力而发挥其对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用，但是它经过什么途径增强抗氧化酶活力尚待进一步研究。最近有学者认为肝脏缺血预处理与热休克蛋白72(HSP72)有关[12]，该研究发现短暂的肝脏缺血能引起肝脏HSP72的合成增加，但是仍不能证明HSP72就是肝脏PC的启动因子。
作者简介：现在福建医科大学附属协和医院肝胆外科(福州 350001)
, 百拇医药
参考文献
[1]Murry CE,Jennings RB,Reimer KA. Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation,1986;74:1124
[2]Lawson CS,Downwy JM. Preconditioning : state of the art myocardial protection. Cardiovasc Res,1993;27:542
[3]Erxiong Lu,Shengxi Cheng,Guihu Li,et al. Preconditioning improves myocardial preservation in patients undergoing open heart operations.Ann Thorac Surg, 1997;64:1320
, 百拇医药
[4]Jaeschke H,Farhood A,Smith CW,et al. Neutrophils contribute to ischemia- reperfusion injury in rat liver in vivo.FASEB,1990;4:3355
[5]Metzger j,Dore SP,Lauterburg BH, et al. Oxidant stress during reperfusion of ischemic liver. Hepatology,1988;8:580
[6]Basuk CW. Effect of repetitive brief episodes of ischemia on cell volume,electrolytes,and ultrastructure. J Am Coll Cardiol, 1986;8:33
[7]Lang R, Ingwall JS,Hale SL,et al.Effect of recurrent ischemia on myocardial high energy phosphate content in canine hearts. Basic Res Cardiol, 1984;79:469
, http://www.100md.com
[8]Donna M,Van Winkle,Grace L,et al. Cardioprotection provided by adenosine receptor activatious is abolished by blockade of the KATP channel. Am J Physiol,1994;266:829
[9]Walsh TR. Lipid peroxidation is a nonparenchymal cell event with reperfusion after prolonged liver ischemia. J Surg Ros,1990;49:18
[10]Adkison D,Hollwarth ME, Benoit JN, et al. Role of free radicals in ischemia reperfusion injury to the liver. Acta Physiol Scand,1986;548:101
, http://www.100md.com
[11]Hiroyuki Kobayashi,Toshiaki Nonami,Tsuyoshi Kurokawa,et al. Role of endogenous nitric oxide in ischemia-reperfusion injury in rat liver. J Surg Res,1995;59:772
[12]Makoto Kume,Yuzo Yamamoto,Stefamo Saad,et al.Ischemic preconditioning of the liver in rats:Implications of heat shock protein induction to increase tolerance of ischemia-reperfusion injury. J Lab Clin Med,1996;128:251
(收稿：1998-11-29 修回：1998-12-25), 百拇医药
单位：关养时 吕新生 湖南医科大学附属湘雅医院普外科(长沙 410078)
关键词：肝缺血再灌注损伤；缺血预处理；大鼠
福建医科大学学报990107 目的 探讨缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。 方法 在大鼠肝脏持续60 min缺血及30 min再灌注之前，先进行5，10，15 min 的缺血及等长时间的再灌注。 于再灌注30 min完成时取标本测定肝功能、抗氧化酶、脂质过氧化物及形态学研究。 结果 持续60 min 缺血及30 min再灌注后，肝功能明显受损，抗氧化酶活力显著下降，肝组织大片坏死；5 min的缺血预处理能明显改善肝功能、提高抗氧化酶活力,减少肝细胞坏死；10 min效果次之；15 min反而加重肝脏损害。 结论 5 min的缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，它可能为肝脏缺血再灌注损伤的防治提供一种简单有效的新方法。
, http://www.100md.com
Protective Effect of Ischemic Preconditioning on Ischemic Reperfusion Injury of Liver
Guan Yangshi, Lu Xinsheng
(Department of General Surgery, Xiangya Hospital,Affiliated to Hunan Medical University , Changsha, 410078)
Objective To study the protective effect of ischemic preconditioning(PC) on ischemia-reperfusion injury of liver. Methods Liver of the rat was subjected to prolonged 90 min ischemia and 30 min reperfusion preceded by 5,10,15min ischemic periods and reperfusion periods. The samples for studing liver function,antioxidant enzymes, product of lipid peroxidant were gained at the time when 30 min reperfusion was completed. Results After 90 min ischemia and 30 min reperfusion,the values of AST,ALT,LDH were markedly inereased,the activites of antioxidant enzymes were significant decreased, and patch necrosis of hepatocytes could be seen microscopically; 5 min preconditioning markedly improved liver function,increased the activites of antioxidant enzymes and reduced necrosis of hepatocytes;the effect of 10 min preconditioning takes the second place;15 min preconditioning made the damages of liver heavier. Conclusion 5 min preconditioning can protect the rat liver from ischemia-reperfusion injury and it may provide a simple, effecteve, new method for the treatment and prevention of ischemia-reperfusion injury in liver.
