脊神经节损伤介导的脊髓背角EAAs和IAAs变化的实验研究
作者：周 跃 刘正津 梅芳瑞 廖维宏
单位：周 跃 梅芳瑞 第三军医大学新桥医院骨科 400037；刘正津 第三军医大学解剖教研室；廖维宏 第三军医大学野战外科研究所
关键词：脊神经节；脊髓背角；兴奋性氨基酸；抑制性氨基酸
脊神经节损伤介导的脊髓背角EAAs 和IAAs变化的实验研究 摘要 目的：研究脊神经节(DRG)炎性损伤时，脊髓背角兴奋性氨基酸(EAAs)、抑制性氨基酸(IAAs)含量和脊髓背角谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)免疫组织化学的变化，及其与实验动物神经行为异常变化之间的关系。方法：健康家兔54只，随机分为手术对照组(n=24)；炎症损伤组(n=24)和正常对照组(n=6)。采用组织氨基酸的含量分析仪测定脊髓背角Glu、Asp、γ-氨基丁酸(GABA)、牛磺酸(Tau)、苏氨酸(Thr)和色氨酸(Ser)含量，采用免疫组化法观察脊髓背角Glu和Asp分布特点及变化。结果：DRG炎症损伤介导脊髓背角EAAs和IAAs释放增加。结论：EAAs在痛觉过敏的形成和维持中具有重要作用，而IAAs的增加则与机体抗伤害性保护反应相关。DRG炎症损伤初期，脊髓背角EAAs/IAAs动态平衡的破坏是伤害性神经细胞兴奋性损伤和伤侧肢体痛觉过敏的主要原因。
, http://www.100md.com
The experimental study of the EAAs and IAAs contents changes in the dorsal horn of spinal cord induced by DRG injury
ZHOU Yue,LIU Zhengjin,MEI Fangrui,et al//Chinese Journal of Spine and Spinal Cord,1998,8(6):23～27
Abstract Objective:To study the alternations of excitatory amino acids(EAAs),inhibitory amino acids(IAAs) contents and the distribution properties of Glu,Asp immunoreactivity in the dorsal horn of spinal cord.In addition,the relations between the abnormal neuro-behavior and the changes induced by inflammatory reaction of DRG would be investigated.Method:Fifty-four health rabbits were divided into three groups:sham-operative(n=24),inflammatory injury(n=24) and control group(n=6).The tissue content of EAAs(Glu,Asp),IAAs(GABA,Tau) and neutral amino acids(Ser,Thr) were determined in the dorsal horn of spinal cord (SDH).The distribution features of Glu and Asp were also studied by immunohistochemical analyse.Result:The EAAs and IAAs increased greatly induced by DRG inflammatory injury.Conclusion:The increase of EAAs release in SDH induced by inflammatory irritation played an important role in promoting and maintaining hyperalgesia, but increase of IAAs release is mainly related to protective mechanism. The balance of EAAs/IAAs destroyed by inflammatory injury of DRG was a main factor of the hyperexcitotoxicity injury of nociceptive neurons and hyperalgesia development.
, 百拇医药
Authors address Department of Orthopedics,Second Affiliated Hospital, Third Military Medical University,Chongqing,400037
Key words Dorsal root ganglia Dorsal horn of spinal cord Excitatory amino acids Inhibitory amino acids
