CS2对原代星形胶质细胞的毒性研究
作者：高艳华 梁友信 傅慰祖 张胜年
单位：高艳华 梁友信 (上海医科大学劳动卫生学教研室 200032)； 傅慰祖 张胜年 (上海市劳动卫生职业病防治研究所)
关键词：二硫化碳；细胞毒性；星形胶质细胞；Na+-K+-ATP酶
卫生毒理学杂志990101 内容摘要 为探讨CS2的神经毒性机制及体外评价方法，我们研究了CS2对原代星形胶质细胞的毒性，采用常规培养方法，观察CS2染毒(0，10，100，1000，10000μmol/L对星形胶质细胞脱落、细胞形态学、及Na+-K+-ATP酶活性的影响。结果表明：CS2染毒可使细胞脱落数增加，且与接触剂量和接触时间有关；细胞形态学明显异常，电镜下观察表现为髓样小体的形成及空泡样改变；Na+-K+-ATP酶活性下降。提示CS2对于星形胶质细胞有明显的毒性，此酶活性的下降可作为CS2毒性的一种标志物。
, 百拇医药
Cytotoxic effects of CS2 on the cultured astrocytes in rats
Gao Yan-hua Liang You-xin Fu Wei-zu et al.
(Dept.Occupational Health，Shanghai Medical University，200032)
Astrocytes were cultivated with CS2 at levels of 10,100,1000,10000μmol/L,respectively.The detached cells increased with the increase of CS2 concentration and exposure duration.By light microscope,the morphologic characteristics were observed changed in CS2-treated cells.Mitochondria Swelling,endoplasmic rcticulum cnlarging and corpus mcdullar incrcasing were found using EM.There was also a significant reduction of Na+-K+-ATPase activity in CS2 treated cells.
, 百拇医药
Key words:carbon disulfide;astrocyte;cytotoxicity;Na+-K+-ATPase
外源性化学物神经毒作用的评估目前在国内外引起了广泛关注[1]。据估计大约有800多种工业毒物可引起神经行为改变，20000种化学物与神经毒作用有关，其中有机溶剂占很大的比例。细胞培养具有细胞单一、观察直接等优点，已成为筛选神经毒物，探索毒作用机制的重要方法[2，3]。CS2属神经性毒物，对于其毒作用机理尚有许多问题有待解决。近年来，有研究认为星形胶质细胞增生为有机溶剂中毒的共同标志物[4]，这种增生性反应与毒物所引起的多种毒性效应密切相关。因此，本研究通过细胞培养，在体外直接观察CS2对于原代培养星形胶质细胞的影响，以探讨CS2的毒作用机理，同时也为其它神经性毒物的体外评价方法提供借鉴。
, http://www.100md.com
材料与方法
1.试剂与药品：Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)培养基，Gibco公司；胰蛋白酶，Sigma；小牛血清，上海医科大学放医所；GFAP(Glical fibrillarg Acidic Protein)多克隆抗体、羊抗兔IgG抗血清、正常羊血清、兔过氧物酶抗过氧化物酶(PAP)，上海医科大学病理教研室；青霉素、链霉素，上海延安制药厂；二胺基联苯胺(DAB)，Dako公司。
实验动物：SD新生大鼠(1～3天龄)，由上海医科大学动物部提供。
2.分离培养方法：[5]
无菌状态下，将1～3天龄大鼠断头，迅速取脑，在解剖显微镜下剥离脑膜，去除血管组织，取皮层，充分剪碎后移入含有终浓度为0.25%胰蛋白酶的DMEM培养液中，充分混匀，37℃温育15分，加入1ml小牛血清终止反应，并加D-Hank's营养液清洗，1500r/min离心15分，共3次，弃上清，加入DMEM营养液，混匀，以血球计数板计数，调整细胞浓度为6×105/ml,并以苔盼蓝检查细胞存活率大于95%，将此浓度细胞悬液1ml接种于35mm塑料培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育，48小时后以D-Hank's液清洗，以除去碎片及少量细胞团块，并更换培养液，以后每周换液2～3次。
