发育毒物体外筛选试验的聚类分析
作者：陆荣柱 陈传芬 蒋九滨 陈健美 金锡鹏 林惠芬
单位：陆荣柱 陈传芬 陈健美 (镇江医学院预防医学教研室 212001)； 蒋九滨 (镇江医学院数学教研室)； 金锡鹏 林惠芬 (上海医科大学劳动卫生学教研室)
关键词：发育毒物；筛选；聚类分析；预测
卫生毒理学杂志990106 内容摘要 以简单配比系数为相似性指标对15种发育毒物体外筛选试验进行指标型系统聚类分析。结果提示最长、最短和平均距离法3种聚类方法中以最长距离法的聚类效果最为理想，符合发育毒物毒作用的细胞学机制。最终聚类结果为5大类，其中以A/D比值和以细胞生长为指标的方法聚为一类；以细胞聚集、细胞生长和细胞分化3个终点为联合指标的鸡胚神经视网膜细胞试验和啮齿类动物的全胚胎培养归为一类。但以反映细胞分化和细胞间相互作用以及胚胎形成抑制为终点的方法并未完全归为一类，说明这些单一的终点不可能全面反映细胞增殖、分化和相互作用等相互依赖的细胞行为，因而提示应用其中的两个终点进行组合并不能提高预测价值。为了全面提高发育毒物体外筛选试验的预测价值，应结合各种方法的特异度和灵敏度，并根据经济有效和合理的原则，选择其中的3～5种进行组合。
, 百拇医药
Cluster analysis of data obtained from in vitro tests for screening developmental toxicants
Lu Rong-zhu Chen Chuan-fen Chen Jiang-mei et al.
(Dept.of Prev Med，Zhenjiang Medical College,212001)
The simple matching coefficients(SMCs) was applied as the index of similarity in hierarchical cluster analysis of fifteen in vitro prescreening tests for developmental toxicants.The classification results of complete-link method,single-link method，and average-link method indicated that the result based on the first method was optimal.The 5 groups were formed,which shown that the methods with A/D ratio or cell growth inhibition as endpoints were put into the same groups,respectively,and that the method with combination of cell aggregation,cell growth and cell differentiation as endpoints was clustered into one class with rodents whole embryo culture,but the methods with cell differentiation and cell-cell interaction were not classified into one cluster,which verified the theory that three cell behaviors(cell proliferation,cell differentiation and cell-cell/cell-substrate interactions)are dependant.Therefore,when battery of methods were made,the combination with only two of three endpoints should not be sufficient to improve prediction values of tests.In order to improve prediction values significantly,three or more endpoints should be selected to combine to a test battery according on the principle of low-cost，effectiveness and rationale.
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Key words:Developmental toxicants;cluster analysis;Prediction
近年来，随着不断增多的新化学物和药物发育毒性评价的需要，快速筛选发育毒物的体外试验越来越多，但由于各种方法采用的测试终点相对单一，不可能全面反映发育毒物的毒作用机制，一直未能得到理想的观测效果，因而国内外学者都建议将不同终点的体外筛选试验进行组合，提高组合测试的预测价值[1～4]。但Steel[8]等的研究却证实将两个终点的试验进行简单组合，并不能提高预测效果。因而选择哪些终点及其相应的检测方法进行组合，才能更为经济有效和合理地进行预测，仍需要进一步研究理论依据。