本实验是观察观察脊神经节(DRG)炎性损伤时脊髓背角兴奋性氨基酸(EAAs)、抑制性氨基酸(IAAs)含量和脊髓背角谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)及其N-甲基门冬氨酸受体(NMDAr)免疫组织化学的变化规律，以及与动物神经行为异常改变之间的关系。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 动物及分组
健康家兔54只，雌雄不拘。体重2.0～3.1kg。实验分为3组：手术对照组(A组)，n=24；炎性损伤组(B组)，n=24；正常对照组(C组)，n=6。C组标本测定结果作为损伤前的正常参考值。
1.2 模型制作
3%戊巴比妥钠(0.5～1.0ml/kg)耳静脉麻醉，常规消毒铺无菌巾。腰骶部后正中切口，咬除L5～L7棘突和椎板，手术显微镜下仔细显露双侧L4～L6脊神经节(DRG4、5、6)。左侧作为损伤侧，右侧作为非损伤侧。B组采用4-0铬制肠线，剪成0.5cm长，取4～6条沿左侧DRG4、5、6周围纵轴排列放置，并用无菌手术骨蜡固定在DRG4、5、6周围，1～2层明胶海绵覆盖在硬脊膜表面，缝合伤口，送动物室饲养。A组的手术显露、明胶海绵覆盖和术后处理同B组一样。A组和B组右侧的DRG4、5、6作为自身对照组。
, 百拇医药
1.3 神经行为测定
按照 Kawakami法〔1〕进行测定。将测试动物放置在特制固定架中，待动物安静后，作神经行为测试，分别在术前1周，术后1、2、4、8周进行。
1.4 运动功能
采用记分制，正常步态，足无畸形为1分；正常步态伴明显足畸形为2分；轻度步态障碍伴足下垂为3分，严重步态障碍伴肌无力为4分。
1.5 脊髓背侧EAAs和IAAs含量测定
颈动脉放血处死动物，迅速显露L4～L6脊神经节段脊髓并取材，将标本放置在冰盆中，手术显微镜下，首先沿冠状面经中央导水管将脊髓等分为前后各半侧，然后将后半侧脊髓沿正中矢状径再等分为左右半侧，分别精确称湿重后将标本置于冰镇玻璃试管中，按每100mg组织湿重3ml的比例加入4℃的10%磺基水杨酸，在冰浴下用内切式匀浆机制备组织匀浆。然后用高速低温离心机(14 000r/min)离心20min，取上清液1ml。样品用柠檬酸锂缓冲液稀释。采用6300黄金系列氨基酸自动分析仪(Beckman分别检测Glu、Asp、γ-氨基丁酸(GABA)、牛磺酸(Tau)、苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)。结果以nmol/mg表示。
, 百拇医药
1.6 Glu、Asp和NMDAr免疫组化观察
动物麻醉后迅速开胸，升主动脉插管，用生理盐水和4%多聚甲醛磷酸缓冲液灌注，取材固定，冰冻切片。首先经0.3% Triton X-100室温孵育，3%过氧化氢甲醇液封闭内源性过氧化物酶，再经10%正常山羊血清孵育以降低非特异性染色，然后加入兔抗Glu血清(1∶5000，Sigma)、兔抗Asp血清(1∶5000，Sigma)和兔抗NMDAr(1∶4000，Donated by Hama AT,Illinois University,USA),孵育48h(4℃)。随后依次加入生物素标记羊抗兔IgG血清(1∶300)，37℃孵育3～4h，PBS漂洗后再置入HRP标记的链霉卵白素液(1∶100)中，37℃孵育1～2h，最后用DAB-GOD显色，其反应物呈紫黑色。显色后常规封片镜检。
1.7 C-fos/Glu和Asp免疫双染色
用C-fos抗血清(1∶2000)作用后切片再分别置入兔抗Glu血清(1∶5000，Sigma)和兔抗Asp血清中(1∶5000，Sigma)孵育。其后操作步骤同上述。C-fos样免疫反应作阳性细胞计数，Glu或Asp样免疫反应采用图像分析仪进行灰度扫描记录，并作比对分析。
, 百拇医药
1.8 数据统计
均在486/DX266型微机上，采用Microsoft Excel 5.0的统计程序，行样本单因素和多因素方差分析，显著性t检验，结果以均数±标准差表示。
2 实验结果
2.1 脊髓背侧EAAs含量变化(表1)
(1)A组Glu和Asp术前与术后、伤侧与非伤侧比较无显著性变化(P>0.05)。(2)B组术后2周，伤侧的Glu和Asp含量较术前、非伤侧较A组伤侧显著增高(P<0.05)。结果表明，手术本身对脊髓背侧EAAs含量无显著影响，但术后1～2周时DRG炎性损伤却能显著增加脊髓背侧EAAs含量。
表1 手术前后脊髓背角Glu和Asp含量 (
±s) (nmol/mg)
, 百拇医药
A组
B组
损伤侧
非损伤侧
损伤侧
非损伤侧
术前
Glu
Asp
3.426±0.66
2.382±0.13
3.098±0.58
2.603±0.41
, 百拇医药
3.426±0.66
2.382±0.13
3.098±0.58
2.603±0.41
术后1周
Glu
Asp
3.037±1.03
2.249±0.36
3.243±0.98
2.633±0.54
3.967±0.75
, http://www.100md.com
3.867±0.33
3.612±0.86
2.395±0.31
术后2周
Glu
Asp
2.949±0.85
3.011±0.52
3.004±0.54
2.938±0.38
5.849±1.04①②③
, http://www.100md.com 4.667±0.25①②③
3.026±0.53
2.934±0.22
术后4周
Glu
Asp
3.354±0.73
2.978±0.46
2.926±0.39
3.003±0.29
3.078±0.77
3.068±0.45
, 百拇医药
3.293±0.46
2.726±0.27
术后8周