, 百拇医药
Key words liver ischemia-reperfusion injury; ischemic preconditioning; rat
1986年，Murry等[1]在研究狗心缺血再灌注损伤时发现，多次短暂的阻断冠脉，对心肌并没有产生积累性损伤，反而提高了心肌对随后而来的较长时程缺血的耐受力，他们称这一现象为缺血预处理(PC)。此后，许多作者相继在多种动物模型上证实了缺血预处理的心肌保护作用，效果肯定[2]，并已应用到临床心脏手术[3]。本实验观察不同时间的缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响，旨在探讨缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤是否具有保护作用，同时寻找适合的预处理时间，并探讨其机制。
1 材料与方法
1.1 动物模型 雄性SD大鼠60只，体重180～220 g，参照Jaeschke和Metzger法[4,5]制备成右肝全部缺血、左肝部分缺血后再灌注大鼠模型。
, 百拇医药
1.2 预处理方案 本实验共设5组(n=12)。假手术组(S组)：仅行假手术；缺血再灌注组(IR组)：肝脏持续缺血60 min，再灌注30 min；预处理组分为3个：在肝脏持续缺血之前分别进行5 min缺血及5 min的再灌注(PC5组)、10 min缺血及10 min的再灌注(PC10组)、15 min缺血及15 min的再灌注(PC15组)。各组在30 min再灌注完成时取右肝标本及下腔静脉血标本备用。
1.3 肝功能测定 谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)，采用全自动生化分析仪(西门子公司)测定。
1.4 抗氧化酶 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)和脂质过氧化产物(MDA)测定，按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测试。
1.5 形态学研究 将新鲜标本一部分用10%甲醛固定后送病理室行石蜡切片检查，另一部分切成1 cm×1 cm×1 cm用3%戊二醛液固定后送电镜室检查肝细胞超微结构。
, 百拇医药
1.6 统计学分析 全部数据以均数±标准差表示。两组间均数的比较用t检验；均数间的两两比较用q检验，全部资料采用SYSTAT软件在计算机上操作完成。
2 结 果
2.1 各组肝功能(AST、ALT、LDH )检测结果见表1。
表1 各组AST,ALT,LDH浓度(U/L) 分 组
AST
ALT
LDH
S组
38.33±8.38
129.00±13.07
, http://www.100md.com
1072.33±140.71
IR组
932.88±99.78☆
1951.04±146.46☆
2939.53±138.23☆
PC5组
503.70±105.73☆△
1172.69±134.75☆△
2390.86±230.27☆△
, http://www.100md.com
PC10组
835.94±65.04☆★△
1428.56±139.66☆★△
2710.60±109.53☆★△
PC15组
923.14±91.88☆★△
2472.08±321.80☆★△
3367.18±277.19☆★△
S组：假手术组； IR组：缺血再灌注组； PC组：缺血预处理组. AST：谷草转氨酶； ALT：谷丙转氨酶； LDH：乳酸脱氢酶. 与S组比较，☆：P<0.05； 与PC5组比较，★：P<0.05； 与IR组比较，△：P<0.05 (表2相同).
, 百拇医药
2.2 各组抗氧化酶活力(SOD、CAT、GSH-PX)见表2。
表2 各组抗氧化酶活力 分 组
SOD(U/L)
CAT(U/g)
GSH-PX(U/L)
S组
163.12±12.77
70.78±10.23
15.28±1.26
IR组
117.67±17.08☆
, http://www.100md.com
34.49±7.62☆
10.58±1.40☆
PC5组
152.59±12.14☆△
62.54±10.20☆△
13.68±1.37☆△
PC10组
110.53±15.97☆★△
44.12±7.22☆★△
, http://www.100md.com
9.90±1.62☆★△
PC15组
116.47±15.15☆★△
38.57±8.57☆★△
10.56±1.36☆★△
SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； GSH-PX：谷胱甘肽过氧化酶.
