酒精影响体外大鼠小胶质细胞的生存和繁殖
作者：杨志强 陈雯 Kane Cynthia JM
单位：杨志强 (广州医学院第二附属医院口腔科 510260)； 陈雯 (中山医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室)； Kane Cynthia JM (Depart.of Anatomy,University of Arkansas for Medical Sciences)
关键词：酒精；细胞毒性；细胞繁殖；小胶质细胞；大鼠
卫生毒理学杂志990104 内容摘要 本实验研究酒精对神经小胶质细胞(microglia)的毒性作用。用不同浓度的酒精[0.05，0.1，0.2，0.5%(g/dl)]处理体外原代培养的新生CD大鼠大脑皮质胶质细胞4天后，用MTT试验和BrdU掺入法分别测定酒精对细胞生存和繁殖的影响。结果显示：酒精对体外培养的小胶质细胞具有明显的毒性作用，存在剂量-反应关系，半数致死浓度为0.085%，在最高染毒浓度组可观察到80%的细胞死亡。酒精同时也抑制上述细胞的繁殖，染毒剂量为0.5%时，细胞的繁殖率被抑制了41%。结果表明：酒精抑制体外大鼠小胶质细胞的生存和繁殖，这种对细胞的直接毒作用可能在酒精导致的神经系统发育损伤中起重要的作用。
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Ethanol impairs the survival and proliferation of rat microglia in vitro
Yang Zhi-qiang
(The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College,510230)
Chen Wen Kane Cynthia JM
The cytotoxicity of ethanol on the primary cultured cells of brain microglia from newborn CD rat cerebral cortex was investigated.The primary cultured brain microglia cells were exposed to four respective doses of ethanol(0.05，0.1，0.2，0.5g/dl) for four days.The survival of microglia cells was examined by the MTT viability assay.The inhibition of ethanol on cell proliferation was quantified by the bromodeoxyuridine (BrdU)incorporation method.Ethanol was significantly toxic to cultured microglia cells,and the effect was dose-dependent.The LC50 for microglia survival was at the dose of 0.085g ethanol/dl.Up to 80% of cell death was observed at 0.5g/dl.Ethanol also inhibited cell proliferation of cultures of microglia.Ethanol at 0.5g/dl inhibited the cell proliferation of cultured microglia cells by 41% compared to the control group.Our results indicate that the inhibitory effect of ethanol on the cell growth of brain microglia cells may play an important role in ethanol intoxication that induced the impairment of brain development.
, 百拇医药
Key words:Ethanol;Cytotoxicity;Cell proliferation;Microglia;Rat
大量的实验证明母亲怀孕期饮酒会对胚胎造成损害，严重的可引起胎儿酒精综合征(Fetal Alcohol Syndrome,FAS)、胎儿神经系统发育异常或缺陷[1]。神经系统的发育和成熟异常又会使胎儿出生后出现一系列的大脑神经功能紊乱、行为异常等症状，这些症状通常是非特异性的，到目前为止仍无有效的治疗方法。已有实验证明酒精可影响神经元和星状胶质细胞的繁殖和成熟，影响神经递质的传递[2，3]。但酒精对神经系统内的另外一种细胞-小胶质细胞的影响却少有报道。本研究用纯化的CD新生大鼠大脑皮质原代培养的小胶质细胞作为研究对象，按照临床酒精中毒的标准(血中浓度0.2%～0.5%)设计几个低于或介于上述范围的剂量组，探讨酒精对体外培养的小胶质细胞的毒性作用。