在建立发育毒物体外筛选试验微型数据库的基础上[5]，以它们对同一种化学物测试结果的符合率，即简单配比系数(SMCS)作为相似性指标，对不同检测终点的体外筛选方法进行聚类分析，探讨验证它们之间的相似性，并为根据Bayes定理建立体外筛选组合系统提供依据。
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资料来源与方法
1.以与发育异常和体外筛选等关键词检索MEDLINE光盘(1982～1996)，并辅以医学索引、化学文摘、生物学文摘、荷兰医学文摘等的手工检索。获得具体方法的文献摘要后，查寻全文，再以文献追溯法，进一步检索相关的方法。
2.选择有明确的效应指标(阴性、阳性)的15种方法，将其检测的化学物英文名称和测试效应，应用Epi Info软件建立数据库(该库包括化学物的CAS号、别名、商品名)，以比较同一化学物在不同方法中的检测效应，并进行聚类分析。采用的分析软件为SAS(6.04版)。
结 果
1.体外方法的一般资料：本数据库包括15种发育毒物体外筛选试验，采用的检测材料主要是原代和传代细胞，检测终点也以抑制细胞分化为多。表1检测的化学物共有252种，其中动物试验或人群调查为阳性(发育毒物)有138种，占54.8%；阴性(非发育毒物)有98种，占38.9%；尚无明确结论的有16种，占6.3%。
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表1 15种发育毒物体外试验名称、缩写、检测终点以及检测的化学物数目 名 称
缩 写
检测终点
检测化学物数
小鼠卵巢肿瘤细胞贴附抑制试验
MOT
细胞间相互作用
102
V79细胞代谢协调试验
MCO
细胞间通讯
67
, http://www.100md.com
人胚上腭间质细胞生长抑制试验
HEM
细胞增殖
54
动物病毒(POX)筛选试验
POX
细胞生长
50
啮齿类动物全胚胎培养试验
WEC
胚胎生长
65
爪蟾胚胚胎致畸筛选试验
, http://www.100md.com
FET
胚胎生长
35
果蝇胚胎细胞培养试验
DEC
细胞分化
99
神经胶质瘤细胞分化抑制试验
DNC
细胞分化
58
胚胎神经脊细胞分化抑制试验
ENC
, 百拇医药
细胞分化
15
胚胎癌细胞分化抑制试验
EC
细胞分化
10
胚胎干细胞分化抑制试验
ES
细胞分化
25
大鼠胚胎中脑及肢芽细胞培养试验
MIC
细胞分化
, 百拇医药
45
鸡胚神经视网膜细胞试验
ENR
生长、分化、相互作用
23
胚胎干细胞细胞毒性试验
ESC
A/D比值
16
水螅试验
HYD
A/D比值
112
, 百拇医药
成体(Adult)和发育体(Development)的最低毒作用浓度/剂量比值
2.不同方法测定的相同化学物数目：由表2可见，不同方法之间测定的相同化学物的数目相差很大，最多的为40种，有的甚至为0。EC和ENC与其它方法检测的相同化学物数目都未超过8个。
表2 15种方法测定结果相同的化学物数目△
MOT
HEM
WEC
DEC
DNC
POX
, 百拇医药 MCO
ENC
EC
ES
ESC
MIC
ENR
HYD
FET
MOT
40
17
37
32
, 百拇医药
37
27
7
2
12
8
13
9
16
15
HEM
12
22
22
, 百拇医药
20
19
4
3
12
10
10
8
9
17
WEC
12
13
13
, http://www.100md.com
10
1
4
3
4
6
4
5
7
DEC
27
19
20
6
, http://www.100md.com
3
11
8
12
9
12
14
DNC
23
20
5
1
9
8
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5
9
8
12
POX
13
6
2
8
6
10
4
13
9
, 百拇医药
MCO
7
1
15
12
5
7
14
25
ENC
0
6
3
4
, 百拇医药
4
7
4
EC
1
2
2
0
2
2
ES
7
4
5
, 百拇医药
9
13
ESC
2
1
7
14
MIC
2
2
3
ENR
6
5
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HYD
10
FET
△：方法缩写同表1
3.相似性的计算：结果从表3可以看出SMC的范围在0.00～1.00之间，大多数集中在0.40～0.90之间，但SMC为1.00和0.00时可能主要是测定的相同化学物数目太少所致，并不能说明这两种方法之间的结果完全相同或完全相反。
表3 15种测试方法之间的相似性(SMC)△
MOT
HEM
WEC
DEC
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DNC
POX
MCO
ENC
EC
ES
ESC
MIC
ENR
HYD
FET
MOT
0.58
, http://www.100md.com
0.41
0.43
0.78
0.68
0.63
0.71
0.00
0.58
0.25
0.62
0.33
0.31
0.47
, 百拇医药
HEM
0.92
0.64
0.55
0.75
0.42
0.50
0.67
0.67
0.70
0.80
0.88
0.44
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0.88
WEC
0.83
0.85
