镉对大鼠睾丸中某些酶活性及组织形态的影响
作者：李湘鸣 居中华 孙蓉 戴俊明 陈秀云
单位：江苏扬州大学医学院毒理室(225001)
关键词：
卫生毒理学杂志990109 镉是环境中常见的有毒重金属之一，可引起多器官系统毒性，并且具有生殖系统(睾丸)毒性。我们研究了镉染毒后，大鼠睾丸组织中某些酶活性指标及组织形态的变化，探讨镉对生殖系统的毒性及其机制。
材料与方法
1.实验动物：成年雄性SD大鼠，由扬州大学动物实验中心提供。
2.染毒方法：用生理盐水将CdCl2(分析纯)配成相应的浓度，将40只SD大鼠，体重190～250g，根据动物随机分组的BASIC程序[1]，分为5组，每组8只。经大鼠背部皮下注射，使其染毒剂量为1.09，2.18，4.36和8.72μmol Cd+2/kg,1次/天，体积1ml/200g，连续注射5天；对照组给予生理盐水。
, 百拇医药
3.样品处理：动物经股动脉放血处死，取一侧睾丸称重，4℃以下用生理盐水制成10%的匀浆，用于测乳酸脱氢酶(LDH)同功酶，再取另一侧睾丸制成1%的匀浆，用于测LDH、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)总活性。分别高速冷冻离心(15 000r/min)20分。
4.生化指标分析方法：
(1) LDH同功酶活性测定：采用聚丙酰胺凝胶垂直板电脉(PAGE)法[2]。其中分离胶：T=7.5%，pH=8.9；浓缩胶：T=3.0%，pH=6.7。显色固定后制成干板，用LKB222型激光光密度扫描仪(λ=580nm)扫描，曲线经微机积分处理，计算出各区带的光吸收率(A)值。
(2) LDH、AKP、ACP总活性：选用比色法测定[3]。LDH活力以100ml匀浆液37℃作用15分产生1μmol/L丙酮酸为1个活力单位(U)表示；AKP以1ml匀浆液37℃作用30分产生1mg酚为1活力单位(U)表示；ACP以1ml匀浆液37℃作用1小时产生1mg酚为1活力单位(U)表示。分别换算成单位/克脏器重量(U/g.组织)表示。
, 百拇医药
(5) 组织形态观察：每组选2只动物，取其睾丸，福尔马林固定，冰冻石蜡切片，HE染色，光镜观察。
(6) 统计方法：所得资料输入386DX/40计算机，用SAS软件包，分别采用t检验和有关相关回归分析进行处理。
结果与讨论
1.LDH、AKP和ACP活性测定结果：由表1可见，大鼠睾丸中LDH总活性随着镉染毒剂量的增加，其活性受到明显抑制，各染毒剂量组与对照组差异具有显著性(P<0.05)。经回归分析发现，剂量反应关系呈对数曲线变化，其回归方程
(酶活性)=548.23-136.241gx(镉剂量)，r=-0.9860(P<0.05)。LDH是糖酵解的一个关键酶，睾丸组织除了可利用糖的有氧氧化获取能量外，还可通过糖酵解获得能量。因此，精子的形成，激素的分泌均与LDH有着密切的关系。ACP的变化亦同LDH类似，回归方程为=1009.60-498.501gx,r=-0.9795(P<0.05)，ACP主要分布在细胞的溶酶体内，其活性降低可能是镉的直接抑制作用。AKP属浆膜结合酶，本次实验未发现明显变化。
, 百拇医药
表1 镉染毒后大鼠睾丸中LDH、ACP(U/g.组织)活性(
±s) 剂量组
(μmol/kg)
LDH
ACP
对照组
636.96±47.82
1283.25±316.78
1.09
534.64±72.63*
996.38±294.07*
, 百拇医药
2.18
513.41±113.59*
861.50±129.63*
4.36
464.00±76.36*
633.25±156.30*
8.72
414.40±51.89*
572.25±118.84*
与对照组比较 *P<0.05