材料与方法
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1.试剂：MTT(3-(4,5-Dimethylthiazolzyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)、多聚赖氨酸(Poly-L-lysine)从Sigma公司购买；BrdU免疫组化试剂盒从Boehringer Mannheim公司购买；细胞培养所用的试剂如DMEM、胎牛血清、谷氨酰胺等从BRL Life Technology公司购买。
2.小胶质细胞的原代培养和纯化[4]：取1～3天的新生CD大鼠大脑半球皮质部分，去除脑膜后在含0.2%胰蛋白酶的磷酸缓冲液中分散细胞，分离后的细胞用孔径为70μm的尼龙筛过滤，然后放置在含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺及抗菌素的DMEM培养液中进行培养。待细胞长到几乎满瓶时(用25cm2培养瓶培养时约需6～7天)，旋紧瓶口，在37℃的水浴振荡器中振荡16小时，速度为250r/min，然后把含有小胶质细胞的悬液，放入预先用多聚赖氨酸(Poly-L-lysine)处理过的24孔培养板中(BrdU试验在孔中放置一小圆形盖玻片)，培养4小时或待细胞完全贴壁后换液，再培养1天就可进行染毒，细胞密度约为4×103/cm2。经免疫组化方法鉴定，此原代培养的细胞含>98%的小胶质细胞，<2%的星状胶质细胞及<1%的少突胶质细胞。
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3.酒精染毒：本实验设计4个剂量组，分别为0.05，0.1，0.2，0.5%。把酒精加入含10%胎牛血清的DMEM培养液中处理细胞4天，为了防止酒精挥发，把培养板放入一塑料盒中，盒中盛有相同浓度的酒精水溶液，并按5%的比例向盒中注入CO2气体，最后把整个盒子放在5%CO2的培养箱中培养4天，培养期间不换液。
4.MMT试验[5]：细胞染毒4天后，换成含0.5mg/ml的MTT培养液培养4小时，移去培养液，加入0.15ml的DMSO溶液，在摇床上缓慢摇1小时或更长时间直至溶液出现紫蓝色，取100μl放入96孔比色板，在Beckman DU64酶标仪上测定吸收率(A)，检测波长为570nm。
5.BrdU掺入试验[6]：细胞染毒4天后，加入BrdU(10μmol/L)到培养液中处理细胞24小时，再用4%的多聚甲醛(paraformaldehyde)固定细胞10分，吸去多聚甲醛，储存细胞于磷酸缓冲液中(4℃)。用Vectastain ABC方法使BrdU标记的核DNA着色，其中抗-BrdU单克隆抗体的应用浓度为1∶15，生物素标记的马抗小鼠抗体的应用浓度为1∶100，伊红染色细胞后在低倍镜下计算20个视野中BrdU阳性细胞数，以BrdU阳性细胞数/总细胞数作为细胞的繁殖率。
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6.统计学处理：用Stat View软件的T-test。
结 果
1.酒清对体外大脑皮质小胶质细胞生存率的影响：
MTT只能被活细胞还原成一种紫色的结晶-formazan，紫色的深浅度与活细胞数成正比。用不同浓度的酒精处理纯化了的大脑小胶质细胞4天后，发现酒精对细胞有明显的毒性作用。从图1中可见酒清浓度为0.05%时，对细胞就有毒性作用，随着酒精浓度的增加，细胞存活率也随之下降，成剂量-反应关系，半数致死浓度为0.085%，最高剂量组0.5%的细胞相对存活率只有18.9%。各剂量组与对照组比较均存在差异显著性。
图1 酒精抑制小胶质细胞的生存(**P<0.01 ***P<0.001)
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2.酒清对体外大脑皮质小胶质细胞繁殖率的影响：
小胶质细胞染毒4天后，发现各剂量组的细胞繁殖率都有不同程度的下降，对照组的实际细胞繁殖率为47.6%，以各剂量组与对照组细胞繁殖率的比值作为细胞相对繁殖率，结果如图2所示，可见染毒剂量为0.5%时，细胞的繁殖率为对照组的58.6%，各剂量组与对照组比较均存在差异显著性(P<0.01)。
图2 酒精抑制小胶质细胞的繁殖(**P<0.01)
讨 论
小胶质细胞是神经系统的一种主要的胶质细胞之一，在胚胎期从单核母细胞分化而来，在发育的早期就已迁移到脑组织的一定部位，出生后继续发育成熟而成为吞噬细胞，它与神经元细胞的生存和功能密切相关[7]。小胶质细胞被激活时会释放细胞介素、合成神经营养因子，表达抗原并执行吞噬细胞的功能[7]。因此小胶质细胞受损必然会影响神经系统其它细胞的正常功能和内环境的稳定。本实验证明酒精对体外培养的小胶质细胞有直接的杀伤作用和抑制细胞繁殖的作用，且与神经元细胞和星状胶质细胞相比，对酒精毒性作用更加敏感。Heaton[8]报道酒精浓度≥4%时才对体外培养的神经元细胞产生明显的毒性作用，Guizzetti[9]发现酒精对星状胶质细胞产生毒作用的浓度为≥1.8%，而本研究发现对小胶质细胞的LD50仅为0.085%。酒精的直接毒性作用会减少神经系统中小胶质细胞的数目，故直接影响吞噬细胞的功能[10]。
