pH薄层色谱法测定槐定碱和拉马宁碱的离解常数
作者：袁波 周采菊 王国清 李玲 范毅
单位：袁 波 周采菊 王国清 李 玲 沈阳药科大学基础部，沈阳 110015；范毅 沈阳东昂制药有限公司，沈阳 110003
关键词：pH薄层色谱法；离解常数；槐定碱；拉马宁碱
沈阳药科大学学报990111 摘 要 采用薄层色谱法对槐定碱和拉马宁碱的离解常数进行了测定，所得结果与文献值基本一致.该方法的特点是：若待测物质是难分离的混合物，可通过选择合适pH的固定相和展开剂，测其离解常数.
分类号 R657.7
The Detection of Dissociation Constants of Sophordine and Lehmannine by Thin-layer pH-Chromatography
, http://www.100md.com
Yuan Bo,Zhou Caiju,Wang Guoqing,Li Ling
Department of Basic Courses,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract The dissociation constant of acid or basic drugs is a very important parameter.In this article the dissociation constant of the two basic sophordine and lehmannine were detected by thin-layer pH-chromatography,and the results were basically compatible with those values in literature.The advatage of this method is that the separation of certain dissociating compounds,often very similar in character,can be in improved by suitable selection of the pH.
, 百拇医药
Key words thin-layer pH-chromatography;dissociation constant;sophordine;lehmannine
槐定碱和拉马宁碱是从豆科槐属植物的根或叶中提取的生物碱〔1～3〕.槐定碱具有抗癌〔4〕、抗菌〔5〕、抗心律失常〔6〕等多种作用.拉马宁碱具有明显的镇静作用〔7〕.离解常数是药物在生产、制剂、分析、储存及药物在体内吸收、分布、代谢等研究中的一个重要的理化参数.两种生物碱的离解常数的测定方法主要有电位滴定法〔8〕和紫外分光光度法〔9〕.本文采用pH薄层色谱法测定了槐定碱和拉马宁碱的离解常数，所得结果与其它测定方法基本一致.
1 方法与原理
pH薄层色谱法的原理是：待测物质在同一溶剂系统中展开，但每一次展开时，所用的固定相都用缓冲溶液调至不同的pH值，这样即可得到一系列Rf值.然后用Rf值和对应的pH值做图，就到该物质的Rf-pH曲线.依此曲线，不论该化合物是酸性还是碱性，都可测其离解常数.
, 百拇医药
在分配色谱中，Rf值为组分配系数的函数.即：
(1)
K:组分分配系数；Vs:固定相体积；Vm:流动相体积.
依据Golnmbic和Waksmundski的研究表明：碱性物质其分配系数是固定相[OH-]的函数：
(2)
Kb：碱性物质的离解常数；K0：未离解碱的分配系数.
将(2)式代入(1)式整理得：
(3)
, 百拇医药
(3)式即为一元碱的Rf-pOH曲线方程，我们可利用(3)式来测定一元碱的pKb值.
在(3)式中，当[OH-]Kb时，
可略.此时
(4)
Rf0：未离解碱的比移值.
Rf0值可从Rf-pOH曲线上求得.随着固定相[OH-]增加，Rf值将达到极限值，即趋于常数值.在曲线的这一部分，只要Rf值的变化小于实验误差，这个常数值就等于Rf0值.
(4)式经变换代入(3)式即得：
(5)
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利用(5)式即可定量测定一元碱的离解常数.这其中有两种求法：一种是在Rf-pOH曲线上求拐点处的pOH值.对(5)进行两次微分后，结果为零，则得：
pKb=pOHinf1lg(1-Rf0) (6)
pOHinf1：Rf-pOH曲线拐点处的pOH值.该值可在Rf-pOH曲线上求出.依据式(5)知：pOHinf1在曲线上所对应的Rf=Rf0/2.另一种方法就是当Kb=[OH-]时，(5)式变为：
(7)
此时Rf′所对应的pOH值即为pKb值.
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2 仪器与试剂
pH～3C型酸度计(上海第二分析仪器厂)；紫外检出器(アト～株式会社)；双槽层析缸.槐定碱和拉马宁碱(本校药剂教研室提供)；丙酮、环己烷、磷酸一氢钠、柠檬酸、氢氧化钠均为分析纯；硅胶G(青岛海洋化工厂).