Glu
Asp
3.146±0.57
2.588±0.39
3.113±0.85
3.015±0.32
3.645±0.65
3.118±0.47
3.167±0.37
, 百拇医药
3.012±0.18
注：①与术前相比，P<0.05，②与非损伤侧比较，P<0.05，③与A组相比，P<0.05
2.2 脊髓背侧IAAs含量变化(表2)
(1)A组GABA、Tau和Ser术前与术后、伤侧与非伤侧比较无显著变化(P>0.05)。B组术后2～4周伤侧的GABA和Tau、术后4～8周伤侧的Ser含量较术前和非伤侧显著增加(P<0.05)。 表2 手术前后脊髓背角GABA、Tau和Ser含量 (
±s) (nmol/mg)
A组
B组
, 百拇医药
损伤侧
非损伤侧
损伤侧
非损伤侧
术前
GABA
Tau
Ser
0.329±0.14
0.875±0.24
0.306±0.12
0.313±0.16
0.857±0.19
, http://www.100md.com
0.314±0.09
0.329±0.14
0.875±0.24
0.306±0.12
0.313±0.11
0.857±0.19
0.314±0.09
术后1周
GABA
Tau
Ser
0.338±0.21
, 百拇医药
0.998±0.26
0.293±0.06
0.297±0.12
0.839±0.31
0.327±0.10
0.423±0.20
0.701±0.19
0.315±0.11
0.387±0.24
0.917±0.24
0.303±0.06
, 百拇医药
术后2周
GABA
Tau
Ser
0.304±0.11
1.214±0.37
0.327±0.13
0.343±0.17
1.386±0.41
0.315±0.08
0.678±0.15①②③
2.523±0.36②④
, 百拇医药
0.292±0.13
0.335±0.09
1.002±0.29
0.325±0.16
术后4周
GABA
Tau
Ser
0.325±0.09
1.306±0.34
0.361±0.22
0.338±024
, 百拇医药
1.335±0.23
0.288±0.11
0.584±0.22①②③
1.814±0.16①②
0.541±0.25①
0.320±0.15
0.898±0.35
0.350±0.14
术后8周
GABA
Tau
, http://www.100md.com
Ser
0.365±0.22
1.178±0.33
0.334±0.14
0.328±0.11
1.005±0.18
0.302±0.09
0.371±0.18
0.663±0.21
0.729±0.10①②③
0.308±0.17
, http://www.100md.com
1.010±0.31
0.331±0.17
注：①与术前相比，P<0.05，②与非损伤侧比较，P<0.05，③与A组相比，P<0.05，④与术前相比P<0.01
2.3 脊髓背角Glu-LI和Asp-LI免疫反应(表3)
A组术前与术后、伤侧与非伤侧比较，脊髓背角Glu-LI和Asp-LI免疫反应灰阶度值无显著差异(P>0.05)。B组术后伤侧Glu和Asp(图1，插Ⅳ)样免疫反应较术前和非伤侧显著性增高(P<0.05)，尤以术后2周增高最显著(P<0.01)。Glu和Asp样阳性免疫反应纤维主要位于伤侧脊髓背角浅层(Ⅰ、Ⅱ层)和固有层(Ⅲ、Ⅳ层)。
, 百拇医药
图1 DRG炎性损伤2周，伤侧(A)和非伤侧(B)脊髓背角浅层Glu-LI样免疫反应(×200)
表3 脊髓背角Glu和Asp免疫组化表现 (
±s)
A组
B组
损伤侧
非损伤侧
损伤侧
非损伤侧
术前
, 百拇医药
Glu
Asp
42.7±9.1
36.5±7.6
40.3±10.2
32.4±8.1
42.7±9.1
36.5±7.6
40.3±10.2
32.4±8.1
术后1周
Glu
, 百拇医药
Asp
43.7±13.4
40.3±11.2
38.2±12.1
36.9±7.3
56.6±10.3
56.6±13.8②③④
47.8±13.2
33.7±6.3
术后2周
Glu
Asp
, 百拇医药
44.6±11.5
43.6±12.7
36.5±7.6
35.1±10.7
74.2±14.3①②③
49.7±7.3④
52.7±10.4
37.8±11.2
术后4周
Glu
Asp
, http://www.100md.com 48.8±10.9
39.3±8.6
41.8±14.6
30.1±7.8
68.6±15.1②③④
31.9±10.2
50.3±11.7
37.4±9.5
术后8周
Glu
Asp
39.2±11.0
, 百拇医药
38.8±10.1
46.0±17.2
31.5±9.3
61.3±10.7③④
38.5±9.6
48.4±9.3
30.6±7.1
注：①与术前比较P<0.01，②与非损伤侧比较P<0.05，③与A组比较P<0.05，④与术前比较P<0.05
2.4 NMDAr受体免疫组化结果(表4)
A组双侧脊髓背角浅层和固有层分布着中等密度的NMDAr受体免疫阳性纤维和终末。其分布特点和染色强度术前与术后、伤侧和非伤侧之间无显著性差异(P>0.05)。B组术后2～4周，其伤侧NMDAr受体免疫阳性纤维(图2，插Ⅳ)在脊髓背角浅层和固有层的分布密度和染色强度较术前和非伤侧显著降低(P<0.05)。 表4 脊髓背角NMDAr受体免疫组化表现 (
±s)
, 百拇医药
A组
B组
损伤侧
非损伤侧
损伤侧