0.69
0.40
1.00
0.25
1.00
0.50
0.67
1.00
0.80
, 百拇医药
0.57
DEC
0.56
0.58
0.45
0.67
0.67
0.82
0.88
0.58
0.89
0.75
0.71
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DNC
0.78
0.55
0.60
0.00
0.33
0.50
0.80
0.56
0.63
0.67
POX
0.38
, 百拇医药
0.67
0.50
0.88
0.71
0.90
0.50
0.46
0.89
MCO
0.86
1.00
0.60
0.50
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0.60
0.50
0.50
0.36
ENC
0.00
0.83
1.00
0.75
1.00
0.71
0.75
EC
, 百拇医药
1.00
1.00
0.50
0.50
0.50
0.50
ES
0.86
1.00
0.60
0.67
0.77
ESC
, 百拇医药
1.00
1.00
0.71
0.79
MIC
1.00
1.00
1.00
ENR
0.33
0.80
HYD
0.70
, 百拇医药
FET
△：方法缩写同表1
3.3种聚类方法的聚类结果：
(1)经最大距离法、最小距离法和平均距离法进行聚类分析，从3张聚类图中可以看出随着聚类类别的减少，同类对象间的最大距离不断增大，最大距离法和平均距离法的聚类结果较为接近。最短距离法在同类对象间的最大距离为0.2200，相似性为0.7800时就聚为一类，没有实际意义。从图1可以看出将15种方法聚为4类后再分为5类时，同类对象间最大距离有一个显著的跳跃，说明聚为5类时，类间的性质有着较为明显的改变，同时分为5类时的同类对象间最大距离为0.33，相似性为0.67仍较为理想，说明这5个分类是可行的。这5类分别为：①HEM、POX、ES、MIC和FET；②DEC、ESC和HYD；③DNC和MOT；④WEC、ENC和ENR；⑤MCO和EC。第一类主要反映细胞增殖和生长，第二类则主要反映A/D比值，以水螅为检测材料与以胚胎干细胞为检测材料的结果相似，因而在进行A/D比值筛选时，从胚胎发育过程的种属相近性考虑应首先选用胚胎干细胞毒性试验。第四类以胚胎发生为终点的啮齿类哺乳动物全胚胎培养与结合细胞集聚、细胞生长和细胞分化三终点的鸡胚神经视网膜细胞培养系统聚为一类，表明二者具有同等的预测价值，提示多终点的组合可以提高预测价值。但反映分化抑制的检测方法未能聚为一类，WEC和FET这两种分别采用啮齿类动物和脊椎动物的全胚胎培养系统也未能聚为一类。
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图1 最大距离法聚类过程图
(2)为排除测试化学物数目较少的EC和ENC对最终聚类结果的影响，仅对13种方法采用最长距离法获得的聚类过程见图2。从图中可以看出在最终聚类为5类时，同类对象间最大距离为0.33，相似性为0.67，这和15种方法的最大距离法的聚类情况基本一致。5类分别是①HEM POX FET；②WEC DEC ES HYD；③ESC MIC ENR；④MOT DNC。
图2 13种方法最大距离法聚类树
讨 论
运用多元统计学理论和方法逐步完善现有的毒理学体外预测体系是预测毒理学的重要研究内容，聚类分析、判别分析和因子分析等方法在致突变、致癌和眼角膜刺激试验的替代试验等方法都有了相应的应用[6，8，9]。本次研究是发育毒理学体外研究领域的一次初步探索，下面主要就影响聚类结果的因素以及聚类结果的发育毒理学意义作一简要讨论。
, 百拇医药
1.影响聚类结果的主要因素(1)SMC的计算：SMC是表示两种测试方法对同一样品测试结果符合况的一个指标，弥补两分类资料数据不能计算相关系数的不足，可用于表示两分类数据相似性，其范围在0到1之间，越接近1，说明这两种方法测定结果的符合率越高，就化学物发育毒性体外测试而言，就越有可能提示这两种方法有着相同的测试机理，就不应选到同一个测试组合。国外在短期致癌试验聚类分析和神经性厌食症患者的临床症状研究中都采用了这一指标[6，7]。但由于SMC的计算受分母，即两种方法检测的相同化学物的数目的影响较大，当该数目小于8时就很难做出结论，Pet-Edwards等建议剔除这些资料，但这样会大大损失信息量。本研究的结果提示两种方法检测同一化学物总数小于8的竟达21%(52/252)，这也可能是聚类结果未能与发育异常的细胞机制完全吻合的重要原因，但剔除测试化学物数目较少的两种方法仍未能明显改善聚类结果，其中的原因值得进一步研究。(2)聚类方法的选择：本研究选用的3种聚类分析方法是系统聚类分析的常用方法，其中最短距离法的结果无实际意义，这与国外的对短期致癌试验的评价结论是一致的。最大距离法则表示类内的方法的相似性都大于或等于某一界值，一般情况下，这种方法的聚类结果较为理想[6]。(3)参照化学物的组成：化学物发育毒性体外试验中所选择的参照物中阳性发育毒物所占的比重较大也可能是聚类分析结果不理想的一个重要原因，因为发育毒物可能有会对多种细胞行为产生损害作用，导致多种检测终点同时表现阳性结果，使本不应归在一类的不同终点的方法却归在一类[5]。本次聚类分析的结果仅仅是初步的研究，随着发育毒理学研究的不断深入，特别是对发育异常机制的了解，检测方法的增多和完善将会使聚类结果更加符合发育毒理学的理论基础。