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小胶质细胞在神经系统发育过程中起着重要的作用，它可以分泌许多神经营养因子和细胞因子，在调控神经元细胞和星状胶质细胞的生长、繁殖以及成熟过程中起重要的作用。酒精进入神经系统后可对各种细胞产生直接毒性作用，包括减少大脑某些部位神经元细胞的数目和破坏神经元与神经胶质细胞之间的正常关系。小胶质细胞对酒精相对敏感，酒精中毒导致的细胞数目减少和功能缺陷必然影响神经元细胞的生存和功能的正常。如果酒精中毒发生在神经系统发育的关键期，例如妇女在怀孕期摄入酒精，就会严重损害胎儿神经系统的发育，可致婴儿出现一系列的神经功能紊乱症状，在学龄儿童表现为记忆、认知和学习能力的下降，或表现为行为、动作协调能力的障碍。目前有关酒精中毒导致儿童智力障碍的机理仍未明确，神经元细胞仍然是研究的重点对象，但酒精对各种胶质细胞的影响作用不容忽视，对这些方面的深入研究有助于揭示酒精中毒的机制。
参考文献
1.Stratton KC，Howe C，Battaglia F(Ed).Fetal alcohol syndrome:diagnosis，epidemiology，prevention，and Treatment.Washington，DC，Institute of Medicine，National Academy.1996,213.
, http://www.100md.com
2.Mooney Sm，Napper RMA and West JR.Long-term effect of postnatal alcohol exposure on the number of cells in the neocortex of the rat: a stereological study.Alcoholism Clin.Exp.Res.1996,20:615～623.
3.Light KE，Serbus DC and Santiago M.Exposure of rats to ethanol from postnatal days 4 to 8: alterations of cholinergic neurochemistry in the cerebral cortex and corpus striatum at day 20.Alcoholism Clin.Exp.Res.1989,13:29～35.
4.Giulian D，Baker TJ.Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain.J.Neurosci.1986,6:2163～2178.
, http://www.100md.com
5.Hussain RF，Noun AME and Oliver RTD.A new approach for measurement of cytotoxicity using colorimetric assay.J.Immunological Methods.1993,160:89～96.
6.Kane CJM，Berry A，Boop FA，et al.Proliferation of astroglia from the adult human cerebrum is inhibited by ethanol in Vitro.1996,731:39～44.
7.Giulian D，Li J，Leara B，et al.Phagocytic microglia release cytokines and cytotoxins that regulate the survival of astrocytes and neurons in culture.Neurochemistry International.1994,25:227～233.
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8.Heaton MB，Paiva M，Swanson DJ，et al.Responsiveness of culture septal and hippocampal neurons to ethanol and neurotrophic substances.J Neurosci Res.1994，39:305～318.
9.Guizzetti M，Costa LG.Inhibition of muscarinic receptor-stimulated glial cell proliferation by ethanol.Alcoholism Clin Exp Res.1996，20:30A.
10.Banati RB，Gehrmann J，Schubert P，et al.Cytotoxicity of microglia.Glia.1993，7:111～118.
