肝细胞肿瘤患者癌组织中HBx基因的检测
作者：周 青 刘 虎 汪 渊 李 旭 刘建辉
单位：
周 青 刘 虎 汪 渊 刘建辉 安徽医科大学分子生物学实验室、生物化学教研室，安徽 合肥 230032；李 旭 安徽医科大学附属医院传染科
关键词：乙型肝炎病毒(HBV)；肝细胞肿癌(HCC)；聚合酶链式反应；HBx
疾病控制杂志990113
【摘要】 目的 通过检测肝细胞肿瘤(HCC)患者癌组织中HBx基因探讨乙型肝炎病毒(HBV)在HCC中的重要性。方法 根据HBx基因DNA序列设计引物，采用特异性聚合酶链式反应(PCR)对31例病理确诊并经手术切除后的HCC患者癌组织进行了检测，同时采用PCR方法检测了同一患者血清HBV DNA。 结果 PCR显示31例HCC患者癌组织中HBx基因和血清中HBV DNA的阳性率分别为77.4%(24/31)和32.3%(10/31)。结论 HBx基因片段广泛存在于HCC患者癌组织中并且在癌细胞中可能存在整合。
, 百拇医药
【中图分类号】 R373.2； R735.709 【文献标识码】 A 【文章编号】 1008-6013(1999)01-0033-02
Detection of the HBx gene in the tissue of HCC patients
Zhou Qing, Liu Hu, Wang Yuan, Li Xu, Liu Jianhui.
Laboratory of Molecular Biology and Department of Biochemistry, Anhui Medical University, Hefei 230032,China
【Abstract】 Objective In order to explore the significant roles that hepatitis B virus(HBV) plays in hepatocellular carcinoma(HCC), the HBx gene in the tissue of HCC patients is examined. Methods According to the DNA sequence of the HBx gene, 3′ specific polymerase chain reaction(PCR) is applied to examine the 31 patients′ tissues whose tumors have been surgically excised and pathologically diagnosed, and to examine the HBV DNA in the serum. Results The positive rates of HBx gene in the 31 patients′ tissues and the HBV DNA in the serum are 77.4%(24/31) and 32.3%(10/31) respectively. Conclusions The HBx gene exists in the tissues of HCC patients in a wide range. There may be an integration of the HBx gene in the genome of liver cells.
, 百拇医药
【Key words】 hepatitis B virus; hepatocellular carcinoma; polymerase chain reaction(PCR); HBx
中国是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高发地区，而肝细胞肿瘤(HCC)患者与HBV的长期感染有关。有关资料表明HBV在人体肝细胞内存在整合[1]。特别是HBV四个基因中的x基因具有反式激活作用，与HCC的发生密切相关[2]。根据HBx基因DNA序列设计引物，采用聚合酶链式反应(PCR)测定了31例HCC患者手术后癌组织中HBx基因片段，同时采用PCR方法检测了同一患者血清中HBV DNA。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器 引物由上海生工生物工程有限公司合成；Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、蛋白酶K、PCR缓冲液等购自华美生物工程公司，其他试剂均为国产分析纯；Hema 480基因扩增仪为珠海黑马医学仪器有限公司产品。
, 百拇医药
1.2 标本选择 31例肝癌组织取自安徽医科大学附属医院外科HCC患者手术标本并经病理证实，以及患者术前血清标本。
1.3 肝癌基因组DNA的提取 取肝癌组织200 μg，加入500 μl DNA提取液(100 mmol。L-1 NaCl, 1 mmol。L-1 EDTA， 0.5% SDS， 50 mmol。L-1 Tris-HCl,pH 8.0)，4℃冰浴中匀浆后加入50 μl 2 g。L-1蛋白酶K，置37℃消化6 h，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀基因组DNA，干燥后溶于100 μl dH2O中，经260 nm比色计算DNA含量，用dH2O稀释至250 ng。μl-1备用。