, 百拇医药
2.聚类分析结果的发育毒理学意义：细胞生长(增殖)、分化和细胞间相互作用三种细胞行为是相互影响、相互依赖的，因而进行多终点组合应在多元统计学分析的基础上，结合所用方法的发育毒理学意义给予综合评价。将两个以上不同终点机械地组合不可能取得预期的结果，Steel等[8]将HEM和MOT组合后并未明显提高预测价值就是一个例证。根据Pet-Edwards等聚类分析结果理论分析[6]，本次聚类的结果的另外一个意义在于为未能得出特异度和灵敏度的筛选试验提供估计值，因为经聚类分析后归为一组的所有方法的这两个指标值相近。另外，在进行组合时，不宜选择属于同一簇(Cluster)的方法，因为这些方法之间有着较高的相关(似)性，在用Bayes定理计算预测价值时，两个以上的组合效果并不优于其中的任何一种方法的单独效应。因而如何借鉴致癌性预测和配套试验选择法(CPBS)的经验，结合各种方法的特异度和灵敏度，并根据经济有效和合理的原则，特别是参照国内实验室的实际条件，选择其中的哪些方法进行组合值得进一步研究。
, http://www.100md.com 参考文献
1.Daston GP.The theoretical and empirical case for in vitro developmental toxicity screens，and potential applications.Teratology，1996,53(6):339～344.
2.王爱平.胚胎毒性与致畸性体外测试方法.癌变畸变突变，1992，4(1)：55～58.
3.Lin GHY.Prediction of teratogenic potential and a proposed scheme for teratogenecity screening of industrial and developmental materials.In Vitro Toxicol J Mol Cell Toxicol，1987,1(3):203～217.
, 百拇医药
4.王爱平，王郑选.致畸物短期筛选方法选择的讨论.卫生毒理学杂志，1995，9(2):124～125.
5.陆荣柱.化学物发育毒性的体外测试及混苯作业女工生育能力的调查.上海医科大学硕士研究生毕业论文，1996.
6.Pet-Edwards J，Rosenkranz HS，Chankong V，et al.Cluster analysis in predicting the carcinogenicity of chemicals using short-term assays.Mut Res，1985,153.
7.Morgan BJT，Ray APG.Non-uniqueness and inversion in cluster analysis.Appl Stat，1995;44(1):117～134.
, 百拇医药 8.朱永平，余应年，陈星若.多环芳烃与致癌活性关系的Fisher判别研究.卫生毒理学杂志，1997，11(2)： 71～74.
9.Hayashi T，Itayaki H，Fukada T，et al.Multivariate factorial analysis of data obtined in seven in vitro test systems for predicting eye irritancy.Toxic in vitro，1994,8(2):215～220.
10.Steele VS，Morrissey RE，Elmore EL，et al.Evaluation of two in vitro assays to screen for potential developmental toxicants.Fundam Appl Toxicol，1988,11:673～684.
(修回日期 1998年10月), 百拇医药
单位：陆荣柱 陈传芬 陈健美 (镇江医学院预防医学教研室 212001)； 蒋九滨 (镇江医学院数学教研室)； 金锡鹏 林惠芬 (上海医科大学劳动卫生学教研室)
关键词：发育毒物；筛选；聚类分析；预测
卫生毒理学杂志990106 内容摘要 以简单配比系数为相似性指标对15种发育毒物体外筛选试验进行指标型系统聚类分析。结果提示最长、最短和平均距离法3种聚类方法中以最长距离法的聚类效果最为理想，符合发育毒物毒作用的细胞学机制。最终聚类结果为5大类，其中以A/D比值和以细胞生长为指标的方法聚为一类；以细胞聚集、细胞生长和细胞分化3个终点为联合指标的鸡胚神经视网膜细胞试验和啮齿类动物的全胚胎培养归为一类。但以反映细胞分化和细胞间相互作用以及胚胎形成抑制为终点的方法并未完全归为一类，说明这些单一的终点不可能全面反映细胞增殖、分化和相互作用等相互依赖的细胞行为，因而提示应用其中的两个终点进行组合并不能提高预测价值。为了全面提高发育毒物体外筛选试验的预测价值，应结合各种方法的特异度和灵敏度，并根据经济有效和合理的原则，选择其中的3～5种进行组合。
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Cluster analysis of data obtained from in vitro tests for screening developmental toxicants
Lu Rong-zhu Chen Chuan-fen Chen Jiang-mei et al.