非损伤侧
术前
53.4±10.4
47.1±11.2
53.4±10.4
47.1±11.2
术后1周
50.3±12.2
, 百拇医药
53.8±13.7
46.1±10.3
51.0±12.2
术后2周
47.1±11.3
50.7±9.8
30.2±5.5①②③
45.8±10.7
术后4周
49.8±16.8
46.5±8.8
33.9±6.0①②③
, 百拇医药
40.8±9.6
术后8周
42.1±11.5
44.3±10.1
40.6±11.4
48.8±12.5
注：①与术前相比，P<0.01，②与非损伤侧比较，P<0.05，③与A组比较，P<0.05，④与术前比较，P<0.05
图2 DRG炎性损伤2周，伤侧(A)和非伤侧(B)脊髓背角浅层NMDAR1-LI受体样免疫反应(×200)
, 百拇医药
2.5 脊髓背角C-fos/Glu或Asp样免疫反应
DRG炎性损伤后，C-fos样免疫反应与Glu和Asp样免疫反应一样均显著增强，其分布特点也极为相似，主要分布在脊髓背角浅层和固有层(图3、4，插Ⅳ)。
图3 DRG炎性损伤2周，伤侧(A)和非伤侧(B)脊髓背角浅层C-fos样Glu-LI样免疫反应(×200)
图3 DRG炎性损伤2周，伤侧(A)和非伤侧(B)脊髓背角固有层C-fos样Asp-LI样免疫反应均显著增强(×200)
, 百拇医药
3 讨论
神经解剖和免疫组织化学研究表明，Glu和Asp是背根传入神经的主要兴奋性神经介质，它们在背根的无髓鞘纤维和脊髓背角含量较高〔2〕，尤其在脊髓背角胶状质密度最高，同时Glu和Asp受体也主要分布在脊髓背角浅层〔3〕。分布在初级传入神经终末的Glu和Asp，可在外周神经受到各种刺激或损伤时大量释放〔4〕。本组实验见到DRG炎性刺激损伤，伤侧脊髓背侧组织Glu和Asp含量显著增加(P<0.05)，同时伤侧脊髓背角浅层的Glu样和Asp样免疫反应也显著增高(P<0.05)，并伴伤侧脊髓背角C-fos样免疫反应显著增加(P<0.05)，而C-fos表达与EAAs受体的激活和兴奋密切相关〔5〕。实验结果表明，DRG的炎性损伤导致伤侧脊髓背角EAAs释放的显著增加，引发脊髓背角伤害感受性神经细胞的兴奋性增加。EAAs大量释放所介导的脊髓EAAs受体持续性过度激活和异常兴奋，以及由此而引发的细胞内外的级联反应〔6〕，最终导致神经行为异常改变。本课题研究注意到DRG铬制肠线局部放置所造成的炎性刺激损伤，伤后2～4周动物伤侧肢体出现明显对热辐射刺激和机械性刺激的痛觉过敏，该痛觉过敏表现与其它动物致伤模型所产生的痛觉过敏极为相似〔7、8〕，同时其发生时间与脊髓背角EAAs的显著增高相一致。因此，我们认为DRG炎性损伤时所介导的EAAs大量释放，在痛觉过敏的形成和维持中具有重要作用。
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本实验显示DRG炎性刺激损伤时，伤侧脊髓背侧的GABA、Ser和Tau含量在伤后的不同时间内显著增加(P<0.05)。GABA主要存在于脊髓背角抑制性神经元中，在脊髓中主要起突触前抑制作用。而Tau可抑制运动神经元和脊髓背角中间神经元的兴奋性，拮抗NMDAr受体的活性，从而限制钙离子的内流〔9〕，可限制和调控EAAs受体过度兴奋时的Ca2+大量内流所造成的神经细胞过度兴奋性损伤。因此，我们认为DRG炎性损伤时所导致的脊髓背角IAAs显著性增加，可能是机体对损伤所做出的自身保护性反应。通过脊髓背角IAAs释放增加，降低外周伤害性刺激所导致的EAAs大量释放所造成的神经细胞兴奋性毒性损伤。伤侧脊髓背角EAAs的增高，与C-fos原癌基因蛋白表达的增加、伤侧肢体痛觉过敏表现相一致，而与IAAs的增高并不完全同步。IAAs的增高明显迟于EAAs的增加。据此，可以看出正常时脊髓背角伤害性感受区域的EAAs/IAAs维持着动态平衡。该动态平衡的失衡，可能是神经细胞兴奋性毒性损伤所介导的神经行为异常变化中的重要原因。
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Sugimoto等〔10〕发现脑缺血性损伤会显著降低NMDAr受体的表达。Hama等〔4〕见到坐骨神经损伤时，伤侧NMDAr受体样免疫反应显著降低。本实验也注意到DRG炎性损伤后2～4周，伤侧脊髓背角浅层的NMDAr受体样免疫阳性纤维的数量和染色强度均显著降低(P<0.05)。我们考虑NMDAr受体样免疫反应的降低可能存在两种主要原因，其一是EAAs的大量释放，使NMDAr受体过度兴奋，造成脊髓背角神经细胞的兴奋性毒性损伤，导致分布有NMDAr受体的神经细胞和神经纤维的变性和死亡。其二是伤侧NMDAr受体样免疫反应的降低，可能是造成NMDAr受体调控功能下降，从而增加NMDAr受体介导的神经兴奋性毒性损伤。因此，DRG损伤时，伤侧NMDAr样免疫反应的降低，是EAAs兴奋性毒性损伤的结果，还是NMDAr受体自身调控和应答功能的改变?其意义有待进一步深入研究。
4 参考文献
[1] Kawakami M,Weinstein JN,Spratt K,et al.Experimental lumbar radiculopathy-immunohistochemical and quantitative demonstrations of pain induced by lumbar nerve root irritation of the rat.Spine,1994,19(16):1780.
