氨甲酰-妥布霉素产生菌的高产菌株筛选
作者：张怡轩 白秀峰 何建勇 王明琳
单位：沈阳药科大学制药系，沈阳 110015
关键词：氨甲酰-妥布霉素；尼拉霉素因子5′；黑暗链霉菌；诱变
沈阳药科大学学报990113 摘 要 以黑暗链霉菌Streptomyce tenebrarius 163为出发菌株，应用磁场、磁场复合吖啶橙、耐受氨甲酰-妥布霉素、磁场复合耐受氨甲酰-妥布霉素筛选得到5株高产菌株，经摇瓶发酵复筛后表明，其总效价与氨甲酰-妥布霉素均比出发菌株提高了25%以上.
分类号 R97
The Screening of High-Yielding Carbamoyltobramycin Strains
Zhang Yixuan,Bai Xiufeng,He Jianyong,Wang Minglin
, http://www.100md.com
Department of Pharmaceutics,Shenyang Pharmaceutical Universtiy,Shenyang 110015
Abstract A tobramycin-producing strain,Strepomyces tenebrarius 163 was mutated by magnetic field，magnetic field combined with acriding and resisted by carbamoyltobramycin,carbamoyltobramycin combined with magnetic field.Several high-yielding mutants were screened out.After flask rescreening,it is indicated that these mutants′ potency and the percentage of carbamoyltobramycin increased by above 25% than those of the parent strain.
, 百拇医药
Key words carbamoyltobramycin；nebramycin factor 5′;Strepomyces tenebraruis;mutation
妥布霉素是美国礼莱公司1969年自一株黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)的发酵液中分离到的尼拉霉素(nebramycin)复合物中的组分6，美国最初报道黑暗链霉菌产生的尼拉霉素组分甚多，有1，1′，2，3，4，5，5′，6，7，8，9，10，11，12，13等15种组分.现在国内用于生产妥布霉素的菌株只产生组分2(安普霉素)和组分5′(6″-0-氨甲酰-妥布霉素，CTB)，妥布霉素是由6″-0-氨甲酰-妥布霉素经碱水解而得到的〔1〕.目前，美、英、日、中、匈等国家生产妥布霉素.
妥布霉素是世界上使用最广泛的第二代氨基糖苷类抗生素之一.该品对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有效，对吲哚阳性变形杆菌、克氏气杆菌、假单孢菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌亦有很强抗菌活性，特别是对绿脓杆菌抗菌活性更强(比庆大霉素强2～4倍)，且对庆大霉素耐药的部分绿脓杆菌有效且毒性更低.硫酸妥布霉素(商品名Nebcin)用于治疗呼吸道感染、皮肤、软组织和骨、尿道和腹内感染、败血症等的总有效率在85%以上〔2〕.妥布霉素亦可用于治疗严重的G+、G-菌引起的混合感染，与羧苄青霉素合用抗绿脓杆菌有协同作用.妥布霉素对第八对脑神经的耳毒性比新霉素、庆大霉素等低得多.
, 百拇医药
妥布霉素为一白色粉末，碱性，有吸湿性，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙酸乙酯和氯仿.妥布霉素在室温及37℃、pH3～11时稳定，其溶液在热压器中加热20 min不失抗菌活性，无紫外吸收，有典型的氨基糖苷类紫外吸收光谱，其结构式见图1.
图1 氨甲酰-妥布霉素的结构式
国内妥布霉素产生菌产生二个组分2、5′，由于提取、精制的步骤复杂，成本较高，制约妥布霉素生产和应用，因此，筛选总效价及组分5′含量高的优良菌株对妥布霉素的生产无疑具有重要的意义.据文献报道，磁场对微生物的生长繁殖有较大的影响，可以改变微生物的生长情况〔3〕；通过抗自身代谢产物可以提高抗生素的产量〔4〕.本实验采取上述方法处理出发菌株，获得产氨甲酰-妥布霉素组分5及总效价高的高产菌株.