(Dept.of Prev Med，Zhenjiang Medical College,212001)
The simple matching coefficients(SMCs) was applied as the index of similarity in hierarchical cluster analysis of fifteen in vitro prescreening tests for developmental toxicants.The classification results of complete-link method,single-link method，and average-link method indicated that the result based on the first method was optimal.The 5 groups were formed,which shown that the methods with A/D ratio or cell growth inhibition as endpoints were put into the same groups,respectively,and that the method with combination of cell aggregation,cell growth and cell differentiation as endpoints was clustered into one class with rodents whole embryo culture,but the methods with cell differentiation and cell-cell interaction were not classified into one cluster,which verified the theory that three cell behaviors(cell proliferation,cell differentiation and cell-cell/cell-substrate interactions)are dependant.Therefore,when battery of methods were made,the combination with only two of three endpoints should not be sufficient to improve prediction values of tests.In order to improve prediction values significantly,three or more endpoints should be selected to combine to a test battery according on the principle of low-cost，effectiveness and rationale.
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Key words:Developmental toxicants;cluster analysis;Prediction
近年来，随着不断增多的新化学物和药物发育毒性评价的需要，快速筛选发育毒物的体外试验越来越多，但由于各种方法采用的测试终点相对单一，不可能全面反映发育毒物的毒作用机制，一直未能得到理想的观测效果，因而国内外学者都建议将不同终点的体外筛选试验进行组合，提高组合测试的预测价值[1～4]。但Steel[8]等的研究却证实将两个终点的试验进行简单组合，并不能提高预测效果。因而选择哪些终点及其相应的检测方法进行组合，才能更为经济有效和合理地进行预测，仍需要进一步研究理论依据。
在建立发育毒物体外筛选试验微型数据库的基础上[5]，以它们对同一种化学物测试结果的符合率，即简单配比系数(SMCS)作为相似性指标，对不同检测终点的体外筛选方法进行聚类分析，探讨验证它们之间的相似性，并为根据Bayes定理建立体外筛选组合系统提供依据。
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资料来源与方法
1.以与发育异常和体外筛选等关键词检索MEDLINE光盘(1982～1996)，并辅以医学索引、化学文摘、生物学文摘、荷兰医学文摘等的手工检索。获得具体方法的文献摘要后，查寻全文，再以文献追溯法，进一步检索相关的方法。
2.选择有明确的效应指标(阴性、阳性)的15种方法，将其检测的化学物英文名称和测试效应，应用Epi Info软件建立数据库(该库包括化学物的CAS号、别名、商品名)，以比较同一化学物在不同方法中的检测效应，并进行聚类分析。采用的分析软件为SAS(6.04版)。
结 果
1.体外方法的一般资料：本数据库包括15种发育毒物体外筛选试验，采用的检测材料主要是原代和传代细胞，检测终点也以抑制细胞分化为多。表1检测的化学物共有252种，其中动物试验或人群调查为阳性(发育毒物)有138种，占54.8%；阴性(非发育毒物)有98种，占38.9%；尚无明确结论的有16种，占6.3%。