1.4 血清HBV DNA的提取 待检血清125 μl加入125 μl HBV DNA提取液(200 mmol。L-1 NaCl, 2 mmol。L-1 EDTA， 1% SDS，100 mmol。L-1 Tris-HCl,pH 8.0)，2 g。L-1蛋白酶K 6.25 μl，37℃消化6 h，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀HBV DNA，溶于20 μl dH2O中备用[3]。
, 百拇医药
1.5 PCR分析 根据HBV DNA序列设计x区引物：YW-Ⅱ-1H∶5′ TGT GCA CTT CGC TTC ACC TCT和YW-Ⅱ-1J∶5′ TGA ACA GAC CAA TTT ATG CCT。在1 μg肝癌细胞基因组DNA中加入PCR反应液(10 mmol。L-1 Tris,50 mmol。L-1 KCl， 2 mmol。L-1 MgCl, 0.001% Gelatin, 200 μmmol。L-1 dNTPs, 0.5 μmmol。L-1引物和Taq DNA聚合酶)，置PCR仪中93℃变性1 min，61℃复性1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃ 5 min结束反应。同时采用PCR的方法测定了同一患者血清中HBV DNA。
2 结果
, 百拇医药
根据HBx基因序列所设计特异性核苷酸引物，经PCR扩增以后取PCR产物8 μl加入含有溴化乙锭的2.5%琼脂糖中进行电泳。经与100 bp DNA Marker比较以出现230 bp特异性扩增条带为阳性结果。为排除污染每次均设HBV阴性以及阳性对照(图1)。我们用此法检测了31例HCC患者术后癌组织中HBx基因，发现24例阳性，阳性率为77.4%(24/31)。血清HBV DNA阳性率为32.2%(10/31)。在24例癌组织HBx基因阳性的患者中，血清HBV DNA阳性占37.5%(9/24)，阴性占58.3%(14/24)。
图1 PCR分析HBx基因电泳图谱
1～7：样品编号 8：阴性对照 9：阳性对照 10：100 bp DNA标志物
3 讨论
, 百拇医药
HBV感染是严重影响人类健康的传染性疾病，许多研究表明HBV与肝癌的发生密切相关，是引发肝癌的危险因素之一。Robinson等[4]认为HCC组织中有HBV的存在，80%～90%的HCC组织中整合有HBV DNA，而在HBV四个基因中HBx基因被认为是致癌基因[5]，因此研究HBx基因在肝细胞中的存在状态是非常重要的。本研究表明，31例HCC患者中有24例癌组织中存在HBx基因，阳性率为77.4%，说明HBx基因广泛存在于HCC患者癌组织中，在HCC的发生发展过程中可能起到一定的作用。在24例癌组织HBx基因阳性的患者中有9例外周血中检出HBV DNA，另外14例外周血中HBV DNA为阴性，说明HCC患者肝细胞中的HBV DNA可能以游离和整合两种形式存在。表现为一些HCC患者体内既有游离型的也有整合的HBV DNA；一些HCC患者癌细胞中可能只存在整合的HBx基因。游离型病毒复制活跃，外周血中可以检出，而整合型病毒无明显的复制。
目前人体血清HBsAg被广泛应用于临床诊断HBV的感染，但是临床实践和流行病学调查发现HBV感染后会出现一些特殊的血清学现象，如HBsAg阴性而HBV DNA阳性[6]。我们的研究表明血清HBV DNA阴性也不能排除曾经感染过HBV，因为HBV基因可能整合在肝细胞中，在疾病的发生发展过程中发挥作用。
, 百拇医药
基金项目：安徽省教委自然科学研究重点课题(JL96-077)；
安徽省自然科学研究基金资助课题(9741006)
作者简介：周 青，男，35岁，实验师
汪 渊，男，40岁，硕士，教授，硕士生导师
参考文献
[1] 邹 伟，张昭成，牛兆山.人肝细胞癌及癌旁肝组织HBV DNA的原位杂交检测.青岛医学院学报，1997，33(4)：313～314.
[2] Kekule AS, Lauer U, Weiss L. Hepatitis B virus transactivator HBx uses a tumor promoter signalling pathway. Nature, 1993，353：361～742.
, http://www.100md.com
[3] 汪 渊，李 旭，周 青.乙型肝炎病毒前C区1896位点突变的研究.安徽医科大学学报， 1998，33(4)：251～252.
[4] Robinson WS, Klote L, Aoki N. Hepadanaviruses in cirrhotic liver and hepatocellular carcinoma. J Med Virol, 1990，31(1):318～325.
[5] Chang MK, Kazuhiko K, Lzumu S, et al. HBx gene of hepatitis B virus induces liver cancer in transgenic mice. Nature, 1991，351:347.
[6] Zhang YY, Hanssan BG, Guo LS, et al. Hepatitis B virus DNA in serum and liver is commonly found in Chinese patients with chronic liver disease despite the presence of antibodies to HBsAg. Hepatology, 1993，17:538～544.