, 百拇医药 1 材料与方法
1.1 菌种
出发菌株为黑暗链霉菌163(S.tenebrarius 163)，总效价为3 900 μ/mL，氨甲酰-妥布霉素组分含量为45%；检定菌株为枯草芽孢杆菌(B.subtilis1.339)和金黄色葡萄球菌，用于生物效价测定及薄层法生物显影，确定组分.
1.2 培养基
斜面及分离培养基：高氏1号合成培养基.
种子培养基：葡萄糖，蛋白胨，酵母膏，氯化钠.
发酵培养基：葡萄糖，黄豆饼粉，花生饼粉，玉米淀粉，硫酸镁，硫酸铵，碳酸钙等.
1.3 诱变方法
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1.3.1 磁场诱变处理
吸取单孢子悬浮液0.8 mL于内径为5 mm小玻璃管内，置于7 000 GS磁场中，37℃振摇16 h，然后稀释涂布在分离培养基的平板上，37℃避光培养.
1.3.2 磁场复合吖啶橙诱变处理
将经过磁场诱变处理的孢子悬浮液稀释涂布在含一定浓度的吖啶噔的分离培养基平板上，37℃避光培养.
1.3.3 耐受自身产物的处理
将孢子悬浮液稀释涂布在含有一定浓度的氨甲酰-妥布霉素的分离培养基平板上，37℃避光培养.
1.4 筛选
1.4.1 点种
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分离培养基平板上长好的菌落用牙签点种于预先铺好的分离培养基平板上，每个菌落点种2次，并做好编号.每次诱变处理至少要点种100个菌落.经点种的分离培养基平板于37℃避光培养2～3天.
1.4.2 打块，保湿培养
将经点种的分离培养基平板上刚刚长好的菌落打块，放在无菌空平皿上，编号，37℃避光保湿培养至菌落成熟，孢子丰满.
1.4.3 固体初筛
将保湿培养得到的源于同一菌落的琼脂块分别放在混有枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的检定盘上，37℃培养18 h.设在枯草芽孢杆菌检定盘上抑菌圈直径为D1，在金黄色葡萄球菌的检定盘上抑菌圈直径为D2，选取二者直径大的菌株，即得到总效价及氨甲酰-妥布霉素组分含量高的菌株传母斜面，37℃避光培养.
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1.4.4 发酵初、复筛
将成熟母斜面的菌株全部上摇瓶发酵，选取总效价及氨甲酰-妥布霉素组分含量高的菌株传子斜面，再进行摇瓶复筛.方法同上.
1.5 总效价测定
采用生物测定法.初筛用单剂量纸片法.复筛用二剂量管蝶法(参照中国药典1995年版二部附录).
1.6 组分测定
采用硅胶G薄层层析法测定发酵液中活性物质的组分.溶剂系统为丁酮∶乙醇∶氨水(1∶1∶1).展层完毕，取出，吹干，扣在表面铺有定量滤纸的检定盘上，30分钟后取下，37℃培养16～18 h.比较两个组分所产生的抑菌圈面积大小，计算氨甲酰-妥布霉素组分的含量.
2 实验结果
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2.1 磁场诱变处理
磁场已经在医学、农业、环境保护和生物工程等方面得到广泛的应用，我室首先将其用于麦迪霉素、庆大霉素的研究中，均得到了高产菌株〔5〕.根据磁场诱变剂量与死亡率的关系的预实验，确定7 000 GS磁场强度为诱变剂量，该剂量的菌种死亡率为78.9%，光秃型菌落出现频率为13.6%.
2.2 磁场复合吖啶橙诱变处理
文献报道〔6〕，在黑暗链霉菌的高产菌株筛选中，添加不影响微生物生长的氮蒽类染料，可以引起几乎所有的菌株产生的复合物含量比例的改变.S.cremeus Var.tob菌株筛选的分离培养基中加入0.5～2 μg/mL吖啶橙，可使组分2(安普霉素)被抑制50%，而组分5′(氨甲酰-妥布霉素)可提高15%～20%.另外，王鲁燕〔7〕在妥布霉素高产菌株筛选中使用了吖啶橙(0.5 μg/mL)取得了较好结果，因此本实验决定用磁场复合吖啶橙进行诱变处理.