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表1 15种发育毒物体外试验名称、缩写、检测终点以及检测的化学物数目 名 称
缩 写
检测终点
检测化学物数
小鼠卵巢肿瘤细胞贴附抑制试验
MOT
细胞间相互作用
102
V79细胞代谢协调试验
MCO
细胞间通讯
67
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人胚上腭间质细胞生长抑制试验
HEM
细胞增殖
54
动物病毒(POX)筛选试验
POX
细胞生长
50
啮齿类动物全胚胎培养试验
WEC
胚胎生长
65
爪蟾胚胚胎致畸筛选试验
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FET
胚胎生长
35
果蝇胚胎细胞培养试验
DEC
细胞分化
99
神经胶质瘤细胞分化抑制试验
DNC
细胞分化
58
胚胎神经脊细胞分化抑制试验
ENC
, 百拇医药
细胞分化
15
胚胎癌细胞分化抑制试验
EC
细胞分化
10
胚胎干细胞分化抑制试验
ES
细胞分化
25
大鼠胚胎中脑及肢芽细胞培养试验
MIC
细胞分化
, 百拇医药
45
鸡胚神经视网膜细胞试验
ENR
生长、分化、相互作用
23
胚胎干细胞细胞毒性试验
ESC
A/D比值
16
水螅试验
HYD
A/D比值
112
, 百拇医药
成体(Adult)和发育体(Development)的最低毒作用浓度/剂量比值
2.不同方法测定的相同化学物数目：由表2可见，不同方法之间测定的相同化学物的数目相差很大，最多的为40种，有的甚至为0。EC和ENC与其它方法检测的相同化学物数目都未超过8个。
表2 15种方法测定结果相同的化学物数目△
MOT
HEM
WEC
DEC
DNC
POX
, 百拇医药 MCO
ENC
EC
ES
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FET
MOT
40
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, 百拇医药
37
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MIC
2
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ENR
6
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HYD
10
FET
△：方法缩写同表1
3.相似性的计算：结果从表3可以看出SMC的范围在0.00～1.00之间，大多数集中在0.40～0.90之间，但SMC为1.00和0.00时可能主要是测定的相同化学物数目太少所致，并不能说明这两种方法之间的结果完全相同或完全相反。
表3 15种测试方法之间的相似性(SMC)△
MOT
HEM
WEC
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DNC
POX
MCO
ENC
EC
ES
ESC
MIC
ENR
HYD
FET
MOT
0.58
, http://www.100md.com
0.41
0.43
0.78
0.68
0.63
0.71
0.00
0.58
0.25
0.62
0.33
0.31
0.47
, 百拇医药
HEM
0.92
0.64
0.55
0.75
0.42
0.50
0.67
0.67
0.70
0.80
0.88
0.44
, http://www.100md.com
0.88
WEC
0.83
0.85
0.69
0.40
1.00
0.25
1.00
0.50
0.67
1.00
0.80
, 百拇医药
0.57
DEC
0.56
0.58
0.45
0.67
0.67
0.82
0.88
0.58
0.89
0.75
0.71
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DNC
0.78
0.55
0.60
0.00
0.33
0.50
0.80
0.56
0.63
0.67
POX
0.38
, 百拇医药
0.67
0.50
0.88
0.71
0.90
0.50
0.46
0.89
MCO
0.86
1.00
0.60
0.50
, http://www.100md.com
0.60
0.50
0.50
0.36
ENC
0.00
0.83
1.00
0.75
1.00
0.71
0.75
EC
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1.00
1.00
0.50
0.50
0.50
0.50
ES
0.86
1.00
0.60
0.67
0.77
ESC
, 百拇医药
1.00
1.00
0.71
0.79
MIC
1.00
1.00
1.00
ENR
0.33
0.80
HYD
0.70
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FET
△：方法缩写同表1
3.3种聚类方法的聚类结果：