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2.LDH同功酶：从表2可见，LDH1、LDH2、LDH3和LDH4随着镉染毒剂量的增加，酶活性逐渐降低，各染毒剂量组与对照组均有显著性差异(P<0.05)，LDH1呈对数曲线下降，其回归方程为(酶活性，A)=0.2329-0.16141gx(镉剂量)，r=-0.9384(P<0.05);LDH2呈直线下降，其回归方程为=0.1913-0.0158x,r=-0.9761(P<0.05);LDH3与LDH4均呈对数曲线下降，其回归方程分别为=0.086-0.05281gx,r=-0.9406(P<0.05)和=0.0312-0.03161gx,r=-0.9918(P<0.05)。经镉作用后，LDH4下降最明显，在1.09μmol/kg组，比对照组下降了73.63%，其次是LDH3、LDH2和LDH1；LDH5活性呈现先升高后下降，当镉染毒剂量在1.09和4.36μmol/kg时，其酶活性呈升高变化，而当镉染毒剂量为8.72μmol/kg时，酶活性呈下降变化，比对照组下降了52.78%。
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表2 镉染毒大鼠睾丸中LDH同功酶活性的变化(±s) 同功酶
类型
对照组
染毒组(μmol/kg)
1.09
2.18
4.36
8.72
LDH1
0.24±0.046
0.22±0.051*
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0.21±0.036*
0.11±0.037*
0.09±0.021*
LDH2
0.21±0.037
0.16±0.043*
0.16±0.025*
0.12±0.031*
0.06±0.010*
, 百拇医药 LDH3
0.14±0.038
0.08±0.029*
0.07±0.013*
0.06±0.025*
0.03±0.005*
LDH4
0.11±0.027
0.03±0.006*
0.02±0.003*
, 百拇医药
0.01±0.004*
-
LDH5
0.04±0.005
0.07±0.009*
0.10±0.017*
0.12±0.014*
0.02±0.006*
LDH-x
0.06±0.012
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0.04±0.013*
0.03±0.006*
-
-
与对照组比较*P<0.05
LDH1均由H亚基组成，而LDH2、LDH3和LDH4分别由H和M两种亚基组成。H亚基对丙酮酸的亲和力较强，在有氧情况下睾丸组织亦可进行糖酵而获取能量。进入机体的Cd+可能首先使该4种同功酶的活性下降，使睾丸组织细胞的糖酵解途径受到影响。LDH5均由M亚基组成，对乳酸的亲和力较强，在镉剂量较低时，机体可能通过代偿，LDH5活性增加，睾丸组织可利用乳酸而获取能量；随着Cd染毒剂量的增加，机体失去代偿，从而造成LDH5活性的降低。
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3.睾丸组织形态：在1.09和2.18μmol Cd+2/kg染毒组，光镜下未发现睾丸组织有明显的充血、水肿及坏死(图1)，而在4.36和8.72μmol Cd+2/kg染毒组，肉眼发现双侧睾丸血管明显的充血，呈紫褐色；光镜下睾丸间质组织中见有大量的红细胞，细胞明显变性坏死，严重者呈玻璃样改变；曲精小管中，精原细胞、次级精母细胞呈空泡状变性坏死，严重时大量脱落，管腔内见有呈蔟脱落的精原细胞，其排列呈“玫瑰”型(图2)。由上可知，镉对睾丸的毒性较强。
图1 2.18μmol/kg睾丸组织细胞未见明显的充血、水肿、坏死
图2 8.72μmol/kg精原细胞呈蔟脱落，呈“玫瑰瓣”状
, 百拇医药
LDH-x只存在于睾丸组织中，它与精子的形成、间质细胞激素的分泌均有关，是判断是否具有繁殖能力的一个特异指标[4]。从表2可见，LDH-x对镉的毒性较敏感，4.36μmol/kg即可使其活性完全丧失。说明低剂量镉完全能破坏或影响机体的繁殖能力。
参考文献
1.李湘鸣，等.卫生毒理学杂志，1995，9(3)：193.
2.Clark J M；Switzer R L.Experienmental Biochemistry 2-ed.San Francisco:Freemen W.H.and Company,1997,119～122.
3.上海市医学化验所临床生化检验(上册)，上海：上海科学技术出版社，1979，315～360.
4.赵春艳.国外医学卫生学分册，1995，22(2)：77～79.