收稿日期 1998-12-30, 百拇医药
单位：
周 青 刘 虎 汪 渊 刘建辉 安徽医科大学分子生物学实验室、生物化学教研室，安徽 合肥 230032；李 旭 安徽医科大学附属医院传染科
关键词：乙型肝炎病毒(HBV)；肝细胞肿癌(HCC)；聚合酶链式反应；HBx
疾病控制杂志990113
【摘要】 目的 通过检测肝细胞肿瘤(HCC)患者癌组织中HBx基因探讨乙型肝炎病毒(HBV)在HCC中的重要性。方法 根据HBx基因DNA序列设计引物，采用特异性聚合酶链式反应(PCR)对31例病理确诊并经手术切除后的HCC患者癌组织进行了检测，同时采用PCR方法检测了同一患者血清HBV DNA。 结果 PCR显示31例HCC患者癌组织中HBx基因和血清中HBV DNA的阳性率分别为77.4%(24/31)和32.3%(10/31)。结论 HBx基因片段广泛存在于HCC患者癌组织中并且在癌细胞中可能存在整合。
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【中图分类号】 R373.2； R735.709 【文献标识码】 A 【文章编号】 1008-6013(1999)01-0033-02
Detection of the HBx gene in the tissue of HCC patients
Zhou Qing, Liu Hu, Wang Yuan, Li Xu, Liu Jianhui.
Laboratory of Molecular Biology and Department of Biochemistry, Anhui Medical University, Hefei 230032,China
【Abstract】 Objective In order to explore the significant roles that hepatitis B virus(HBV) plays in hepatocellular carcinoma(HCC), the HBx gene in the tissue of HCC patients is examined. Methods According to the DNA sequence of the HBx gene, 3′ specific polymerase chain reaction(PCR) is applied to examine the 31 patients′ tissues whose tumors have been surgically excised and pathologically diagnosed, and to examine the HBV DNA in the serum. Results The positive rates of HBx gene in the 31 patients′ tissues and the HBV DNA in the serum are 77.4%(24/31) and 32.3%(10/31) respectively. Conclusions The HBx gene exists in the tissues of HCC patients in a wide range. There may be an integration of the HBx gene in the genome of liver cells.
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【Key words】 hepatitis B virus; hepatocellular carcinoma; polymerase chain reaction(PCR); HBx
中国是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高发地区，而肝细胞肿瘤(HCC)患者与HBV的长期感染有关。有关资料表明HBV在人体肝细胞内存在整合[1]。特别是HBV四个基因中的x基因具有反式激活作用，与HCC的发生密切相关[2]。根据HBx基因DNA序列设计引物，采用聚合酶链式反应(PCR)测定了31例HCC患者手术后癌组织中HBx基因片段，同时采用PCR方法检测了同一患者血清中HBV DNA。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器 引物由上海生工生物工程有限公司合成；Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、蛋白酶K、PCR缓冲液等购自华美生物工程公司，其他试剂均为国产分析纯；Hema 480基因扩增仪为珠海黑马医学仪器有限公司产品。
, 百拇医药
1.2 标本选择 31例肝癌组织取自安徽医科大学附属医院外科HCC患者手术标本并经病理证实，以及患者术前血清标本。
1.3 肝癌基因组DNA的提取 取肝癌组织200 μg，加入500 μl DNA提取液(100 mmol。L-1 NaCl, 1 mmol。L-1 EDTA， 0.5% SDS， 50 mmol。L-1 Tris-HCl,pH 8.0)，4℃冰浴中匀浆后加入50 μl 2 g。L-1蛋白酶K，置37℃消化6 h，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀基因组DNA，干燥后溶于100 μl dH2O中，经260 nm比色计算DNA含量，用dH2O稀释至250 ng。μl-1备用。
