突出腰椎间盘组织中TNFa、IL-1β的表达及其意义
作者：赵太茂 刘 淼 宋红星 王 民
单位：赵太茂 刘 淼 宋红星 王 民 西安医科大学第一附属医院骨科 710061 西安市健康路1号
关键词：腰椎间盘突出；免疫组化；肿瘤坏死因子а；白细胞介素1β
突出腰椎间盘组织中TNFa摘要 目的：研究肿瘤坏死因子a(TNFa)和白细胞介素质1β(IL-1β)在突出腰椎间盘组织中的表达，并对其意义进行探讨。方法：用免疫组织化学方法，分别应用TNFa、IL-1β的单克隆抗体，对16例腰椎间盘突出症患者突出腰椎间盘组织中TNFa、IL-1β的表达水平进行了检测，并取6例健康成人(尸体)正常腰椎间盘作对照。结果：在16例突出腰椎间盘组织中，12例存在TNFa表达阳性细胞，8例存在IL-1β表达阳性细胞，有6例为两种细胞因子均表达。表达阳性的细胞主要为软骨细胞和成纤维细胞。6例正常腰椎间盘组织中，均无表达阳性的细胞。结论：突出腰椎间盘细胞可产生这两种细胞因子，它们可能在椎间盘退变中发挥作用。
, 百拇医药
Expression of TNFa,IL-1β in the herniated lumbar disc tissue
ZHAO Taimao LIU Miao SONG Hongxing,et al//Chinese Journal of Spine and Spinal Cord,1999,9(1):17～19
Abstract Objective:To study the role of cytokines in the herniated lumbar disc tissue.Method:Herniated lumbar disc tissues were obtained from 16 patients undergoing surgery for persistent radiculopathy.The specimens were analysed immunohistochemically for the presence of TNFа and IL-1β.As a control group 6 lumbar disc specimens were harvested from 6 normal men and similar immunohistochemically detections were performed.Result:Of 16 herniated lumbar discs,TNFа positively expressing cells were presented in 12 specimens and IL-1β positively expressing cells were presented in 8,both of the cytokines positively expressing cells were presented in 6.These staining cells were mainly chondrocyte and fibroblast.No positively expressing cells were detected in the normal lumbar discs.Conclusion:Herniated lumbar disc cells can produce TNFа and IL-1β.These cytokines may be involved in the biochemistry of disc degeneration and the pathophysiology of radiculopathy.
, 百拇医药
Authors address Department of Orthopaedics,The First Clinical Medical College of Xian Medical University,Xian,Shanxi,710061
Key words Lumbar disc herniation Immunohistochemical detection Tumor necrosis factor-а Interleukin-1β
腰椎间盘退变可导致椎间盘突出，压迫神经根引起临床症状。椎间盘退变不仅是一种生物力学现象，生物化学机制也可能参与了这一过程〔1～3〕。近年来随着分子生物学和分子免疫学的迅速发展以及细胞因子研究的深入，细胞因子在骨关节退变性疾病中的作用越来越受到重视。为此，我们选用突出腰椎间盘和正常腰椎间盘作为研究对象，采用免疫组织化学方法，检测其组织中肿瘤坏死因子а(TNFа)和白细胞介素质1β(IL-1β)的表达水平，以期探讨这类细胞因子与椎间盘退变的关系。
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1 材料与方法