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表1 分离平板中吖啶橙的剂量
对菌种S.tenebrarius 163生长的影响 吖啶橙剂量C/μg\5mL-1
0.2
0.5
1.0
2.0
死亡率/%
11.0
12.7
18.4
26.3
光秃型菌落出现频率/%
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16.7
17.3
19.2
27.6
首先确定分离培养基中吖啶橙的剂量，结果(见表1)显示，吖啶橙在0.2～1.0 μg/mL浓度之间菌种死亡率较低，且变化不大，对生长无明显影响.当用上述浓度吖啶橙和磁场做复合处理时，菌种死亡率为87.6%～93.4%，而用2.0 μg/mL吖啶橙处理时，菌种死亡率高达99.6%以上，故选定分离培养基中吖啶橙的剂量为1.0 μg/mL与磁场复合处理菌种，结果见表2.
2.3 耐受自身产物——氨甲酰-妥布霉素的处理
2.3.1 固体耐受氨甲酰-妥布霉素
固体耐受氨甲酰-妥布霉素剂量的确定，见表3.
, 百拇医药
结果显示，固体耐受氨甲酰-妥布霉素剂量增大，菌株生长速度减慢.如培养至第三天，可见耐受1000 μ/mL的分离平板上菌落长出，第四天耐受2000 μ/mL的菌落长出；到第六天和第八天才可见有极少数的菌落在耐受3000 μ/mL、4000 μ/mL的分离平板上长出.随着耐受剂量的提高，菌株死亡率增大，光秃型菌株出现频率增高，且菌株形态变异率高.故选择固体耐受剂量为2 000μ/mL来处理S.tenebrarus 163，筛选结果见表2.
2.3.2 磁场复合耐受自身产物的处理
将磁场7 000GS处理16 h的单孢子悬浮液涂布在含有氨甲酰-妥布霉素1 500 μ/mL的分离平板上，菌种死亡率达95.0%，筛选结果见表2.
各种处理方法筛选结果见表2. 表2 各种处理方法得到的菌株筛选结果 菌株编号
总效价提高百分率/%
, 百拇医药
CTB提高百分率/%
菌株编号
总效价提高百分率/%
CTB提高百分率/%
MF*-030
32.8
14.8
MFAO-129
76.6
27.5
MF-006
41.4
, 百拇医药
15.5
RT***-032
2.3
26.6
< MF-118
11.5
16.2
RT-009
18.6
19.4
< MF-114
34.0
, 百拇医药
14.0
RT-024
-11.2
25.5
< MF-241
15.5
15.8
RT-115
8.5
24.7
< MFAO**-037
17.4
, 百拇医药
21.7
RT-105
33.7
25.1
< MFAO-073
22.2
26.6
RT-223
3.8
32.4
< MFAO-105
64.0
35.4
, 百拇医药
RT-224
14.5
20.3
< MFAO-108
29.9
11.3
MFRT****-213
36.6
28.1
< MFAO-128
66.5
-3.9
, 百拇医药
MFRT-216
33.6
38.2
*磁场诱变筛选得到的菌株；**磁场复合吖啶橙筛选得到的菌株；
***耐受氨甲酰-妥布霉素筛选得到的菌株；****磁场复合耐受氨甲酰-妥布霉素筛选得到的菌株表3 不同剂量氨甲酰-妥布霉素
对S.tenebrarius 163的处理结果 剂量C/μ\5mL-1
死亡率/%
光秃型出现频率/%
500
21.7
, 百拇医药
11.3
1000
66.5
18.2
2000
91.7
25.4
3000
95.8
37.6
4000
99.9
55.1
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3 讨论
a.本实验所用到的各种处理方法，从筛选结果看，应用磁场诱变处理菌种，总效价提高幅度要高于CTB提高的幅度；磁场复合吖啶橙处理菌种，总效价、CTB含量可再提高一步，得到MFAO-105、MFAO-129等较好的菌株，它们的总效价、CTB含量均提高了64.0%和27.5%；耐受自身产物处理菌种，CTB组分的提高幅度要大于效价提高幅度，CTB含量提高20%～30%，而总效价只提高了10%～20%；当磁场和耐受自身产物复合处理时，两种处理因子对高产菌株的筛选有协同作用，即总效价和CTB的含量均有较大幅度提高，如MFRT-213的总效价提高了36.6%，CTB含量提高了28.1%，MFRT-216总效价提高了33.6%，CTB组分含量提高了38.2%，用以上这种方法处理得到了比较满意的高产菌株，其总效价可达6500 μ/mL以上，CTB组分含量可达80%以上.