1.4 血清HBV DNA的提取 待检血清125 μl加入125 μl HBV DNA提取液(200 mmol。L-1 NaCl, 2 mmol。L-1 EDTA， 1% SDS，100 mmol。L-1 Tris-HCl,pH 8.0)，2 g。L-1蛋白酶K 6.25 μl，37℃消化6 h，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀HBV DNA，溶于20 μl dH2O中备用[3]。
, 百拇医药
1.5 PCR分析 根据HBV DNA序列设计x区引物：YW-Ⅱ-1H∶5′ TGT GCA CTT CGC TTC ACC TCT和YW-Ⅱ-1J∶5′ TGA ACA GAC CAA TTT ATG CCT。在1 μg肝癌细胞基因组DNA中加入PCR反应液(10 mmol。L-1 Tris,50 mmol。L-1 KCl， 2 mmol。L-1 MgCl, 0.001% Gelatin, 200 μmmol。L-1 dNTPs, 0.5 μmmol。L-1引物和Taq DNA聚合酶)，置PCR仪中93℃变性1 min，61℃复性1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃ 5 min结束反应。同时采用PCR的方法测定了同一患者血清中HBV DNA。
2 结果
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根据HBx基因序列所设计特异性核苷酸引物，经PCR扩增以后取PCR产物8 μl加入含有溴化乙锭的2.5%琼脂糖中进行电泳。经与100 bp DNA Marker比较以出现230 bp特异性扩增条带为阳性结果。为排除污染每次均设HBV阴性以及阳性对照(图1)。我们用此法检测了31例HCC患者术后癌组织中HBx基因，发现24例阳性，阳性率为77.4%(24/31)。血清HBV DNA阳性率为32.2%(10/31)。在24例癌组织HBx基因阳性的患者中，血清HBV DNA阳性占37.5%(9/24)，阴性占58.3%(14/24)。
图1 PCR分析HBx基因电泳图谱
1～7：样品编号 8：阴性对照 9：阳性对照 10：100 bp DNA标志物
3 讨论
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HBV感染是严重影响人类健康的传染性疾病，许多研究表明HBV与肝癌的发生密切相关，是引发肝癌的危险因素之一。Robinson等[4]认为HCC组织中有HBV的存在，80%～90%的HCC组织中整合有HBV DNA，而在HBV四个基因中HBx基因被认为是致癌基因[5]，因此研究HBx基因在肝细胞中的存在状态是非常重要的。本研究表明，31例HCC患者中有24例癌组织中存在HBx基因，阳性率为77.4%，说明HBx基因广泛存在于HCC患者癌组织中，在HCC的发生发展过程中可能起到一定的作用。在24例癌组织HBx基因阳性的患者中有9例外周血中检出HBV DNA，另外14例外周血中HBV DNA为阴性，说明HCC患者肝细胞中的HBV DNA可能以游离和整合两种形式存在。表现为一些HCC患者体内既有游离型的也有整合的HBV DNA；一些HCC患者癌细胞中可能只存在整合的HBx基因。游离型病毒复制活跃，外周血中可以检出，而整合型病毒无明显的复制。
目前人体血清HBsAg被广泛应用于临床诊断HBV的感染，但是临床实践和流行病学调查发现HBV感染后会出现一些特殊的血清学现象，如HBsAg阴性而HBV DNA阳性[6]。我们的研究表明血清HBV DNA阴性也不能排除曾经感染过HBV，因为HBV基因可能整合在肝细胞中，在疾病的发生发展过程中发挥作用。
, 百拇医药
基金项目：安徽省教委自然科学研究重点课题(JL96-077)；
安徽省自然科学研究基金资助课题(9741006)
作者简介：周 青，男，35岁，实验师
汪 渊，男，40岁，硕士，教授，硕士生导师
参考文献
[1] 邹 伟，张昭成，牛兆山.人肝细胞癌及癌旁肝组织HBV DNA的原位杂交检测.青岛医学院学报，1997，33(4)：313～314.
[2] Kekule AS, Lauer U, Weiss L. Hepatitis B virus transactivator HBx uses a tumor promoter signalling pathway. Nature, 1993，353：361～742.
, http://www.100md.com
[3] 汪 渊，李 旭，周 青.乙型肝炎病毒前C区1896位点突变的研究.安徽医科大学学报， 1998，33(4)：251～252.
[4] Robinson WS, Klote L, Aoki N. Hepadanaviruses in cirrhotic liver and hepatocellular carcinoma. J Med Virol, 1990，31(1):318～325.
[5] Chang MK, Kazuhiko K, Lzumu S, et al. HBx gene of hepatitis B virus induces liver cancer in transgenic mice. Nature, 1991，351:347.
[6] Zhang YY, Hanssan BG, Guo LS, et al. Hepatitis B virus DNA in serum and liver is commonly found in Chinese patients with chronic liver disease despite the presence of antibodies to HBsAg. Hepatology, 1993，17:538～544.
收稿日期 1998-12-30, 百拇医药