1.1 病例选择
病例均来自我科住院患者,男性11例,女性5例。年龄30～60岁,平均年龄44.6岁。标本均在手术中切取,突出腰椎间盘组织中含不同比例的髓核和纤维环。取自L3～4 1例,取自L4～5 9例,取自L5～S1 6例。正常腰椎间盘取自新鲜尸体，均为男性，年龄20～25岁，2例取自L4～5，4例取自L5～S1。
1.2 试剂
小鼠抗人TNFа单克隆抗体和小鼠抗人IL-1β单克隆抗体由第四军医大学免疫教研室提供,ABC免疫组化试剂盒购自美国Vector公司。
1.3 实验方法
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1.3.1 将术中取下的组织标本用生理盐水冲洗2～3遍,立即固定于4%多聚甲醛溶液中,4℃,放置24h。
1.3.2 组织块经OCT包埋置-40℃低温冰箱迅速降温后,用-20℃恒冷箱冰冻切片机切片,片厚12～16μm,组织切片粘附于明胶铬矾液处理过的载玻片,低温保存备用。
1.3.3 按ABC免疫组化试剂盒所示常规方法,以DAB为显色剂进行染色,并用苏木素对细胞核进行复染。以PBS代替一抗作为阴性对照。
2 结果
镜下可见TNFа、IL-1β表达阳性的细胞在组织中散在分布，其胞浆为棕黄色着色,背景为淡黄色。16例突出腰椎间盘组织中TNFа表达阳性的有12例,IL-1β表达阳性的8例,有6例为两种细胞因子均表达,均无表达的2例。细胞因子表达阳性的细胞主要为软骨细胞,其次为成纤维细胞(图1～4，插Ⅲ)。6例正常腰椎间盘组织中均无表达阳性的细胞。
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图1 突出腰椎间盘组织中IL-1β表达阳性的软骨细胞(×40)图2 突出腰椎间盘组织中IL-1β表达阳性的成纤维细胞(×40)图3 突出腰椎间盘组织中TNFа表达阳性的软骨细胞(×40)图4 突出腰椎间盘组织中TNFа表达阳性的成纤维细胞(×40)
3 讨论
3.1 细胞因子是一类由多种细胞产生并分泌到胞外的糖蛋白分子,具有多种生物学功能。细胞因子,特别是TNFа与IL-1β作为重要的炎性介质在退行性骨关节病中发挥重要作用。Shinmei用免疫组化方法观察到退行性骨关节病患者软骨TNF、IL-1等染色均为阳性反应〔4〕。Firestein用分子原位杂交技术证实退行性骨关节病患者的滑膜细胞同样表达TNF和IL-1〔5〕。TNF和IL-1在关节病变中的作用主要通过刺激滑膜细胞和软骨细胞合成前列腺素E2(PGE2)和胶原酶〔6〕。IL-1还能刺激滑膜细胞和软骨细胞合成过量金属蛋白酶,破坏软骨基质〔7〕,抑制软骨细胞合成蛋白多糖。腰椎间盘髓核组织基质成分主要为蛋白多糖,纤维环中主要为胶原,腰椎间盘退变主要表现为髓核中蛋白多糖的减少及胶原强度的降低〔8〕。本实验发现TNFа、IL-1β在突出腰椎间盘中有阳性表达,提示腰椎间盘退变过程中可能存在上述机制。
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3.2 成人腰椎间盘细胞主要为软骨细胞和成纤维细胞〔9〕。本组实验中TNFа、IL-1β在突出椎间盘组织的这两种细胞中有表达,而正常腰椎间盘组织中无表达。TNFа和IL-1β可能通过自分泌或旁分泌作用于椎间盘内细胞,改变其生物学行为产生病理效应。Kang等在体外孵育椎间盘组织的过程中加入IL-1β发现其产生金属蛋白酶、NO、PGE2的能力加强〔10〕。他认为椎间盘细胞具有潜在的合成能引起自身基质破坏及激发炎症反应的物质的能力，对体内IL-1β的来源他认为有两种可能:①来源于椎间盘组织周围浸润的炎性细胞；②来源于椎间盘自身细胞。本实验支持后一种观点。
3.3 本组16例突出腰椎间盘中,TNFа表达12例,IL-1β表达8例,有6例为二者均表达,二者均无表达2例。正常腰椎间盘组织无一例表达。表明退变腰椎间盘组织中炎性细胞因子有较高表达率。对于体内通过何种机制诱导椎间盘细胞表达TNFа、IL-1β尚不能确定。我们推测作用于腰椎间盘的不良应力可能会使腰椎间盘内细胞代谢发生变化,从而诱导TNFа、IL-1β的表达。腰椎间盘的慢性机械损伤和其它生物化学物质的介导也可能是诱发其产生的原因。突出腰椎间盘组织中两种细胞因子的不同表达率可能与患者的年龄、病程及病理类型有关，提示TNFа、IL-1β参与了腰椎间盘退变这一病理过程。
, 百拇医药
4 参考文献
[1] Fujita K,Nakagawa T,Hirabayashi K,et al.Neutral proteinase in human intervertebral disc:Role in degeneration and probable origin.Spine,1993,18:1766.