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收稿日期：1997-09-15 修回日期：1998-06-15, 百拇医药
单位：周 跃 梅芳瑞 第三军医大学新桥医院骨科 400037；刘正津 第三军医大学解剖教研室；廖维宏 第三军医大学野战外科研究所
关键词：脊神经节；脊髓背角；兴奋性氨基酸；抑制性氨基酸
脊神经节损伤介导的脊髓背角EAAs 和IAAs变化的实验研究 摘要 目的：研究脊神经节(DRG)炎性损伤时，脊髓背角兴奋性氨基酸(EAAs)、抑制性氨基酸(IAAs)含量和脊髓背角谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)免疫组织化学的变化，及其与实验动物神经行为异常变化之间的关系。方法：健康家兔54只，随机分为手术对照组(n=24)；炎症损伤组(n=24)和正常对照组(n=6)。采用组织氨基酸的含量分析仪测定脊髓背角Glu、Asp、γ-氨基丁酸(GABA)、牛磺酸(Tau)、苏氨酸(Thr)和色氨酸(Ser)含量，采用免疫组化法观察脊髓背角Glu和Asp分布特点及变化。结果：DRG炎症损伤介导脊髓背角EAAs和IAAs释放增加。结论：EAAs在痛觉过敏的形成和维持中具有重要作用，而IAAs的增加则与机体抗伤害性保护反应相关。DRG炎症损伤初期，脊髓背角EAAs/IAAs动态平衡的破坏是伤害性神经细胞兴奋性损伤和伤侧肢体痛觉过敏的主要原因。
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The experimental study of the EAAs and IAAs contents changes in the dorsal horn of spinal cord induced by DRG injury
ZHOU Yue,LIU Zhengjin,MEI Fangrui,et al//Chinese Journal of Spine and Spinal Cord,1998,8(6):23～27
Abstract Objective:To study the alternations of excitatory amino acids(EAAs),inhibitory amino acids(IAAs) contents and the distribution properties of Glu,Asp immunoreactivity in the dorsal horn of spinal cord.In addition,the relations between the abnormal neuro-behavior and the changes induced by inflammatory reaction of DRG would be investigated.Method:Fifty-four health rabbits were divided into three groups:sham-operative(n=24),inflammatory injury(n=24) and control group(n=6).The tissue content of EAAs(Glu,Asp),IAAs(GABA,Tau) and neutral amino acids(Ser,Thr) were determined in the dorsal horn of spinal cord (SDH).The distribution features of Glu and Asp were also studied by immunohistochemical analyse.Result:The EAAs and IAAs increased greatly induced by DRG inflammatory injury.Conclusion:The increase of EAAs release in SDH induced by inflammatory irritation played an important role in promoting and maintaining hyperalgesia, but increase of IAAs release is mainly related to protective mechanism. The balance of EAAs/IAAs destroyed by inflammatory injury of DRG was a main factor of the hyperexcitotoxicity injury of nociceptive neurons and hyperalgesia development.
, 百拇医药
Authors address Department of Orthopedics,Second Affiliated Hospital, Third Military Medical University,Chongqing,400037
Key words Dorsal root ganglia Dorsal horn of spinal cord Excitatory amino acids Inhibitory amino acids