(1)经最大距离法、最小距离法和平均距离法进行聚类分析，从3张聚类图中可以看出随着聚类类别的减少，同类对象间的最大距离不断增大，最大距离法和平均距离法的聚类结果较为接近。最短距离法在同类对象间的最大距离为0.2200，相似性为0.7800时就聚为一类，没有实际意义。从图1可以看出将15种方法聚为4类后再分为5类时，同类对象间最大距离有一个显著的跳跃，说明聚为5类时，类间的性质有着较为明显的改变，同时分为5类时的同类对象间最大距离为0.33，相似性为0.67仍较为理想，说明这5个分类是可行的。这5类分别为：①HEM、POX、ES、MIC和FET；②DEC、ESC和HYD；③DNC和MOT；④WEC、ENC和ENR；⑤MCO和EC。第一类主要反映细胞增殖和生长，第二类则主要反映A/D比值，以水螅为检测材料与以胚胎干细胞为检测材料的结果相似，因而在进行A/D比值筛选时，从胚胎发育过程的种属相近性考虑应首先选用胚胎干细胞毒性试验。第四类以胚胎发生为终点的啮齿类哺乳动物全胚胎培养与结合细胞集聚、细胞生长和细胞分化三终点的鸡胚神经视网膜细胞培养系统聚为一类，表明二者具有同等的预测价值，提示多终点的组合可以提高预测价值。但反映分化抑制的检测方法未能聚为一类，WEC和FET这两种分别采用啮齿类动物和脊椎动物的全胚胎培养系统也未能聚为一类。
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图1 最大距离法聚类过程图
(2)为排除测试化学物数目较少的EC和ENC对最终聚类结果的影响，仅对13种方法采用最长距离法获得的聚类过程见图2。从图中可以看出在最终聚类为5类时，同类对象间最大距离为0.33，相似性为0.67，这和15种方法的最大距离法的聚类情况基本一致。5类分别是①HEM POX FET；②WEC DEC ES HYD；③ESC MIC ENR；④MOT DNC。
图2 13种方法最大距离法聚类树
讨 论
运用多元统计学理论和方法逐步完善现有的毒理学体外预测体系是预测毒理学的重要研究内容，聚类分析、判别分析和因子分析等方法在致突变、致癌和眼角膜刺激试验的替代试验等方法都有了相应的应用[6，8，9]。本次研究是发育毒理学体外研究领域的一次初步探索，下面主要就影响聚类结果的因素以及聚类结果的发育毒理学意义作一简要讨论。
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1.影响聚类结果的主要因素(1)SMC的计算：SMC是表示两种测试方法对同一样品测试结果符合况的一个指标，弥补两分类资料数据不能计算相关系数的不足，可用于表示两分类数据相似性，其范围在0到1之间，越接近1，说明这两种方法测定结果的符合率越高，就化学物发育毒性体外测试而言，就越有可能提示这两种方法有着相同的测试机理，就不应选到同一个测试组合。国外在短期致癌试验聚类分析和神经性厌食症患者的临床症状研究中都采用了这一指标[6，7]。但由于SMC的计算受分母，即两种方法检测的相同化学物的数目的影响较大，当该数目小于8时就很难做出结论，Pet-Edwards等建议剔除这些资料，但这样会大大损失信息量。本研究的结果提示两种方法检测同一化学物总数小于8的竟达21%(52/252)，这也可能是聚类结果未能与发育异常的细胞机制完全吻合的重要原因，但剔除测试化学物数目较少的两种方法仍未能明显改善聚类结果，其中的原因值得进一步研究。(2)聚类方法的选择：本研究选用的3种聚类分析方法是系统聚类分析的常用方法，其中最短距离法的结果无实际意义，这与国外的对短期致癌试验的评价结论是一致的。最大距离法则表示类内的方法的相似性都大于或等于某一界值，一般情况下，这种方法的聚类结果较为理想[6]。(3)参照化学物的组成：化学物发育毒性体外试验中所选择的参照物中阳性发育毒物所占的比重较大也可能是聚类分析结果不理想的一个重要原因，因为发育毒物可能有会对多种细胞行为产生损害作用，导致多种检测终点同时表现阳性结果，使本不应归在一类的不同终点的方法却归在一类[5]。本次聚类分析的结果仅仅是初步的研究，随着发育毒理学研究的不断深入，特别是对发育异常机制的了解，检测方法的增多和完善将会使聚类结果更加符合发育毒理学的理论基础。
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2.聚类分析结果的发育毒理学意义：细胞生长(增殖)、分化和细胞间相互作用三种细胞行为是相互影响、相互依赖的，因而进行多终点组合应在多元统计学分析的基础上，结合所用方法的发育毒理学意义给予综合评价。将两个以上不同终点机械地组合不可能取得预期的结果，Steel等[8]将HEM和MOT组合后并未明显提高预测价值就是一个例证。根据Pet-Edwards等聚类分析结果理论分析[6]，本次聚类的结果的另外一个意义在于为未能得出特异度和灵敏度的筛选试验提供估计值，因为经聚类分析后归为一组的所有方法的这两个指标值相近。另外，在进行组合时，不宜选择属于同一簇(Cluster)的方法，因为这些方法之间有着较高的相关(似)性，在用Bayes定理计算预测价值时，两个以上的组合效果并不优于其中的任何一种方法的单独效应。因而如何借鉴致癌性预测和配套试验选择法(CPBS)的经验，结合各种方法的特异度和灵敏度，并根据经济有效和合理的原则，特别是参照国内实验室的实际条件，选择其中的哪些方法进行组合值得进一步研究。
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(修回日期 1998年10月), 百拇医药