b.本实验固体筛选用到的金黄色葡萄球菌是经过诱变处理得到的具有耐受安普霉素、而对氨甲酰-妥布霉素敏感的菌株，该菌株最高可耐受4 000 μ/mL安普霉素而不产生抑菌圈，对妥布霉素敏感，在含1 000 μ/mL妥布霉素的平板上可产生直径为15～19 mm的抑菌圈.因此，在固体筛选过程中只要挑取在金黄色培养球菌和枯草杆菌检定盘上抑菌圈直径都大的菌落就可以筛选到高效价、高CTB组分的菌株.事实上，表2中所列的菌株都是经过这一步骤筛选得到的.
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参考文献
[1] Koch KF,Davis FA,Rhoades JA.Nebramycin:Separation of this complex and indentification of factors 4,5,and 5′ .The Joural of Antibiotics,1973，26(12)：745～751
[2] 刘诗通.妥布霉素(综述).国外医药抗生素分册，1987，8(5)：346～354
[3] 李国栋.生物磁学及应用.北京：科学出版社，1983.42～50
[4] 熊宗贵.抗生素生物合成及其调控.沈阳：沈阳药科大学出版社,1987.40～42
[5] 白秀峰，张怡轩.磁场在菌中选育中的应用，97′庐山全国微生物学会论文集，庐山.1996.9～10
, 百拇医药
[6] О А Лапчинская,Н А Лъвова,О П Синягниа,et al. ДЕйСТВИЕ АКРИДИНОВЫХ КРАСИТЕЛЕй НАОбРА30ВАНИ
Е АНТ БНОТНКА ПИГМЕНТА И В03 ДУШНОГО МИЦЕЛНЯ У СТРЕПТОМИЦЕТОВ—ПРОДЕНТОВ
МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ АНТИБИОТИКОВ.Antibiotoki,1981，26(11)：809～813
[7] 王鲁艳.妥布拉霉素高产菌株的筛选.中国药科大学学报，1994，25(2)：120～122
收稿日期:1998-07-09, 百拇医药
单位：沈阳药科大学制药系，沈阳 110015
关键词：氨甲酰-妥布霉素；尼拉霉素因子5′；黑暗链霉菌；诱变
沈阳药科大学学报990113 摘 要 以黑暗链霉菌Streptomyce tenebrarius 163为出发菌株，应用磁场、磁场复合吖啶橙、耐受氨甲酰-妥布霉素、磁场复合耐受氨甲酰-妥布霉素筛选得到5株高产菌株，经摇瓶发酵复筛后表明，其总效价与氨甲酰-妥布霉素均比出发菌株提高了25%以上.
分类号 R97
The Screening of High-Yielding Carbamoyltobramycin Strains
Zhang Yixuan,Bai Xiufeng,He Jianyong,Wang Minglin
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Department of Pharmaceutics,Shenyang Pharmaceutical Universtiy,Shenyang 110015
Abstract A tobramycin-producing strain,Strepomyces tenebrarius 163 was mutated by magnetic field，magnetic field combined with acriding and resisted by carbamoyltobramycin,carbamoyltobramycin combined with magnetic field.Several high-yielding mutants were screened out.After flask rescreening,it is indicated that these mutants′ potency and the percentage of carbamoyltobramycin increased by above 25% than those of the parent strain.