本实验是观察观察脊神经节(DRG)炎性损伤时脊髓背角兴奋性氨基酸(EAAs)、抑制性氨基酸(IAAs)含量和脊髓背角谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)及其N-甲基门冬氨酸受体(NMDAr)免疫组织化学的变化规律，以及与动物神经行为异常改变之间的关系。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 动物及分组
健康家兔54只，雌雄不拘。体重2.0～3.1kg。实验分为3组：手术对照组(A组)，n=24；炎性损伤组(B组)，n=24；正常对照组(C组)，n=6。C组标本测定结果作为损伤前的正常参考值。
1.2 模型制作
3%戊巴比妥钠(0.5～1.0ml/kg)耳静脉麻醉，常规消毒铺无菌巾。腰骶部后正中切口，咬除L5～L7棘突和椎板，手术显微镜下仔细显露双侧L4～L6脊神经节(DRG4、5、6)。左侧作为损伤侧，右侧作为非损伤侧。B组采用4-0铬制肠线，剪成0.5cm长，取4～6条沿左侧DRG4、5、6周围纵轴排列放置，并用无菌手术骨蜡固定在DRG4、5、6周围，1～2层明胶海绵覆盖在硬脊膜表面，缝合伤口，送动物室饲养。A组的手术显露、明胶海绵覆盖和术后处理同B组一样。A组和B组右侧的DRG4、5、6作为自身对照组。
, 百拇医药
1.3 神经行为测定
按照 Kawakami法〔1〕进行测定。将测试动物放置在特制固定架中，待动物安静后，作神经行为测试，分别在术前1周，术后1、2、4、8周进行。
1.4 运动功能
采用记分制，正常步态，足无畸形为1分；正常步态伴明显足畸形为2分；轻度步态障碍伴足下垂为3分，严重步态障碍伴肌无力为4分。
1.5 脊髓背侧EAAs和IAAs含量测定
颈动脉放血处死动物，迅速显露L4～L6脊神经节段脊髓并取材，将标本放置在冰盆中，手术显微镜下，首先沿冠状面经中央导水管将脊髓等分为前后各半侧，然后将后半侧脊髓沿正中矢状径再等分为左右半侧，分别精确称湿重后将标本置于冰镇玻璃试管中，按每100mg组织湿重3ml的比例加入4℃的10%磺基水杨酸，在冰浴下用内切式匀浆机制备组织匀浆。然后用高速低温离心机(14 000r/min)离心20min，取上清液1ml。样品用柠檬酸锂缓冲液稀释。采用6300黄金系列氨基酸自动分析仪(Beckman分别检测Glu、Asp、γ-氨基丁酸(GABA)、牛磺酸(Tau)、苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)。结果以nmol/mg表示。
, 百拇医药
1.6 Glu、Asp和NMDAr免疫组化观察
动物麻醉后迅速开胸，升主动脉插管，用生理盐水和4%多聚甲醛磷酸缓冲液灌注，取材固定，冰冻切片。首先经0.3% Triton X-100室温孵育，3%过氧化氢甲醇液封闭内源性过氧化物酶，再经10%正常山羊血清孵育以降低非特异性染色，然后加入兔抗Glu血清(1∶5000，Sigma)、兔抗Asp血清(1∶5000，Sigma)和兔抗NMDAr(1∶4000，Donated by Hama AT,Illinois University,USA),孵育48h(4℃)。随后依次加入生物素标记羊抗兔IgG血清(1∶300)，37℃孵育3～4h，PBS漂洗后再置入HRP标记的链霉卵白素液(1∶100)中，37℃孵育1～2h，最后用DAB-GOD显色，其反应物呈紫黑色。显色后常规封片镜检。
1.7 C-fos/Glu和Asp免疫双染色
用C-fos抗血清(1∶2000)作用后切片再分别置入兔抗Glu血清(1∶5000，Sigma)和兔抗Asp血清中(1∶5000，Sigma)孵育。其后操作步骤同上述。C-fos样免疫反应作阳性细胞计数，Glu或Asp样免疫反应采用图像分析仪进行灰度扫描记录，并作比对分析。
, 百拇医药
1.8 数据统计
均在486/DX266型微机上，采用Microsoft Excel 5.0的统计程序，行样本单因素和多因素方差分析，显著性t检验，结果以均数±标准差表示。
2 实验结果
2.1 脊髓背侧EAAs含量变化(表1)
(1)A组Glu和Asp术前与术后、伤侧与非伤侧比较无显著性变化(P>0.05)。(2)B组术后2周，伤侧的Glu和Asp含量较术前、非伤侧较A组伤侧显著增高(P<0.05)。结果表明，手术本身对脊髓背侧EAAs含量无显著影响，但术后1～2周时DRG炎性损伤却能显著增加脊髓背侧EAAs含量。
表1 手术前后脊髓背角Glu和Asp含量 (
±s) (nmol/mg), 百拇医药
A组
B组
损伤侧
非损伤侧
损伤侧
非损伤侧
术前
Glu
Asp
3.426±0.66
2.382±0.13
3.098±0.58
2.603±0.41
, 百拇医药
3.426±0.66
2.382±0.13
3.098±0.58
2.603±0.41
术后1周
Glu
Asp
3.037±1.03
2.249±0.36
3.243±0.98
2.633±0.54
3.967±0.75
, http://www.100md.com
3.867±0.33
3.612±0.86
2.395±0.31
术后2周
Glu
Asp
2.949±0.85
3.011±0.52
3.004±0.54
2.938±0.38
5.849±1.04①②③
, http://www.100md.com 4.667±0.25①②③
3.026±0.53
2.934±0.22
术后4周
Glu
Asp
3.354±0.73
2.978±0.46
