吸水链霉菌FC904(Streptomyces hygroscopicusFC904)原生质体形成及释放的观察
作者：强 华 陈文列 钟秀容 王耿夏
单位：福建医科大学(福州 350004)强 华 王耿夏 微生物学教研室； 陈文列 钟秀容 电子显微镜室
关键词：Streptomyces hygroscopicus FC904；原生质体；形态学；超微结构
福建医科大学学报990103 目的 观察吸水链霉菌FC904(S.hygroscopicus FC904)原生质体的形成及释放过程。 方法 用溶菌酶处理S.hygroscopicus FC904的菌丝体，取不同酶解时间的标本进行光镜及电镜观察。 结果 S.hygroscopicus FC904原生质体的形成及释放过程为菌丝体细胞膜内陷、收缩、分段，进而质壁分离，在菌丝体内形成多个原生质体，并以两种形式释放出原生质体,(1)从细胞壁开口处挤出，(2)为细胞壁消解，原生质体“就地”释放。 结论 S.hygroscopicus FC904原生质体的形成及释放过程已明确。
, 百拇医药
Observations on the Formation and Release of
the Protoplasts from Streptomyces hygroscopicus FC904
Qiang Hua1， Chen Wenlie2， Zhong Xiurong2， et al
(1.Departement of Microbiology, 2.Laboratory of Electron Microscopy, Fujian Medical University, Fuzhou, 350004)
Objective To observe how the protoplasts of S.hygroscopicus FC904 are formed and released. Methods The mycelia of S.hygroscopicus FC904 were treated with lysozyme and samples gathered at different stages of the enzyme lysis were observed by light microscope and electron microscope. Results The forming and the releasing process of the protoplasts from S.hygroscopicus FC904 was described as follows: the cell membrane of mycelia was sunk、 contracted and broken, and then plasmolysis happens; several protoplasts were formed in mycelia. The protoplasts were released in two ways: protoplasts emerged from the pores in cell walls, or protoplasts formed in situ when cell walls were digested. Conclusion The forming and the releasing process of the protoplasts from S.hygroscopicus FC904 has been shown.
, 百拇医药
Key words Streptomyces hygroscopicus FC904; protoplast; morphology; ultrastructure
S.hygroscopicus FC904是福建省微生物研究所分离的能产生雷帕霉素的吸水链霉菌。本文应用光镜结合电镜观察该吸水链霉菌原生质体形成及释放的全过程。
1 材料与方法
1.1 菌株 S.hygroscopicus FC904 (福建省微生物研究所提供)。
1.2 菌丝体培养基 葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，K2HPO4.3H2O，MgSO4.7H2O。
, 百拇医药
1.3 主要试剂 甘氨酸(上海新华化工厂)、溶菌酶(上海伯奥生物科技公司)、原生质体缓冲液(P缓冲液)按文献[1]配制。3%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定液，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾固定液，环氧树脂618，醋酸铀，柠檬酸铅等。
1.4 原生质体制备及光学显微镜观察
在菌丝体生长培养基中添加10%灭菌蔗糖及0.7%甘氨酸，移种入孢子斜面培养物，于26℃振荡培养(200 r/min)42～46 h。离心收集菌丝体，用P缓冲液洗涤菌丝体两遍,每遍离心10 min(3000 r/min)，弃上清液。每毫升压积菌丝体加入P缓冲液5 ml悬浮；加入溶菌酶(P缓冲液配制，25 nm纤维微孔滤膜过滤,终浓度2 mg/ml), 30～37℃作用60 min，其间每隔15 min用无菌吸管吹打以利原生质体释放,取样。用相差显微镜观察原生质体形成及释放情况并摄影。
1.5 电子显微镜观察
, 百拇医药
分别取酶解30 min及60 min的菌丝体液，离心成团。用3%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定液前固定，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定，乙醇-丙酮脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，透射电镜观察、摄影。
2 结 果
2.1 光镜观察
菊花状的菌丝体由紧密团结转为松散。最初菌丝体顶端膨大，形成一个小球体，内容物自尖端孔中伸出，并逐渐脱离菌丝体。也可观察到菌丝体内分隔间的内容物膨大而成“四季豆”状，原生质体在菌丝体中部从被酶解的细胞壁孔隙中挤出。随着酶解时间延长，菌丝体成片段后还可通过菌丝壁消解的方式，“就地”形成圆形或椭圆形的球状原生质体，从而可见到成串或成堆的原生质体(图1)，隐约显示菌丝体的形状。释放后的原生质体逐渐出现聚集现象。镜下可见成簇的原生质体随液体“浮萍”般移动(图2)。