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Key words carbamoyltobramycin；nebramycin factor 5′;Strepomyces tenebraruis;mutation
妥布霉素是美国礼莱公司1969年自一株黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)的发酵液中分离到的尼拉霉素(nebramycin)复合物中的组分6，美国最初报道黑暗链霉菌产生的尼拉霉素组分甚多，有1，1′，2，3，4，5，5′，6，7，8，9，10，11，12，13等15种组分.现在国内用于生产妥布霉素的菌株只产生组分2(安普霉素)和组分5′(6″-0-氨甲酰-妥布霉素，CTB)，妥布霉素是由6″-0-氨甲酰-妥布霉素经碱水解而得到的〔1〕.目前，美、英、日、中、匈等国家生产妥布霉素.
妥布霉素是世界上使用最广泛的第二代氨基糖苷类抗生素之一.该品对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有效，对吲哚阳性变形杆菌、克氏气杆菌、假单孢菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌亦有很强抗菌活性，特别是对绿脓杆菌抗菌活性更强(比庆大霉素强2～4倍)，且对庆大霉素耐药的部分绿脓杆菌有效且毒性更低.硫酸妥布霉素(商品名Nebcin)用于治疗呼吸道感染、皮肤、软组织和骨、尿道和腹内感染、败血症等的总有效率在85%以上〔2〕.妥布霉素亦可用于治疗严重的G+、G-菌引起的混合感染，与羧苄青霉素合用抗绿脓杆菌有协同作用.妥布霉素对第八对脑神经的耳毒性比新霉素、庆大霉素等低得多.
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妥布霉素为一白色粉末，碱性，有吸湿性，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙酸乙酯和氯仿.妥布霉素在室温及37℃、pH3～11时稳定，其溶液在热压器中加热20 min不失抗菌活性，无紫外吸收，有典型的氨基糖苷类紫外吸收光谱，其结构式见图1.
图1 氨甲酰-妥布霉素的结构式
国内妥布霉素产生菌产生二个组分2、5′，由于提取、精制的步骤复杂，成本较高，制约妥布霉素生产和应用，因此，筛选总效价及组分5′含量高的优良菌株对妥布霉素的生产无疑具有重要的意义.据文献报道，磁场对微生物的生长繁殖有较大的影响，可以改变微生物的生长情况〔3〕；通过抗自身代谢产物可以提高抗生素的产量〔4〕.本实验采取上述方法处理出发菌株，获得产氨甲酰-妥布霉素组分5及总效价高的高产菌株.
, 百拇医药 1 材料与方法
1.1 菌种
出发菌株为黑暗链霉菌163(S.tenebrarius 163)，总效价为3 900 μ/mL，氨甲酰-妥布霉素组分含量为45%；检定菌株为枯草芽孢杆菌(B.subtilis1.339)和金黄色葡萄球菌，用于生物效价测定及薄层法生物显影，确定组分.
1.2 培养基
斜面及分离培养基：高氏1号合成培养基.
种子培养基：葡萄糖，蛋白胨，酵母膏，氯化钠.
发酵培养基：葡萄糖，黄豆饼粉，花生饼粉，玉米淀粉，硫酸镁，硫酸铵，碳酸钙等.
1.3 诱变方法
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1.3.1 磁场诱变处理
吸取单孢子悬浮液0.8 mL于内径为5 mm小玻璃管内，置于7 000 GS磁场中，37℃振摇16 h，然后稀释涂布在分离培养基的平板上，37℃避光培养.
1.3.2 磁场复合吖啶橙诱变处理
将经过磁场诱变处理的孢子悬浮液稀释涂布在含一定浓度的吖啶噔的分离培养基平板上，37℃避光培养.
1.3.3 耐受自身产物的处理
将孢子悬浮液稀释涂布在含有一定浓度的氨甲酰-妥布霉素的分离培养基平板上，37℃避光培养.