[2] Gronblad M,Virri J,Tolonen,et al.A controlled immunohistochemical study of inflammatory cells in disc herniation tissue.Spine,1994,19:2744.
[3] Kang JD,Georgescu HI,Larkin L,et al.Herniared lumbar intervertebral disc spontaneously produce matrix metalloproteinases,NO,IL-6,and PGE2.Spine,1996,21:271.
, 百拇医药
[4] Shinmei M,Masuda K,Kikuchi T,et al.Production of cytokins by chondrocytes and its role in proteoglycan degradation.J Rheumatol(Suppl),1991,27:89.
[5] Firestein GS,Alvaro-Gracia JM,Maki R,et al.Quantitive analysis of cytokine gene expression in rheumatoid arthritis.J Immunol,1990,145:1037.
[6] Chin JE,Lin YA.Effect of recombinant human interleukin-1 beta on rabbit articular chondrocytes. Stimmulation of prostanoid release and inhibition of cell growth.Arthritis Rheum,1988,31:1290.
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[7] Dibattista JA,Martel-pelletier,Wosu Lo,et al.Glucocorticoid receptor mediated inhibition of interleukin-1 stimulated neutral metalloprotease synthesis in normal human chondrocytes.J Clin Endocrinol Metab,1991,72:316.
[8] Lipson SJ,Muir H.Experimental intervertebral disc degeneration:Morphologic and proteoglycan changes overtime.Arthritis Rheum,1981,24:12.
[9] 胡有谷,吕振华,陈晓亮,等.腰椎间盘的细胞、胶原与弹性蛋白.中华骨科杂志,1997,17:8.
[10] Kang JD,Stefanovic-Racic M,Mcintyre LA,et al.Toward a biochemical understanding of human intervertebral disc degeneration and herniation.Contributions of nitricoxide,interleukins, prostaglandin E2,and matrix metalloproteinases.Spine，1997,22:1065.
收稿日期：1998-04-27 修回日期：1999-01-20, http://www.100md.com
单位：赵太茂 刘 淼 宋红星 王 民 西安医科大学第一附属医院骨科 710061 西安市健康路1号
关键词：腰椎间盘突出；免疫组化；肿瘤坏死因子а；白细胞介素1β
突出腰椎间盘组织中TNFa摘要 目的：研究肿瘤坏死因子a(TNFa)和白细胞介素质1β(IL-1β)在突出腰椎间盘组织中的表达，并对其意义进行探讨。方法：用免疫组织化学方法，分别应用TNFa、IL-1β的单克隆抗体，对16例腰椎间盘突出症患者突出腰椎间盘组织中TNFa、IL-1β的表达水平进行了检测，并取6例健康成人(尸体)正常腰椎间盘作对照。结果：在16例突出腰椎间盘组织中，12例存在TNFa表达阳性细胞，8例存在IL-1β表达阳性细胞，有6例为两种细胞因子均表达。表达阳性的细胞主要为软骨细胞和成纤维细胞。6例正常腰椎间盘组织中，均无表达阳性的细胞。结论：突出腰椎间盘细胞可产生这两种细胞因子，它们可能在椎间盘退变中发挥作用。
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Expression of TNFa,IL-1β in the herniated lumbar disc tissue
ZHAO Taimao LIU Miao SONG Hongxing,et al//Chinese Journal of Spine and Spinal Cord,1999,9(1):17～19
Abstract Objective:To study the role of cytokines in the herniated lumbar disc tissue.Method:Herniated lumbar disc tissues were obtained from 16 patients undergoing surgery for persistent radiculopathy.The specimens were analysed immunohistochemically for the presence of TNFа and IL-1β.As a control group 6 lumbar disc specimens were harvested from 6 normal men and similar immunohistochemically detections were performed.Result:Of 16 herniated lumbar discs,TNFа positively expressing cells were presented in 12 specimens and IL-1β positively expressing cells were presented in 8,both of the cytokines positively expressing cells were presented in 6.These staining cells were mainly chondrocyte and fibroblast.No positively expressing cells were detected in the normal lumbar discs.Conclusion:Herniated lumbar disc cells can produce TNFа and IL-1β.These cytokines may be involved in the biochemistry of disc degeneration and the pathophysiology of radiculopathy.