3 方法与结果
3.1 铺板
取适量硅胶G，加入一定体积pH值不同的缓冲溶液浸泡1 h，待pH值不再改变后，用研钵研磨、铺板，室温下干躁，即是一系列pH不同的薄层板.
3.2 点样、展开和Rf值的测定
将适量的样品溶于丙酮中(2.00 mg/mL)，在距薄层板一端2 cm处，用定量点样器点样5 μL.用丙酮∶环己烷(2∶3)混合溶剂饱合0.5 h，然后展开约15 cm.取出薄层板，挥干溶剂，在UV检出器下观查斑点，测量Rf值.结果见表1.
, 百拇医药
表1 槐定碱和拉马宁碱在不同薄层板上的Rf值 pOH
槐定碱
拉马宁碱
1.08
0.42
0.68
2.02
0.42
0.68
2.98
0.41
0.65
, http://www.100md.com 3.97
0.40
0.63
4.51
0.32
0.60
4.97
0.24
0.57
5.53
0.12
0.54
5.98
, http://www.100md.com
0.06
0.51
6.49
0.03
0.38
6.91
0.02
0.12
7.98
0.01
0.05
8.49
0.01
, 百拇医药
0.03
9.01
0.01
0.02
3.3 Rf-pOH曲线绘制及槐定碱、拉马宁碱离解常数测定结果
图1 槐定碱和拉马宁碱的Rf-pOH的曲线
1—槐定碱；2—拉马宁碱
将表1所列数据作图，即得Rf-pOH曲线，见图1.
由Rf-pOH曲线和(6)式或(7)式即得槐定碱和拉马宁碱的pKb值.见表2.
, 百拇医药
4 讨论
a.本实验的关键是要选择合适的溶剂系统.选择溶剂系统要满足下列条件：Rf0值不能接近1，否则误差较大；当pOH接近7时，Rf值应接近零，表明碱完全离解而不进入流动相.
b.溶剂系统要密闭，以保证实验条件一致.
c.固定相pH值要严格控制，误差范围应在(±0.02)pH单位，尤其在曲线急剧变化处对曲线形状影响较大.
d.本方法的优点是：在样品纯度较低的情况下，也可得到满意的结果.
表2 槐定碱和拉马宁碱的pKb测定值和文献值 样品
Rf0
, 百拇医药
pOHinf1
pKb
Rf′
pKb
pK8b
槐定碱
0.42
5.15
4.91
0.26
4.90
5.02
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拉马宁碱
0.68
6.55
6.05
0.52
5.93
6.03
e.只要选择合适pH值的缓冲溶液和溶剂系统，该方法也可测定酸的离解常数.
参考文献
[1] 赵博光.苦斗草生物碱的研究.药学学报，1980，15(3)：182～183
[2] 赵博光，严照金，杨绪，等.苦斗草生物碱甲苯提取分离生产工艺的研究.中草药，1980，11(8)：350～352
, 百拇医药
[3] 王中效，杜盐平.苦斗子中Lehmannine生物碱的鉴定.中草药,1986,17(6)：44
[4] 李雪梅，吴运光，陈绍励.槐定的抗癌作用.中国药理学报，1987，8(2)：153～158
[5] 仲仁山.苦斗子的研究与应用.银川：宁夏人民出版社，1983.2～4
[6] 蔚中民，刘国隆，施学筠.槐定碱的抗心律失常作用的电生理学研究.北京中医学院学报,1984，(6)：38～40
[7] 张青，袁惠南，王中效.苦斗子的药理研究Lehmannine的镇静作用.药物分析杂志，1987，7(2)：110～112
[8] 王国清，于定开，周润亚.电位法测定槐定碱和拉马宁碱的电离常数.沈阳药学院学报，1991，8(3)：215～216
[9] 王国清，周润亚.紫外分光光度法测定葛根黄豆甙元的电离常数.沈阳药学院学报，1992，9(1)：63～65
[10] M Bidlo.Thin-layer pH-chromatography of mono and dibasic organic acids on buffered silica gel layers.Acta Chim(Budapest),1976，88(2)：115～123
收稿日期:1998-07-20, 百拇医药
单位：袁 波 周采菊 王国清 李 玲 沈阳药科大学基础部，沈阳 110015；范毅 沈阳东昂制药有限公司，沈阳 110003
关键词：pH薄层色谱法；离解常数；槐定碱；拉马宁碱
沈阳药科大学学报990111 摘 要 采用薄层色谱法对槐定碱和拉马宁碱的离解常数进行了测定，所得结果与文献值基本一致.该方法的特点是：若待测物质是难分离的混合物，可通过选择合适pH的固定相和展开剂，测其离解常数.