(修回日期 1998年11月), 百拇医药
单位：杨志强 (广州医学院第二附属医院口腔科 510260)； 陈雯 (中山医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室)； Kane Cynthia JM (Depart.of Anatomy,University of Arkansas for Medical Sciences)
关键词：酒精；细胞毒性；细胞繁殖；小胶质细胞；大鼠
卫生毒理学杂志990104 内容摘要 本实验研究酒精对神经小胶质细胞(microglia)的毒性作用。用不同浓度的酒精[0.05，0.1，0.2，0.5%(g/dl)]处理体外原代培养的新生CD大鼠大脑皮质胶质细胞4天后，用MTT试验和BrdU掺入法分别测定酒精对细胞生存和繁殖的影响。结果显示：酒精对体外培养的小胶质细胞具有明显的毒性作用，存在剂量-反应关系，半数致死浓度为0.085%，在最高染毒浓度组可观察到80%的细胞死亡。酒精同时也抑制上述细胞的繁殖，染毒剂量为0.5%时，细胞的繁殖率被抑制了41%。结果表明：酒精抑制体外大鼠小胶质细胞的生存和繁殖，这种对细胞的直接毒作用可能在酒精导致的神经系统发育损伤中起重要的作用。
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Ethanol impairs the survival and proliferation of rat microglia in vitro
Yang Zhi-qiang
(The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College,510230)
Chen Wen Kane Cynthia JM
The cytotoxicity of ethanol on the primary cultured cells of brain microglia from newborn CD rat cerebral cortex was investigated.The primary cultured brain microglia cells were exposed to four respective doses of ethanol(0.05，0.1，0.2，0.5g/dl) for four days.The survival of microglia cells was examined by the MTT viability assay.The inhibition of ethanol on cell proliferation was quantified by the bromodeoxyuridine (BrdU)incorporation method.Ethanol was significantly toxic to cultured microglia cells,and the effect was dose-dependent.The LC50 for microglia survival was at the dose of 0.085g ethanol/dl.Up to 80% of cell death was observed at 0.5g/dl.Ethanol also inhibited cell proliferation of cultures of microglia.Ethanol at 0.5g/dl inhibited the cell proliferation of cultured microglia cells by 41% compared to the control group.Our results indicate that the inhibitory effect of ethanol on the cell growth of brain microglia cells may play an important role in ethanol intoxication that induced the impairment of brain development.
, 百拇医药
Key words:Ethanol;Cytotoxicity;Cell proliferation;Microglia;Rat
大量的实验证明母亲怀孕期饮酒会对胚胎造成损害，严重的可引起胎儿酒精综合征(Fetal Alcohol Syndrome,FAS)、胎儿神经系统发育异常或缺陷[1]。神经系统的发育和成熟异常又会使胎儿出生后出现一系列的大脑神经功能紊乱、行为异常等症状，这些症状通常是非特异性的，到目前为止仍无有效的治疗方法。已有实验证明酒精可影响神经元和星状胶质细胞的繁殖和成熟，影响神经递质的传递[2，3]。但酒精对神经系统内的另外一种细胞-小胶质细胞的影响却少有报道。本研究用纯化的CD新生大鼠大脑皮质原代培养的小胶质细胞作为研究对象，按照临床酒精中毒的标准(血中浓度0.2%～0.5%)设计几个低于或介于上述范围的剂量组，探讨酒精对体外培养的小胶质细胞的毒性作用。