1.4 筛选
1.4.1 点种
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分离培养基平板上长好的菌落用牙签点种于预先铺好的分离培养基平板上，每个菌落点种2次，并做好编号.每次诱变处理至少要点种100个菌落.经点种的分离培养基平板于37℃避光培养2～3天.
1.4.2 打块，保湿培养
将经点种的分离培养基平板上刚刚长好的菌落打块，放在无菌空平皿上，编号，37℃避光保湿培养至菌落成熟，孢子丰满.
1.4.3 固体初筛
将保湿培养得到的源于同一菌落的琼脂块分别放在混有枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的检定盘上，37℃培养18 h.设在枯草芽孢杆菌检定盘上抑菌圈直径为D1，在金黄色葡萄球菌的检定盘上抑菌圈直径为D2，选取二者直径大的菌株，即得到总效价及氨甲酰-妥布霉素组分含量高的菌株传母斜面，37℃避光培养.
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1.4.4 发酵初、复筛
将成熟母斜面的菌株全部上摇瓶发酵，选取总效价及氨甲酰-妥布霉素组分含量高的菌株传子斜面，再进行摇瓶复筛.方法同上.
1.5 总效价测定
采用生物测定法.初筛用单剂量纸片法.复筛用二剂量管蝶法(参照中国药典1995年版二部附录).
1.6 组分测定
采用硅胶G薄层层析法测定发酵液中活性物质的组分.溶剂系统为丁酮∶乙醇∶氨水(1∶1∶1).展层完毕，取出，吹干，扣在表面铺有定量滤纸的检定盘上，30分钟后取下，37℃培养16～18 h.比较两个组分所产生的抑菌圈面积大小，计算氨甲酰-妥布霉素组分的含量.
2 实验结果
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2.1 磁场诱变处理
磁场已经在医学、农业、环境保护和生物工程等方面得到广泛的应用，我室首先将其用于麦迪霉素、庆大霉素的研究中，均得到了高产菌株〔5〕.根据磁场诱变剂量与死亡率的关系的预实验，确定7 000 GS磁场强度为诱变剂量，该剂量的菌种死亡率为78.9%，光秃型菌落出现频率为13.6%.
2.2 磁场复合吖啶橙诱变处理
文献报道〔6〕，在黑暗链霉菌的高产菌株筛选中，添加不影响微生物生长的氮蒽类染料，可以引起几乎所有的菌株产生的复合物含量比例的改变.S.cremeus Var.tob菌株筛选的分离培养基中加入0.5～2 μg/mL吖啶橙，可使组分2(安普霉素)被抑制50%，而组分5′(氨甲酰-妥布霉素)可提高15%～20%.另外，王鲁燕〔7〕在妥布霉素高产菌株筛选中使用了吖啶橙(0.5 μg/mL)取得了较好结果，因此本实验决定用磁场复合吖啶橙进行诱变处理.
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表1 分离平板中吖啶橙的剂量
对菌种S.tenebrarius 163生长的影响 吖啶橙剂量C/μg\5mL-1
0.2
0.5
1.0
2.0
死亡率/%
11.0
12.7
18.4
26.3
光秃型菌落出现频率/%
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16.7
17.3
19.2
27.6
首先确定分离培养基中吖啶橙的剂量，结果(见表1)显示，吖啶橙在0.2～1.0 μg/mL浓度之间菌种死亡率较低，且变化不大，对生长无明显影响.当用上述浓度吖啶橙和磁场做复合处理时，菌种死亡率为87.6%～93.4%，而用2.0 μg/mL吖啶橙处理时，菌种死亡率高达99.6%以上，故选定分离培养基中吖啶橙的剂量为1.0 μg/mL与磁场复合处理菌种，结果见表2.
2.3 耐受自身产物——氨甲酰-妥布霉素的处理
2.3.1 固体耐受氨甲酰-妥布霉素
固体耐受氨甲酰-妥布霉素剂量的确定，见表3.