2.3 脂质过氧化物(MDA) PC5组(4.67±0.42 μmol/L)明显低于PC10组(5.02±0.58 μmol/L)、PC15组(5.33±0.47 μmol/L)和IR组(5.21±0.41 μmol/L)(P<0.05)。
, 百拇医药
2.4 形态学研究
光镜 IR组可见大片肝组织坏死，并见散在中性白细胞浸润，PC5组上述损伤最轻，PC10组次之，PC15组与IR组无区别。
电镜 IR组见肝细胞内线粒体高度肿胀，核膜破坏、中断，核均质化，提示肝细胞死亡；PC5组、PC10组线粒体肿胀、内质网扩张、核膜核仁无明显改变；PC15组与IR组相同。
3 讨 论
缺血预处理是由一个或几个短暂的缺血及再灌注过程产生的，这种短暂的缺血时间随器官而异[2]，心肌实验多采用3～5 min，脑一般为1～2 min，骨骼肌为5 min。短暂的缺血并不产生代谢产物堆积，也不会造成高能磷酸储备的减少[6,7]，但是，它能通过某种途径启动内源性的保护机制，从而减轻随后而来的较长时程的缺血损害。本实验发现3组不同时间的预处理对肝脏缺血再灌注损伤产生的作用也不一样，5 min的缺血预处理具有明显的保护作用，10 min者次之，15 min者不但没有保护作用反而加重了肝脏损害。这可能是由于随着缺血时间的延长，代谢产物堆积，造成组织细胞损伤，使内源性的保护机制不能启动。作者认为肝脏缺血预处理的时间以5 min为宜。
, 百拇医药
缺血预处理通过什么途径启动内源性保护机制尚未完全明确，目前认为与腺苷、蛋白激酶C、K-ATP通道有关[8]。肝组织缺血时产生大量的氧自由基，损害肝细胞，尤其是窦状隙内皮细胞，因为窦状隙内皮细胞缺乏丰富的抗氧化酶，更容易受到氧自由基的攻击[9]，而它受损后更进一步加重肝细胞损害[10]。实验证明，外源性抗氧化酶(SOD-POE)可以减轻肝脏缺血再灌注损伤[11]。本实验结果表明，经过5 min的缺血预处理的大鼠肝脏，其抗氧化酶的活力明显高于其他组，肝功能损害、病理改变均明显减轻。因此，作者认为缺血预处理可能通过增加内源性抗氧化酶活力而发挥其对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用，但是它经过什么途径增强抗氧化酶活力尚待进一步研究。最近有学者认为肝脏缺血预处理与热休克蛋白72(HSP72)有关[12]，该研究发现短暂的肝脏缺血能引起肝脏HSP72的合成增加，但是仍不能证明HSP72就是肝脏PC的启动因子。
作者简介：现在福建医科大学附属协和医院肝胆外科(福州 350001)
, 百拇医药
参考文献
[1]Murry CE,Jennings RB,Reimer KA. Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation,1986;74:1124
[2]Lawson CS,Downwy JM. Preconditioning : state of the art myocardial protection. Cardiovasc Res,1993;27:542
[3]Erxiong Lu,Shengxi Cheng,Guihu Li,et al. Preconditioning improves myocardial preservation in patients undergoing open heart operations.Ann Thorac Surg, 1997;64:1320
, 百拇医药
[4]Jaeschke H,Farhood A,Smith CW,et al. Neutrophils contribute to ischemia- reperfusion injury in rat liver in vivo.FASEB,1990;4:3355
[5]Metzger j,Dore SP,Lauterburg BH, et al. Oxidant stress during reperfusion of ischemic liver. Hepatology,1988;8:580
[6]Basuk CW. Effect of repetitive brief episodes of ischemia on cell volume,electrolytes,and ultrastructure. J Am Coll Cardiol, 1986;8:33
[7]Lang R, Ingwall JS,Hale SL,et al.Effect of recurrent ischemia on myocardial high energy phosphate content in canine hearts. Basic Res Cardiol, 1984;79:469
, http://www.100md.com
[8]Donna M,Van Winkle,Grace L,et al. Cardioprotection provided by adenosine receptor activatious is abolished by blockade of the KATP channel. Am J Physiol,1994;266:829
[9]Walsh TR. Lipid peroxidation is a nonparenchymal cell event with reperfusion after prolonged liver ischemia. J Surg Ros,1990;49:18
[10]Adkison D,Hollwarth ME, Benoit JN, et al. Role of free radicals in ischemia reperfusion injury to the liver. Acta Physiol Scand,1986;548:101
, http://www.100md.com
[11]Hiroyuki Kobayashi,Toshiaki Nonami,Tsuyoshi Kurokawa,et al. Role of endogenous nitric oxide in ischemia-reperfusion injury in rat liver. J Surg Res,1995;59:772
[12]Makoto Kume,Yuzo Yamamoto,Stefamo Saad,et al.Ischemic preconditioning of the liver in rats:Implications of heat shock protein induction to increase tolerance of ischemia-reperfusion injury. J Lab Clin Med,1996;128:251
(收稿：1998-11-29 修回：1998-12-25), 百拇医药