材料与方法
, http://www.100md.com
1.试剂：MTT(3-(4,5-Dimethylthiazolzyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)、多聚赖氨酸(Poly-L-lysine)从Sigma公司购买；BrdU免疫组化试剂盒从Boehringer Mannheim公司购买；细胞培养所用的试剂如DMEM、胎牛血清、谷氨酰胺等从BRL Life Technology公司购买。
2.小胶质细胞的原代培养和纯化[4]：取1～3天的新生CD大鼠大脑半球皮质部分，去除脑膜后在含0.2%胰蛋白酶的磷酸缓冲液中分散细胞，分离后的细胞用孔径为70μm的尼龙筛过滤，然后放置在含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺及抗菌素的DMEM培养液中进行培养。待细胞长到几乎满瓶时(用25cm2培养瓶培养时约需6～7天)，旋紧瓶口，在37℃的水浴振荡器中振荡16小时，速度为250r/min，然后把含有小胶质细胞的悬液，放入预先用多聚赖氨酸(Poly-L-lysine)处理过的24孔培养板中(BrdU试验在孔中放置一小圆形盖玻片)，培养4小时或待细胞完全贴壁后换液，再培养1天就可进行染毒，细胞密度约为4×103/cm2。经免疫组化方法鉴定，此原代培养的细胞含>98%的小胶质细胞，<2%的星状胶质细胞及<1%的少突胶质细胞。
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3.酒精染毒：本实验设计4个剂量组，分别为0.05，0.1，0.2，0.5%。把酒精加入含10%胎牛血清的DMEM培养液中处理细胞4天，为了防止酒精挥发，把培养板放入一塑料盒中，盒中盛有相同浓度的酒精水溶液，并按5%的比例向盒中注入CO2气体，最后把整个盒子放在5%CO2的培养箱中培养4天，培养期间不换液。
4.MMT试验[5]：细胞染毒4天后，换成含0.5mg/ml的MTT培养液培养4小时，移去培养液，加入0.15ml的DMSO溶液，在摇床上缓慢摇1小时或更长时间直至溶液出现紫蓝色，取100μl放入96孔比色板，在Beckman DU64酶标仪上测定吸收率(A)，检测波长为570nm。
5.BrdU掺入试验[6]：细胞染毒4天后，加入BrdU(10μmol/L)到培养液中处理细胞24小时，再用4%的多聚甲醛(paraformaldehyde)固定细胞10分，吸去多聚甲醛，储存细胞于磷酸缓冲液中(4℃)。用Vectastain ABC方法使BrdU标记的核DNA着色，其中抗-BrdU单克隆抗体的应用浓度为1∶15，生物素标记的马抗小鼠抗体的应用浓度为1∶100，伊红染色细胞后在低倍镜下计算20个视野中BrdU阳性细胞数，以BrdU阳性细胞数/总细胞数作为细胞的繁殖率。
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6.统计学处理：用Stat View软件的T-test。
结 果
1.酒清对体外大脑皮质小胶质细胞生存率的影响：
MTT只能被活细胞还原成一种紫色的结晶-formazan，紫色的深浅度与活细胞数成正比。用不同浓度的酒精处理纯化了的大脑小胶质细胞4天后，发现酒精对细胞有明显的毒性作用。从图1中可见酒清浓度为0.05%时，对细胞就有毒性作用，随着酒精浓度的增加，细胞存活率也随之下降，成剂量-反应关系，半数致死浓度为0.085%，最高剂量组0.5%的细胞相对存活率只有18.9%。各剂量组与对照组比较均存在差异显著性。
图1 酒精抑制小胶质细胞的生存(**P<0.01 ***P<0.001)
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2.酒清对体外大脑皮质小胶质细胞繁殖率的影响：
小胶质细胞染毒4天后，发现各剂量组的细胞繁殖率都有不同程度的下降，对照组的实际细胞繁殖率为47.6%，以各剂量组与对照组细胞繁殖率的比值作为细胞相对繁殖率，结果如图2所示，可见染毒剂量为0.5%时，细胞的繁殖率为对照组的58.6%，各剂量组与对照组比较均存在差异显著性(P<0.01)。
图2 酒精抑制小胶质细胞的繁殖(**P<0.01)
讨 论
小胶质细胞是神经系统的一种主要的胶质细胞之一，在胚胎期从单核母细胞分化而来，在发育的早期就已迁移到脑组织的一定部位，出生后继续发育成熟而成为吞噬细胞，它与神经元细胞的生存和功能密切相关[7]。小胶质细胞被激活时会释放细胞介素、合成神经营养因子，表达抗原并执行吞噬细胞的功能[7]。因此小胶质细胞受损必然会影响神经系统其它细胞的正常功能和内环境的稳定。本实验证明酒精对体外培养的小胶质细胞有直接的杀伤作用和抑制细胞繁殖的作用，且与神经元细胞和星状胶质细胞相比，对酒精毒性作用更加敏感。Heaton[8]报道酒精浓度≥4%时才对体外培养的神经元细胞产生明显的毒性作用，Guizzetti[9]发现酒精对星状胶质细胞产生毒作用的浓度为≥1.8%，而本研究发现对小胶质细胞的LD50仅为0.085%。酒精的直接毒性作用会减少神经系统中小胶质细胞的数目，故直接影响吞噬细胞的功能[10]。