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结果显示，固体耐受氨甲酰-妥布霉素剂量增大，菌株生长速度减慢.如培养至第三天，可见耐受1000 μ/mL的分离平板上菌落长出，第四天耐受2000 μ/mL的菌落长出；到第六天和第八天才可见有极少数的菌落在耐受3000 μ/mL、4000 μ/mL的分离平板上长出.随着耐受剂量的提高，菌株死亡率增大，光秃型菌株出现频率增高，且菌株形态变异率高.故选择固体耐受剂量为2 000μ/mL来处理S.tenebrarus 163，筛选结果见表2.
2.3.2 磁场复合耐受自身产物的处理
将磁场7 000GS处理16 h的单孢子悬浮液涂布在含有氨甲酰-妥布霉素1 500 μ/mL的分离平板上，菌种死亡率达95.0%，筛选结果见表2.
各种处理方法筛选结果见表2. 表2 各种处理方法得到的菌株筛选结果 菌株编号
总效价提高百分率/%
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CTB提高百分率/%
菌株编号
总效价提高百分率/%
CTB提高百分率/%
MF*-030
32.8
14.8
MFAO-129
76.6
27.5
MF-006
41.4
, 百拇医药
15.5
RT***-032
2.3
26.6
< MF-118
11.5
16.2
RT-009
18.6
19.4
< MF-114
34.0
, 百拇医药
14.0
RT-024
-11.2
25.5
< MF-241
15.5
15.8
RT-115
8.5
24.7
< MFAO**-037
17.4
, 百拇医药
21.7
RT-105
33.7
25.1
< MFAO-073
22.2
26.6
RT-223
3.8
32.4
< MFAO-105
64.0
35.4
, 百拇医药
RT-224
14.5
20.3
< MFAO-108
29.9
11.3
MFRT****-213
36.6
28.1
< MFAO-128
66.5
-3.9
, 百拇医药
MFRT-216
33.6
38.2
*磁场诱变筛选得到的菌株；**磁场复合吖啶橙筛选得到的菌株；
***耐受氨甲酰-妥布霉素筛选得到的菌株；****磁场复合耐受氨甲酰-妥布霉素筛选得到的菌株表3 不同剂量氨甲酰-妥布霉素
对S.tenebrarius 163的处理结果 剂量C/μ\5mL-1
死亡率/%
光秃型出现频率/%
500
21.7
, 百拇医药
11.3
1000
66.5
18.2
2000
91.7
25.4
3000
95.8
37.6
4000
99.9
55.1
, 百拇医药
3 讨论
a.本实验所用到的各种处理方法，从筛选结果看，应用磁场诱变处理菌种，总效价提高幅度要高于CTB提高的幅度；磁场复合吖啶橙处理菌种，总效价、CTB含量可再提高一步，得到MFAO-105、MFAO-129等较好的菌株，它们的总效价、CTB含量均提高了64.0%和27.5%；耐受自身产物处理菌种，CTB组分的提高幅度要大于效价提高幅度，CTB含量提高20%～30%，而总效价只提高了10%～20%；当磁场和耐受自身产物复合处理时，两种处理因子对高产菌株的筛选有协同作用，即总效价和CTB的含量均有较大幅度提高，如MFRT-213的总效价提高了36.6%，CTB含量提高了28.1%，MFRT-216总效价提高了33.6%，CTB组分含量提高了38.2%，用以上这种方法处理得到了比较满意的高产菌株，其总效价可达6500 μ/mL以上，CTB组分含量可达80%以上.
b.本实验固体筛选用到的金黄色葡萄球菌是经过诱变处理得到的具有耐受安普霉素、而对氨甲酰-妥布霉素敏感的菌株，该菌株最高可耐受4 000 μ/mL安普霉素而不产生抑菌圈，对妥布霉素敏感，在含1 000 μ/mL妥布霉素的平板上可产生直径为15～19 mm的抑菌圈.因此，在固体筛选过程中只要挑取在金黄色培养球菌和枯草杆菌检定盘上抑菌圈直径都大的菌落就可以筛选到高效价、高CTB组分的菌株.事实上，表2中所列的菌株都是经过这一步骤筛选得到的.
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收稿日期:1998-07-09, 百拇医药