分类号 R657.7
The Detection of Dissociation Constants of Sophordine and Lehmannine by Thin-layer pH-Chromatography
, http://www.100md.com
Yuan Bo,Zhou Caiju,Wang Guoqing,Li Ling
Department of Basic Courses,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract The dissociation constant of acid or basic drugs is a very important parameter.In this article the dissociation constant of the two basic sophordine and lehmannine were detected by thin-layer pH-chromatography,and the results were basically compatible with those values in literature.The advatage of this method is that the separation of certain dissociating compounds,often very similar in character,can be in improved by suitable selection of the pH.
, 百拇医药
Key words thin-layer pH-chromatography;dissociation constant;sophordine;lehmannine
槐定碱和拉马宁碱是从豆科槐属植物的根或叶中提取的生物碱〔1～3〕.槐定碱具有抗癌〔4〕、抗菌〔5〕、抗心律失常〔6〕等多种作用.拉马宁碱具有明显的镇静作用〔7〕.离解常数是药物在生产、制剂、分析、储存及药物在体内吸收、分布、代谢等研究中的一个重要的理化参数.两种生物碱的离解常数的测定方法主要有电位滴定法〔8〕和紫外分光光度法〔9〕.本文采用pH薄层色谱法测定了槐定碱和拉马宁碱的离解常数，所得结果与其它测定方法基本一致.
1 方法与原理
pH薄层色谱法的原理是：待测物质在同一溶剂系统中展开，但每一次展开时，所用的固定相都用缓冲溶液调至不同的pH值，这样即可得到一系列Rf值.然后用Rf值和对应的pH值做图，就到该物质的Rf-pH曲线.依此曲线，不论该化合物是酸性还是碱性，都可测其离解常数.
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在分配色谱中，Rf值为组分配系数的函数.即：
(1)K:组分分配系数；Vs:固定相体积；Vm:流动相体积.
依据Golnmbic和Waksmundski的研究表明：碱性物质其分配系数是固定相[OH-]的函数：
(2)Kb：碱性物质的离解常数；K0：未离解碱的分配系数.
将(2)式代入(1)式整理得：
(3), 百拇医药
(3)式即为一元碱的Rf-pOH曲线方程，我们可利用(3)式来测定一元碱的pKb值.
在(3)式中，当[OH-]Kb时，
可略.此时 (4)Rf0：未离解碱的比移值.
Rf0值可从Rf-pOH曲线上求得.随着固定相[OH-]增加，Rf值将达到极限值，即趋于常数值.在曲线的这一部分，只要Rf值的变化小于实验误差，这个常数值就等于Rf0值.
(4)式经变换代入(3)式即得：
(5), http://www.100md.com
利用(5)式即可定量测定一元碱的离解常数.这其中有两种求法：一种是在Rf-pOH曲线上求拐点处的pOH值.对(5)进行两次微分后，结果为零，则得：
pKb=pOHinf1lg(1-Rf0) (6)
pOHinf1：Rf-pOH曲线拐点处的pOH值.该值可在Rf-pOH曲线上求出.依据式(5)知：pOHinf1在曲线上所对应的Rf=Rf0/2.另一种方法就是当Kb=[OH-]时，(5)式变为：
(7)此时Rf′所对应的pOH值即为pKb值.
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2 仪器与试剂
pH～3C型酸度计(上海第二分析仪器厂)；紫外检出器(アト～株式会社)；双槽层析缸.槐定碱和拉马宁碱(本校药剂教研室提供)；丙酮、环己烷、磷酸一氢钠、柠檬酸、氢氧化钠均为分析纯；硅胶G(青岛海洋化工厂).