, 百拇医药
图1 成串或成堆的原生质体 ×800
图2 原生质体聚集 ×1000
2.2 电镜观察
酶解30 min标本的超薄切片中，切面呈长或短的杆状菌体较多见，且有细胞壁(图3)。可见到分枝状菌丝体内细胞膜内陷、收缩、分段(图4)，进而质壁分离，形成多个子细胞(图
5)。有的子细胞间隙间的菌丝壁模糊，逐渐断裂为小片段，有的则为整条菌丝壁消失，还有个别原生质体内含多个细胞核(图6)。酶解60 min标本的超薄切片中，切面呈圆或椭圆形的菌体多见，原核细胞结构，胞质内富含核糖体，可见拟核且无细胞壁(图7)，或残留部分细胞壁(图8)。
, 百拇医药
图3 菌丝的纵切与横切面可见细胞壁 ×14400 图4 菌丝体内细胞膜内陷、收缩、分段 ×50600 图5 菌丝内形成多个子细胞，出现质壁分离 ×29150 图6 A：子细胞间隙间的菌丝壁模糊
B：菌丝壁完全消失，内含多个细胞核 ×18000 图7 原生质体无细胞壁 ×30750 图8 原生质体残留部分卷曲的细胞壁 ×60000
3 讨 论
原生质体无细胞壁，有利于分子生物学的研究。原生质体的形成早有报道[2.3]，但多为原生质体的制备过程及原生质体的基本形态。有关原生质体形成、释放过程的显微或超微特征的报道甚少。本文应用光镜结合电镜观察吸水链霉菌FC904原生质体的形成及释放过程，表现为菌丝体内细胞膜内陷、收缩、分段，进而质壁分离，逐渐形成多个原生质体，并以两种形式释放出原生质体，一是从菌丝壁开口处挤出，另一为菌丝壁消解，原生质体“就地”释放，通过后一种方式释放的原生质体可能连有细胞壁残丝。本文还观察到由这种方式形成的原生质体有的内含多个细胞核，因而其再生后的细胞就有可能成为异核体，不利于诱变育种。
, 百拇医药
原生质体形成过程中出现的质壁分离，可能是原生质体脱水的结果。质膜与细胞壁的某些氢键等弱的化学键力被破坏，原生质体受到的束缚力减少，从而可以从细胞壁裂口处释放出来
[4]。
参考文献
[1]邓子新，唐纪良. 链霉菌遗传操作手册. 长沙: 湖南科学技术出版社,1988:173
[2]赵 敏，谢风龙. 小诺霉素产生菌棘孢小单孢菌原生质体形成、再生及融合的研究. 中国抗生素杂志，1995;20:10
[3]韩 黎,陈世平,索继红.微小根毛霉致病株的原生质体形成条件. 微生物学通报,1998;25:27
[4]洪益国,郑幼霞. 电镜观察棒状杆菌菌体及其原生质体. 微生物学报, 1990;30:475
(收稿：1998-10-15 修回：1998-12-22), http://www.100md.com
单位：福建医科大学(福州 350004)强 华 王耿夏 微生物学教研室； 陈文列 钟秀容 电子显微镜室
关键词：Streptomyces hygroscopicus FC904；原生质体；形态学；超微结构
福建医科大学学报990103 目的 观察吸水链霉菌FC904(S.hygroscopicus FC904)原生质体的形成及释放过程。 方法 用溶菌酶处理S.hygroscopicus FC904的菌丝体，取不同酶解时间的标本进行光镜及电镜观察。 结果 S.hygroscopicus FC904原生质体的形成及释放过程为菌丝体细胞膜内陷、收缩、分段，进而质壁分离，在菌丝体内形成多个原生质体，并以两种形式释放出原生质体,(1)从细胞壁开口处挤出，(2)为细胞壁消解，原生质体“就地”释放。 结论 S.hygroscopicus FC904原生质体的形成及释放过程已明确。
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Observations on the Formation and Release of
the Protoplasts from Streptomyces hygroscopicus FC904
Qiang Hua1， Chen Wenlie2， Zhong Xiurong2， et al
(1.Departement of Microbiology, 2.Laboratory of Electron Microscopy, Fujian Medical University, Fuzhou, 350004)
Objective To observe how the protoplasts of S.hygroscopicus FC904 are formed and released. Methods The mycelia of S.hygroscopicus FC904 were treated with lysozyme and samples gathered at different stages of the enzyme lysis were observed by light microscope and electron microscope. Results The forming and the releasing process of the protoplasts from S.hygroscopicus FC904 was described as follows: the cell membrane of mycelia was sunk、 contracted and broken, and then plasmolysis happens; several protoplasts were formed in mycelia. The protoplasts were released in two ways: protoplasts emerged from the pores in cell walls, or protoplasts formed in situ when cell walls were digested. Conclusion The forming and the releasing process of the protoplasts from S.hygroscopicus FC904 has been shown.