(修回日期 1998年5月), 百拇医药
单位：江苏扬州大学医学院毒理室(225001)
关键词：
卫生毒理学杂志990109 镉是环境中常见的有毒重金属之一，可引起多器官系统毒性，并且具有生殖系统(睾丸)毒性。我们研究了镉染毒后，大鼠睾丸组织中某些酶活性指标及组织形态的变化，探讨镉对生殖系统的毒性及其机制。
材料与方法
1.实验动物：成年雄性SD大鼠，由扬州大学动物实验中心提供。
2.染毒方法：用生理盐水将CdCl2(分析纯)配成相应的浓度，将40只SD大鼠，体重190～250g，根据动物随机分组的BASIC程序[1]，分为5组，每组8只。经大鼠背部皮下注射，使其染毒剂量为1.09，2.18，4.36和8.72μmol Cd+2/kg,1次/天，体积1ml/200g，连续注射5天；对照组给予生理盐水。
, 百拇医药
3.样品处理：动物经股动脉放血处死，取一侧睾丸称重，4℃以下用生理盐水制成10%的匀浆，用于测乳酸脱氢酶(LDH)同功酶，再取另一侧睾丸制成1%的匀浆，用于测LDH、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)总活性。分别高速冷冻离心(15 000r/min)20分。
4.生化指标分析方法：
(1) LDH同功酶活性测定：采用聚丙酰胺凝胶垂直板电脉(PAGE)法[2]。其中分离胶：T=7.5%，pH=8.9；浓缩胶：T=3.0%，pH=6.7。显色固定后制成干板，用LKB222型激光光密度扫描仪(λ=580nm)扫描，曲线经微机积分处理，计算出各区带的光吸收率(A)值。
(2) LDH、AKP、ACP总活性：选用比色法测定[3]。LDH活力以100ml匀浆液37℃作用15分产生1μmol/L丙酮酸为1个活力单位(U)表示；AKP以1ml匀浆液37℃作用30分产生1mg酚为1活力单位(U)表示；ACP以1ml匀浆液37℃作用1小时产生1mg酚为1活力单位(U)表示。分别换算成单位/克脏器重量(U/g.组织)表示。
, 百拇医药
(5) 组织形态观察：每组选2只动物，取其睾丸，福尔马林固定，冰冻石蜡切片，HE染色，光镜观察。
(6) 统计方法：所得资料输入386DX/40计算机，用SAS软件包，分别采用t检验和有关相关回归分析进行处理。
结果与讨论
1.LDH、AKP和ACP活性测定结果：由表1可见，大鼠睾丸中LDH总活性随着镉染毒剂量的增加，其活性受到明显抑制，各染毒剂量组与对照组差异具有显著性(P<0.05)。经回归分析发现，剂量反应关系呈对数曲线变化，其回归方程
(酶活性)=548.23-136.241gx(镉剂量)，r=-0.9860(P<0.05)。LDH是糖酵解的一个关键酶，睾丸组织除了可利用糖的有氧氧化获取能量外，还可通过糖酵解获得能量。因此，精子的形成，激素的分泌均与LDH有着密切的关系。ACP的变化亦同LDH类似，回归方程为=1009.60-498.501gx,r=-0.9795(P<0.05)，ACP主要分布在细胞的溶酶体内，其活性降低可能是镉的直接抑制作用。AKP属浆膜结合酶，本次实验未发现明显变化。, 百拇医药
表1 镉染毒后大鼠睾丸中LDH、ACP(U/g.组织)活性(
±s) 剂量组(μmol/kg)
LDH
ACP
对照组
636.96±47.82
1283.25±316.78
1.09
534.64±72.63*
996.38±294.07*
, 百拇医药
2.18
513.41±113.59*
861.50±129.63*
4.36
464.00±76.36*
633.25±156.30*
8.72
414.40±51.89*
572.25±118.84*
与对照组比较 *P<0.05
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2.LDH同功酶：从表2可见，LDH1、LDH2、LDH3和LDH4随着镉染毒剂量的增加，酶活性逐渐降低，各染毒剂量组与对照组均有显著性差异(P<0.05)，LDH1呈对数曲线下降，其回归方程为