2.926±0.39
3.003±0.29
3.078±0.77
3.068±0.45
, 百拇医药
3.293±0.46
2.726±0.27
术后8周
Glu
Asp
3.146±0.57
2.588±0.39
3.113±0.85
3.015±0.32
3.645±0.65
3.118±0.47
3.167±0.37
, 百拇医药
3.012±0.18
注：①与术前相比，P<0.05，②与非损伤侧比较，P<0.05，③与A组相比，P<0.05
2.2 脊髓背侧IAAs含量变化(表2)
(1)A组GABA、Tau和Ser术前与术后、伤侧与非伤侧比较无显著变化(P>0.05)。B组术后2～4周伤侧的GABA和Tau、术后4～8周伤侧的Ser含量较术前和非伤侧显著增加(P<0.05)。 表2 手术前后脊髓背角GABA、Tau和Ser含量 (
±s) (nmol/mg)A组
B组
, 百拇医药
损伤侧
非损伤侧
损伤侧
非损伤侧
术前
GABA
Tau
Ser
0.329±0.14
0.875±0.24
0.306±0.12
0.313±0.16
0.857±0.19
, http://www.100md.com
0.314±0.09
0.329±0.14
0.875±0.24
0.306±0.12
0.313±0.11
0.857±0.19
0.314±0.09
术后1周
GABA
Tau
Ser
0.338±0.21
, 百拇医药
0.998±0.26
0.293±0.06
0.297±0.12
0.839±0.31
0.327±0.10
0.423±0.20
0.701±0.19
0.315±0.11
0.387±0.24
0.917±0.24
0.303±0.06
, 百拇医药
术后2周
GABA
Tau
Ser
0.304±0.11
1.214±0.37
0.327±0.13
0.343±0.17
1.386±0.41
0.315±0.08
0.678±0.15①②③
2.523±0.36②④
, 百拇医药
0.292±0.13
0.335±0.09
1.002±0.29
0.325±0.16
术后4周
GABA
Tau
Ser
0.325±0.09
1.306±0.34
0.361±0.22
0.338±024
, 百拇医药
1.335±0.23
0.288±0.11
0.584±0.22①②③
1.814±0.16①②
0.541±0.25①
0.320±0.15
0.898±0.35
0.350±0.14
术后8周
GABA
Tau
, http://www.100md.com
Ser
0.365±0.22
1.178±0.33
0.334±0.14
0.328±0.11
1.005±0.18
0.302±0.09
0.371±0.18
0.663±0.21
0.729±0.10①②③
0.308±0.17
, http://www.100md.com
1.010±0.31
0.331±0.17
注：①与术前相比，P<0.05，②与非损伤侧比较，P<0.05，③与A组相比，P<0.05，④与术前相比P<0.01
2.3 脊髓背角Glu-LI和Asp-LI免疫反应(表3)
A组术前与术后、伤侧与非伤侧比较，脊髓背角Glu-LI和Asp-LI免疫反应灰阶度值无显著差异(P>0.05)。B组术后伤侧Glu和Asp(图1，插Ⅳ)样免疫反应较术前和非伤侧显著性增高(P<0.05)，尤以术后2周增高最显著(P<0.01)。Glu和Asp样阳性免疫反应纤维主要位于伤侧脊髓背角浅层(Ⅰ、Ⅱ层)和固有层(Ⅲ、Ⅳ层)。
, 百拇医药
图1 DRG炎性损伤2周，伤侧(A)和非伤侧(B)脊髓背角浅层Glu-LI样免疫反应(×200)
表3 脊髓背角Glu和Asp免疫组化表现 (
±s)A组
B组
损伤侧
非损伤侧
损伤侧
非损伤侧
术前
, 百拇医药
Glu
Asp
42.7±9.1
36.5±7.6
40.3±10.2
32.4±8.1
42.7±9.1
36.5±7.6
40.3±10.2
32.4±8.1
术后1周
Glu
, 百拇医药
Asp
43.7±13.4
40.3±11.2
38.2±12.1
36.9±7.3
56.6±10.3
56.6±13.8②③④
47.8±13.2
33.7±6.3
术后2周
Glu
Asp
, 百拇医药
44.6±11.5
43.6±12.7
36.5±7.6
35.1±10.7
74.2±14.3①②③
49.7±7.3④
52.7±10.4
37.8±11.2
术后4周
Glu
Asp
, http://www.100md.com 48.8±10.9
39.3±8.6
41.8±14.6
30.1±7.8
68.6±15.1②③④
31.9±10.2
50.3±11.7
37.4±9.5
术后8周
Glu
Asp
39.2±11.0
, 百拇医药
38.8±10.1
46.0±17.2
31.5±9.3
61.3±10.7③④
38.5±9.6
48.4±9.3
30.6±7.1
注：①与术前比较P<0.01，②与非损伤侧比较P<0.05，③与A组比较P<0.05，④与术前比较P<0.05
2.4 NMDAr受体免疫组化结果(表4)
A组双侧脊髓背角浅层和固有层分布着中等密度的NMDAr受体免疫阳性纤维和终末。其分布特点和染色强度术前与术后、伤侧和非伤侧之间无显著性差异(P>0.05)。B组术后2～4周，其伤侧NMDAr受体免疫阳性纤维(图2，插Ⅳ)在脊髓背角浅层和固有层的分布密度和染色强度较术前和非伤侧显著降低(P<0.05)。 表4 脊髓背角NMDAr受体免疫组化表现 (