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小胶质细胞在神经系统发育过程中起着重要的作用，它可以分泌许多神经营养因子和细胞因子，在调控神经元细胞和星状胶质细胞的生长、繁殖以及成熟过程中起重要的作用。酒精进入神经系统后可对各种细胞产生直接毒性作用，包括减少大脑某些部位神经元细胞的数目和破坏神经元与神经胶质细胞之间的正常关系。小胶质细胞对酒精相对敏感，酒精中毒导致的细胞数目减少和功能缺陷必然影响神经元细胞的生存和功能的正常。如果酒精中毒发生在神经系统发育的关键期，例如妇女在怀孕期摄入酒精，就会严重损害胎儿神经系统的发育，可致婴儿出现一系列的神经功能紊乱症状，在学龄儿童表现为记忆、认知和学习能力的下降，或表现为行为、动作协调能力的障碍。目前有关酒精中毒导致儿童智力障碍的机理仍未明确，神经元细胞仍然是研究的重点对象，但酒精对各种胶质细胞的影响作用不容忽视，对这些方面的深入研究有助于揭示酒精中毒的机制。
参考文献
1.Stratton KC，Howe C，Battaglia F(Ed).Fetal alcohol syndrome:diagnosis，epidemiology，prevention，and Treatment.Washington，DC，Institute of Medicine，National Academy.1996,213.
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2.Mooney Sm，Napper RMA and West JR.Long-term effect of postnatal alcohol exposure on the number of cells in the neocortex of the rat: a stereological study.Alcoholism Clin.Exp.Res.1996,20:615～623.
3.Light KE，Serbus DC and Santiago M.Exposure of rats to ethanol from postnatal days 4 to 8: alterations of cholinergic neurochemistry in the cerebral cortex and corpus striatum at day 20.Alcoholism Clin.Exp.Res.1989,13:29～35.
4.Giulian D，Baker TJ.Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain.J.Neurosci.1986,6:2163～2178.
, http://www.100md.com
5.Hussain RF，Noun AME and Oliver RTD.A new approach for measurement of cytotoxicity using colorimetric assay.J.Immunological Methods.1993,160:89～96.
6.Kane CJM，Berry A，Boop FA，et al.Proliferation of astroglia from the adult human cerebrum is inhibited by ethanol in Vitro.1996,731:39～44.
7.Giulian D，Li J，Leara B，et al.Phagocytic microglia release cytokines and cytotoxins that regulate the survival of astrocytes and neurons in culture.Neurochemistry International.1994,25:227～233.
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8.Heaton MB，Paiva M，Swanson DJ，et al.Responsiveness of culture septal and hippocampal neurons to ethanol and neurotrophic substances.J Neurosci Res.1994，39:305～318.
9.Guizzetti M，Costa LG.Inhibition of muscarinic receptor-stimulated glial cell proliferation by ethanol.Alcoholism Clin Exp Res.1996，20:30A.
10.Banati RB，Gehrmann J，Schubert P，et al.Cytotoxicity of microglia.Glia.1993，7:111～118.
(修回日期 1998年11月), 百拇医药