(酶活性，A)=0.2329-0.16141gx(镉剂量)，r=-0.9384(P<0.05);LDH2呈直线下降，其回归方程为=0.1913-0.0158x,r=-0.9761(P<0.05);LDH3与LDH4均呈对数曲线下降，其回归方程分别为=0.086-0.05281gx,r=-0.9406(P<0.05)和=0.0312-0.03161gx,r=-0.9918(P<0.05)。经镉作用后，LDH4下降最明显，在1.09μmol/kg组，比对照组下降了73.63%，其次是LDH3、LDH2和LDH1；LDH5活性呈现先升高后下降，当镉染毒剂量在1.09和4.36μmol/kg时，其酶活性呈升高变化，而当镉染毒剂量为8.72μmol/kg时，酶活性呈下降变化，比对照组下降了52.78%。, http://www.100md.com
表2 镉染毒大鼠睾丸中LDH同功酶活性的变化(
±s) 同功酶类型
对照组
染毒组(μmol/kg)
1.09
2.18
4.36
8.72
LDH1
0.24±0.046
0.22±0.051*
, http://www.100md.com
0.21±0.036*
0.11±0.037*
0.09±0.021*
LDH2
0.21±0.037
0.16±0.043*
0.16±0.025*
0.12±0.031*
0.06±0.010*
, 百拇医药 LDH3
0.14±0.038
0.08±0.029*
0.07±0.013*
0.06±0.025*
0.03±0.005*
LDH4
0.11±0.027
0.03±0.006*
0.02±0.003*
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0.01±0.004*
-
LDH5
0.04±0.005
0.07±0.009*
0.10±0.017*
0.12±0.014*
0.02±0.006*
LDH-x
0.06±0.012
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0.04±0.013*
0.03±0.006*
-
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与对照组比较*P<0.05
LDH1均由H亚基组成，而LDH2、LDH3和LDH4分别由H和M两种亚基组成。H亚基对丙酮酸的亲和力较强，在有氧情况下睾丸组织亦可进行糖酵而获取能量。进入机体的Cd+可能首先使该4种同功酶的活性下降，使睾丸组织细胞的糖酵解途径受到影响。LDH5均由M亚基组成，对乳酸的亲和力较强，在镉剂量较低时，机体可能通过代偿，LDH5活性增加，睾丸组织可利用乳酸而获取能量；随着Cd染毒剂量的增加，机体失去代偿，从而造成LDH5活性的降低。
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3.睾丸组织形态：在1.09和2.18μmol Cd+2/kg染毒组，光镜下未发现睾丸组织有明显的充血、水肿及坏死(图1)，而在4.36和8.72μmol Cd+2/kg染毒组，肉眼发现双侧睾丸血管明显的充血，呈紫褐色；光镜下睾丸间质组织中见有大量的红细胞，细胞明显变性坏死，严重者呈玻璃样改变；曲精小管中，精原细胞、次级精母细胞呈空泡状变性坏死，严重时大量脱落，管腔内见有呈蔟脱落的精原细胞，其排列呈“玫瑰”型(图2)。由上可知，镉对睾丸的毒性较强。
图1 2.18μmol/kg睾丸组织细胞未见明显的充血、水肿、坏死
图2 8.72μmol/kg精原细胞呈蔟脱落，呈“玫瑰瓣”状
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LDH-x只存在于睾丸组织中，它与精子的形成、间质细胞激素的分泌均有关，是判断是否具有繁殖能力的一个特异指标[4]。从表2可见，LDH-x对镉的毒性较敏感，4.36μmol/kg即可使其活性完全丧失。说明低剂量镉完全能破坏或影响机体的繁殖能力。
参考文献
1.李湘鸣，等.卫生毒理学杂志，1995，9(3)：193.
2.Clark J M；Switzer R L.Experienmental Biochemistry 2-ed.San Francisco:Freemen W.H.and Company,1997,119～122.
3.上海市医学化验所临床生化检验(上册)，上海：上海科学技术出版社，1979，315～360.
4.赵春艳.国外医学卫生学分册，1995，22(2)：77～79.
(修回日期 1998年5月), 百拇医药