±s), 百拇医药
A组
B组
损伤侧
非损伤侧
损伤侧
非损伤侧
术前
53.4±10.4
47.1±11.2
53.4±10.4
47.1±11.2
术后1周
50.3±12.2
, 百拇医药
53.8±13.7
46.1±10.3
51.0±12.2
术后2周
47.1±11.3
50.7±9.8
30.2±5.5①②③
45.8±10.7
术后4周
49.8±16.8
46.5±8.8
33.9±6.0①②③
, 百拇医药
40.8±9.6
术后8周
42.1±11.5
44.3±10.1
40.6±11.4
48.8±12.5
注：①与术前相比，P<0.01，②与非损伤侧比较，P<0.05，③与A组比较，P<0.05，④与术前比较，P<0.05
图2 DRG炎性损伤2周，伤侧(A)和非伤侧(B)脊髓背角浅层NMDAR1-LI受体样免疫反应(×200)
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2.5 脊髓背角C-fos/Glu或Asp样免疫反应
DRG炎性损伤后，C-fos样免疫反应与Glu和Asp样免疫反应一样均显著增强，其分布特点也极为相似，主要分布在脊髓背角浅层和固有层(图3、4，插Ⅳ)。
图3 DRG炎性损伤2周，伤侧(A)和非伤侧(B)脊髓背角浅层C-fos样Glu-LI样免疫反应(×200)
图3 DRG炎性损伤2周，伤侧(A)和非伤侧(B)脊髓背角固有层C-fos样Asp-LI样免疫反应均显著增强(×200)
, 百拇医药
3 讨论
神经解剖和免疫组织化学研究表明，Glu和Asp是背根传入神经的主要兴奋性神经介质，它们在背根的无髓鞘纤维和脊髓背角含量较高〔2〕，尤其在脊髓背角胶状质密度最高，同时Glu和Asp受体也主要分布在脊髓背角浅层〔3〕。分布在初级传入神经终末的Glu和Asp，可在外周神经受到各种刺激或损伤时大量释放〔4〕。本组实验见到DRG炎性刺激损伤，伤侧脊髓背侧组织Glu和Asp含量显著增加(P<0.05)，同时伤侧脊髓背角浅层的Glu样和Asp样免疫反应也显著增高(P<0.05)，并伴伤侧脊髓背角C-fos样免疫反应显著增加(P<0.05)，而C-fos表达与EAAs受体的激活和兴奋密切相关〔5〕。实验结果表明，DRG的炎性损伤导致伤侧脊髓背角EAAs释放的显著增加，引发脊髓背角伤害感受性神经细胞的兴奋性增加。EAAs大量释放所介导的脊髓EAAs受体持续性过度激活和异常兴奋，以及由此而引发的细胞内外的级联反应〔6〕，最终导致神经行为异常改变。本课题研究注意到DRG铬制肠线局部放置所造成的炎性刺激损伤，伤后2～4周动物伤侧肢体出现明显对热辐射刺激和机械性刺激的痛觉过敏，该痛觉过敏表现与其它动物致伤模型所产生的痛觉过敏极为相似〔7、8〕，同时其发生时间与脊髓背角EAAs的显著增高相一致。因此，我们认为DRG炎性损伤时所介导的EAAs大量释放，在痛觉过敏的形成和维持中具有重要作用。
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本实验显示DRG炎性刺激损伤时，伤侧脊髓背侧的GABA、Ser和Tau含量在伤后的不同时间内显著增加(P<0.05)。GABA主要存在于脊髓背角抑制性神经元中，在脊髓中主要起突触前抑制作用。而Tau可抑制运动神经元和脊髓背角中间神经元的兴奋性，拮抗NMDAr受体的活性，从而限制钙离子的内流〔9〕，可限制和调控EAAs受体过度兴奋时的Ca2+大量内流所造成的神经细胞过度兴奋性损伤。因此，我们认为DRG炎性损伤时所导致的脊髓背角IAAs显著性增加，可能是机体对损伤所做出的自身保护性反应。通过脊髓背角IAAs释放增加，降低外周伤害性刺激所导致的EAAs大量释放所造成的神经细胞兴奋性毒性损伤。伤侧脊髓背角EAAs的增高，与C-fos原癌基因蛋白表达的增加、伤侧肢体痛觉过敏表现相一致，而与IAAs的增高并不完全同步。IAAs的增高明显迟于EAAs的增加。据此，可以看出正常时脊髓背角伤害性感受区域的EAAs/IAAs维持着动态平衡。该动态平衡的失衡，可能是神经细胞兴奋性毒性损伤所介导的神经行为异常变化中的重要原因。
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Sugimoto等〔10〕发现脑缺血性损伤会显著降低NMDAr受体的表达。Hama等〔4〕见到坐骨神经损伤时，伤侧NMDAr受体样免疫反应显著降低。本实验也注意到DRG炎性损伤后2～4周，伤侧脊髓背角浅层的NMDAr受体样免疫阳性纤维的数量和染色强度均显著降低(P<0.05)。我们考虑NMDAr受体样免疫反应的降低可能存在两种主要原因，其一是EAAs的大量释放，使NMDAr受体过度兴奋，造成脊髓背角神经细胞的兴奋性毒性损伤，导致分布有NMDAr受体的神经细胞和神经纤维的变性和死亡。其二是伤侧NMDAr受体样免疫反应的降低，可能是造成NMDAr受体调控功能下降，从而增加NMDAr受体介导的神经兴奋性毒性损伤。因此，DRG损伤时，伤侧NMDAr样免疫反应的降低，是EAAs兴奋性毒性损伤的结果，还是NMDAr受体自身调控和应答功能的改变?其意义有待进一步深入研究。
4 参考文献
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收稿日期：1997-09-15 修回日期：1998-06-15, 百拇医药