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Authors address Department of Orthopaedics,The First Clinical Medical College of Xian Medical University,Xian,Shanxi,710061
Key words Lumbar disc herniation Immunohistochemical detection Tumor necrosis factor-а Interleukin-1β
腰椎间盘退变可导致椎间盘突出，压迫神经根引起临床症状。椎间盘退变不仅是一种生物力学现象，生物化学机制也可能参与了这一过程〔1～3〕。近年来随着分子生物学和分子免疫学的迅速发展以及细胞因子研究的深入，细胞因子在骨关节退变性疾病中的作用越来越受到重视。为此，我们选用突出腰椎间盘和正常腰椎间盘作为研究对象，采用免疫组织化学方法，检测其组织中肿瘤坏死因子а(TNFа)和白细胞介素质1β(IL-1β)的表达水平，以期探讨这类细胞因子与椎间盘退变的关系。
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1 材料与方法
1.1 病例选择
病例均来自我科住院患者,男性11例,女性5例。年龄30～60岁,平均年龄44.6岁。标本均在手术中切取,突出腰椎间盘组织中含不同比例的髓核和纤维环。取自L3～4 1例,取自L4～5 9例,取自L5～S1 6例。正常腰椎间盘取自新鲜尸体，均为男性，年龄20～25岁，2例取自L4～5，4例取自L5～S1。
1.2 试剂
小鼠抗人TNFа单克隆抗体和小鼠抗人IL-1β单克隆抗体由第四军医大学免疫教研室提供,ABC免疫组化试剂盒购自美国Vector公司。
1.3 实验方法
, 百拇医药
1.3.1 将术中取下的组织标本用生理盐水冲洗2～3遍,立即固定于4%多聚甲醛溶液中,4℃,放置24h。
1.3.2 组织块经OCT包埋置-40℃低温冰箱迅速降温后,用-20℃恒冷箱冰冻切片机切片,片厚12～16μm,组织切片粘附于明胶铬矾液处理过的载玻片,低温保存备用。
1.3.3 按ABC免疫组化试剂盒所示常规方法,以DAB为显色剂进行染色,并用苏木素对细胞核进行复染。以PBS代替一抗作为阴性对照。
2 结果
镜下可见TNFа、IL-1β表达阳性的细胞在组织中散在分布，其胞浆为棕黄色着色,背景为淡黄色。16例突出腰椎间盘组织中TNFа表达阳性的有12例,IL-1β表达阳性的8例,有6例为两种细胞因子均表达,均无表达的2例。细胞因子表达阳性的细胞主要为软骨细胞,其次为成纤维细胞(图1～4，插Ⅲ)。6例正常腰椎间盘组织中均无表达阳性的细胞。
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图1 突出腰椎间盘组织中IL-1β表达阳性的软骨细胞(×40)图2 突出腰椎间盘组织中IL-1β表达阳性的成纤维细胞(×40)图3 突出腰椎间盘组织中TNFа表达阳性的软骨细胞(×40)图4 突出腰椎间盘组织中TNFа表达阳性的成纤维细胞(×40)
3 讨论
3.1 细胞因子是一类由多种细胞产生并分泌到胞外的糖蛋白分子,具有多种生物学功能。细胞因子,特别是TNFа与IL-1β作为重要的炎性介质在退行性骨关节病中发挥重要作用。Shinmei用免疫组化方法观察到退行性骨关节病患者软骨TNF、IL-1等染色均为阳性反应〔4〕。Firestein用分子原位杂交技术证实退行性骨关节病患者的滑膜细胞同样表达TNF和IL-1〔5〕。TNF和IL-1在关节病变中的作用主要通过刺激滑膜细胞和软骨细胞合成前列腺素E2(PGE2)和胶原酶〔6〕。IL-1还能刺激滑膜细胞和软骨细胞合成过量金属蛋白酶,破坏软骨基质〔7〕,抑制软骨细胞合成蛋白多糖。腰椎间盘髓核组织基质成分主要为蛋白多糖,纤维环中主要为胶原,腰椎间盘退变主要表现为髓核中蛋白多糖的减少及胶原强度的降低〔8〕。本实验发现TNFа、IL-1β在突出腰椎间盘中有阳性表达,提示腰椎间盘退变过程中可能存在上述机制。
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3.2 成人腰椎间盘细胞主要为软骨细胞和成纤维细胞〔9〕。本组实验中TNFа、IL-1β在突出椎间盘组织的这两种细胞中有表达,而正常腰椎间盘组织中无表达。TNFа和IL-1β可能通过自分泌或旁分泌作用于椎间盘内细胞,改变其生物学行为产生病理效应。Kang等在体外孵育椎间盘组织的过程中加入IL-1β发现其产生金属蛋白酶、NO、PGE2的能力加强〔10〕。他认为椎间盘细胞具有潜在的合成能引起自身基质破坏及激发炎症反应的物质的能力，对体内IL-1β的来源他认为有两种可能:①来源于椎间盘组织周围浸润的炎性细胞；②来源于椎间盘自身细胞。本实验支持后一种观点。