3 方法与结果
3.1 铺板
取适量硅胶G，加入一定体积pH值不同的缓冲溶液浸泡1 h，待pH值不再改变后，用研钵研磨、铺板，室温下干躁，即是一系列pH不同的薄层板.
3.2 点样、展开和Rf值的测定
将适量的样品溶于丙酮中(2.00 mg/mL)，在距薄层板一端2 cm处，用定量点样器点样5 μL.用丙酮∶环己烷(2∶3)混合溶剂饱合0.5 h，然后展开约15 cm.取出薄层板，挥干溶剂，在UV检出器下观查斑点，测量Rf值.结果见表1.
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表1 槐定碱和拉马宁碱在不同薄层板上的Rf值 pOH
槐定碱
拉马宁碱
1.08
0.42
0.68
2.02
0.42
0.68
2.98
0.41
0.65
, http://www.100md.com 3.97
0.40
0.63
4.51
0.32
0.60
4.97
0.24
0.57
5.53
0.12
0.54
5.98
, http://www.100md.com
0.06
0.51
6.49
0.03
0.38
6.91
0.02
0.12
7.98
0.01
0.05
8.49
0.01
, 百拇医药
0.03
9.01
0.01
0.02
3.3 Rf-pOH曲线绘制及槐定碱、拉马宁碱离解常数测定结果
图1 槐定碱和拉马宁碱的Rf-pOH的曲线
1—槐定碱；2—拉马宁碱
将表1所列数据作图，即得Rf-pOH曲线，见图1.
由Rf-pOH曲线和(6)式或(7)式即得槐定碱和拉马宁碱的pKb值.见表2.
, 百拇医药
4 讨论
a.本实验的关键是要选择合适的溶剂系统.选择溶剂系统要满足下列条件：Rf0值不能接近1，否则误差较大；当pOH接近7时，Rf值应接近零，表明碱完全离解而不进入流动相.
b.溶剂系统要密闭，以保证实验条件一致.
c.固定相pH值要严格控制，误差范围应在(±0.02)pH单位，尤其在曲线急剧变化处对曲线形状影响较大.
d.本方法的优点是：在样品纯度较低的情况下，也可得到满意的结果.
表2 槐定碱和拉马宁碱的pKb测定值和文献值 样品
Rf0
, 百拇医药
pOHinf1
pKb
Rf′
pKb
pK8b
槐定碱
0.42
5.15
4.91
0.26
4.90
5.02
, http://www.100md.com
拉马宁碱
0.68
6.55
6.05
0.52
5.93
6.03
e.只要选择合适pH值的缓冲溶液和溶剂系统，该方法也可测定酸的离解常数.
参考文献
[1] 赵博光.苦斗草生物碱的研究.药学学报，1980，15(3)：182～183
[2] 赵博光，严照金，杨绪，等.苦斗草生物碱甲苯提取分离生产工艺的研究.中草药，1980，11(8)：350～352
, 百拇医药
[3] 王中效，杜盐平.苦斗子中Lehmannine生物碱的鉴定.中草药,1986,17(6)：44
[4] 李雪梅，吴运光，陈绍励.槐定的抗癌作用.中国药理学报，1987，8(2)：153～158
[5] 仲仁山.苦斗子的研究与应用.银川：宁夏人民出版社，1983.2～4
[6] 蔚中民，刘国隆，施学筠.槐定碱的抗心律失常作用的电生理学研究.北京中医学院学报,1984，(6)：38～40
[7] 张青，袁惠南，王中效.苦斗子的药理研究Lehmannine的镇静作用.药物分析杂志，1987，7(2)：110～112
[8] 王国清，于定开，周润亚.电位法测定槐定碱和拉马宁碱的电离常数.沈阳药学院学报，1991，8(3)：215～216
[9] 王国清，周润亚.紫外分光光度法测定葛根黄豆甙元的电离常数.沈阳药学院学报，1992，9(1)：63～65
[10] M Bidlo.Thin-layer pH-chromatography of mono and dibasic organic acids on buffered silica gel layers.Acta Chim(Budapest),1976，88(2)：115～123
收稿日期:1998-07-20, 百拇医药