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Key words Streptomyces hygroscopicus FC904; protoplast; morphology; ultrastructure
S.hygroscopicus FC904是福建省微生物研究所分离的能产生雷帕霉素的吸水链霉菌。本文应用光镜结合电镜观察该吸水链霉菌原生质体形成及释放的全过程。
1 材料与方法
1.1 菌株 S.hygroscopicus FC904 (福建省微生物研究所提供)。
1.2 菌丝体培养基 葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，K2HPO4.3H2O，MgSO4.7H2O。
, 百拇医药
1.3 主要试剂 甘氨酸(上海新华化工厂)、溶菌酶(上海伯奥生物科技公司)、原生质体缓冲液(P缓冲液)按文献[1]配制。3%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定液，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾固定液，环氧树脂618，醋酸铀，柠檬酸铅等。
1.4 原生质体制备及光学显微镜观察
在菌丝体生长培养基中添加10%灭菌蔗糖及0.7%甘氨酸，移种入孢子斜面培养物，于26℃振荡培养(200 r/min)42～46 h。离心收集菌丝体，用P缓冲液洗涤菌丝体两遍,每遍离心10 min(3000 r/min)，弃上清液。每毫升压积菌丝体加入P缓冲液5 ml悬浮；加入溶菌酶(P缓冲液配制，25 nm纤维微孔滤膜过滤,终浓度2 mg/ml), 30～37℃作用60 min，其间每隔15 min用无菌吸管吹打以利原生质体释放,取样。用相差显微镜观察原生质体形成及释放情况并摄影。
1.5 电子显微镜观察
, 百拇医药
分别取酶解30 min及60 min的菌丝体液，离心成团。用3%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定液前固定，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定，乙醇-丙酮脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，透射电镜观察、摄影。
2 结 果
2.1 光镜观察
菊花状的菌丝体由紧密团结转为松散。最初菌丝体顶端膨大，形成一个小球体，内容物自尖端孔中伸出，并逐渐脱离菌丝体。也可观察到菌丝体内分隔间的内容物膨大而成“四季豆”状，原生质体在菌丝体中部从被酶解的细胞壁孔隙中挤出。随着酶解时间延长，菌丝体成片段后还可通过菌丝壁消解的方式，“就地”形成圆形或椭圆形的球状原生质体，从而可见到成串或成堆的原生质体(图1)，隐约显示菌丝体的形状。释放后的原生质体逐渐出现聚集现象。镜下可见成簇的原生质体随液体“浮萍”般移动(图2)。
, 百拇医药
图1 成串或成堆的原生质体 ×800
图2 原生质体聚集 ×1000
2.2 电镜观察
酶解30 min标本的超薄切片中，切面呈长或短的杆状菌体较多见，且有细胞壁(图3)。可见到分枝状菌丝体内细胞膜内陷、收缩、分段(图4)，进而质壁分离，形成多个子细胞(图
5)。有的子细胞间隙间的菌丝壁模糊，逐渐断裂为小片段，有的则为整条菌丝壁消失，还有个别原生质体内含多个细胞核(图6)。酶解60 min标本的超薄切片中，切面呈圆或椭圆形的菌体多见，原核细胞结构，胞质内富含核糖体，可见拟核且无细胞壁(图7)，或残留部分细胞壁(图8)。
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图3 菌丝的纵切与横切面可见细胞壁 ×14400 图4 菌丝体内细胞膜内陷、收缩、分段 ×50600 图5 菌丝内形成多个子细胞，出现质壁分离 ×29150 图6 A：子细胞间隙间的菌丝壁模糊
B：菌丝壁完全消失，内含多个细胞核 ×18000 图7 原生质体无细胞壁 ×30750 图8 原生质体残留部分卷曲的细胞壁 ×60000
3 讨 论
原生质体无细胞壁，有利于分子生物学的研究。原生质体的形成早有报道[2.3]，但多为原生质体的制备过程及原生质体的基本形态。有关原生质体形成、释放过程的显微或超微特征的报道甚少。本文应用光镜结合电镜观察吸水链霉菌FC904原生质体的形成及释放过程，表现为菌丝体内细胞膜内陷、收缩、分段，进而质壁分离，逐渐形成多个原生质体，并以两种形式释放出原生质体，一是从菌丝壁开口处挤出，另一为菌丝壁消解，原生质体“就地”释放，通过后一种方式释放的原生质体可能连有细胞壁残丝。本文还观察到由这种方式形成的原生质体有的内含多个细胞核，因而其再生后的细胞就有可能成为异核体，不利于诱变育种。
, 百拇医药
原生质体形成过程中出现的质壁分离，可能是原生质体脱水的结果。质膜与细胞壁的某些氢键等弱的化学键力被破坏，原生质体受到的束缚力减少，从而可以从细胞壁裂口处释放出来
[4]。
参考文献
[1]邓子新，唐纪良. 链霉菌遗传操作手册. 长沙: 湖南科学技术出版社,1988:173
[2]赵 敏，谢风龙. 小诺霉素产生菌棘孢小单孢菌原生质体形成、再生及融合的研究. 中国抗生素杂志，1995;20:10
[3]韩 黎,陈世平,索继红.微小根毛霉致病株的原生质体形成条件. 微生物学通报,1998;25:27
[4]洪益国,郑幼霞. 电镜观察棒状杆菌菌体及其原生质体. 微生物学报, 1990;30:475
(收稿：1998-10-15 修回：1998-12-22), http://www.100md.com