3.3 本组16例突出腰椎间盘中,TNFа表达12例,IL-1β表达8例,有6例为二者均表达,二者均无表达2例。正常腰椎间盘组织无一例表达。表明退变腰椎间盘组织中炎性细胞因子有较高表达率。对于体内通过何种机制诱导椎间盘细胞表达TNFа、IL-1β尚不能确定。我们推测作用于腰椎间盘的不良应力可能会使腰椎间盘内细胞代谢发生变化,从而诱导TNFа、IL-1β的表达。腰椎间盘的慢性机械损伤和其它生物化学物质的介导也可能是诱发其产生的原因。突出腰椎间盘组织中两种细胞因子的不同表达率可能与患者的年龄、病程及病理类型有关，提示TNFа、IL-1β参与了腰椎间盘退变这一病理过程。
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4 参考文献
[1] Fujita K,Nakagawa T,Hirabayashi K,et al.Neutral proteinase in human intervertebral disc:Role in degeneration and probable origin.Spine,1993,18:1766.
[2] Gronblad M,Virri J,Tolonen,et al.A controlled immunohistochemical study of inflammatory cells in disc herniation tissue.Spine,1994,19:2744.
[3] Kang JD,Georgescu HI,Larkin L,et al.Herniared lumbar intervertebral disc spontaneously produce matrix metalloproteinases,NO,IL-6,and PGE2.Spine,1996,21:271.
, 百拇医药
[4] Shinmei M,Masuda K,Kikuchi T,et al.Production of cytokins by chondrocytes and its role in proteoglycan degradation.J Rheumatol(Suppl),1991,27:89.
[5] Firestein GS,Alvaro-Gracia JM,Maki R,et al.Quantitive analysis of cytokine gene expression in rheumatoid arthritis.J Immunol,1990,145:1037.
[6] Chin JE,Lin YA.Effect of recombinant human interleukin-1 beta on rabbit articular chondrocytes. Stimmulation of prostanoid release and inhibition of cell growth.Arthritis Rheum,1988,31:1290.
, 百拇医药
[7] Dibattista JA,Martel-pelletier,Wosu Lo,et al.Glucocorticoid receptor mediated inhibition of interleukin-1 stimulated neutral metalloprotease synthesis in normal human chondrocytes.J Clin Endocrinol Metab,1991,72:316.
[8] Lipson SJ,Muir H.Experimental intervertebral disc degeneration:Morphologic and proteoglycan changes overtime.Arthritis Rheum,1981,24:12.
[9] 胡有谷,吕振华,陈晓亮,等.腰椎间盘的细胞、胶原与弹性蛋白.中华骨科杂志,1997,17:8.
[10] Kang JD,Stefanovic-Racic M,Mcintyre LA,et al.Toward a biochemical understanding of human intervertebral disc degeneration and herniation.Contributions of nitricoxide,interleukins, prostaglandin E2,and matrix metalloproteinases.Spine，1997,22:1065.
收稿日期：1998-04-27 修回日期：1999-01-20, http://www.100md.com