, http://www.100md.com
3.星形胶质细胞的免疫组化：[6]
取贴壁的星形胶质细胞，用PBS洗涤(3×5分)，然后在4%的多聚甲醛中固定20～30分；再以PBS洗涤(3×5分)，加正常羊血清(1∶20)，室温30分；加1∶400免抗牛GFAP抗体，4℃下过夜；如前洗涤；再加羊抗免IgG抗体(1∶200)，37℃孵育30分；如前洗涤，加兔PAP(1∶200)37℃作用30分，再以PBS洗涤5分；DAB显色1分，以PBS充分洗涤，经各级酒精脱水，二甲苯透明，最后以中性树胶封片，显微镜下观察。
4.染毒途径及测试指标：
星形胶质细胞培养成熟(2周左右)后，加入终浓度为0，10，100，1000及10000μmol/L的CS2。
(1)生长与脱壁的研究：分别于0，12，24，48，72小时后吸出培养液，离心后在显微镜下计数，以得到每皿脱落细胞数。
, http://www.100md.com
(2)形态学观察：星形胶质细胞染毒后，每天在倒置相差显微镜下观察；与CS2共培养72小时的细胞经PBS清洗后，以2.5%戊二醛固定，常规制备电镜标本，在JEDL JEM-1200EX Electron Macroscope下观察，并拍摄照片。
(3)Na+-K+-ATP酶的测定：在与CS2共同培养72小时后，吸出培液，加入0.25%胰蛋白酶0.5ml，37℃作用20分，以小牛血清终止反应，经清洗后，收集细胞用于测定Na+-K+-ATP酶活性[7]。结果用染毒组酶活性占对照组的百分比表示。
结 果
1.生长与脱壁：
接种12小时后，大部分细胞开始贴壁，少数细胞有突起，呈多角形。48小时后，细胞呈生长状态，为多角形；再以每两天分裂一次的速度增殖，培养10天后，细胞在培养皿内形成均匀单层贴壁，细胞呈梭形。以PAP法作免疫组化，证实分离的细胞为星形胶质细胞。待培养成熟后，加入含不同CS2浓度的二甲基亚砜(DMSO)溶液，计算不同染毒时间的脱壁细胞数，结果见表1，随着染毒剂量增高和染毒时间延长，细胞脱落数增加；24小时后，10000μmol/L染毒组与对照组相比差异达显著性水平。
, 百拇医药
表1 CS2对星形胶质细胞脱壁的影响(×103/
±s) CS2浓度
样本
作用时间(小时)
0
12
24
48
72
0
5
6.8±4.0
, 百拇医药
6.4±2.7
5.4±2.3
9.4±4.4
8.4±6.5
10
5
7.0±4.1
9.8±2.6
10.8±3.7
13.4±4.5
25.4±9.9
100
, http://www.100md.com 5
8.2±6.2
9.6±5.3
15.0±4.4
19.6±10.4
25.6±17.0
1000
5
7.8±6.3
8.8±5.9
14.6±8.2
18.2±11.9
, 百拇医药 25.8±6.4
10000
5
5.8±4.3
8.4±3.9
18.2±10.4*
26.4±15.9*
40.8±17.2*
F值
0.17
0.50
2.82
, 百拇医药
1.92
4.29
P值
0.9519
0.7391
0.0528
0.0146
0.0115
2.形态学观察：
相差显微镜下可见，对照组细胞呈梭形生长，与CS2共同培养24小时后，细胞形态未见明显异常，48小时后细胞开始失去正常的形态，变为多角形或不规则形，随染毒浓度增加，细胞形态学改变加重。
, 百拇医药
3.透射电镜观察：
正常培养的星形胶质细胞，细胞核着色淡且疏松，核仁不明显，胞质的基质较疏松，着色均匀，有疏松分布的核糖体和内质网，线粒体数量多，体积小，可见到溶酶体(图1)。染毒组可见核周间隙增宽，内质网肿胀扩张，溶酶体含量增多，有大量髓样小体形成，胞浆内出现空泡。随染毒剂量增加，溶酶体及髓样小体含量增加，胶质微丝含量增多(图2)。
图1 对照组星形胶质细胞透射电镜观察(20000×)
图2 与10000μmol/L共同培养的星形胶质细胞透射电镜观察(24000×)
4.星形胶质细胞Na+-K+-ATP酶活力：
, http://www.100md.com
染毒72小时后，随染毒浓度的增加，Na+-K+-ATP酶的活力受到抑制，在1000μmol/L染毒组达到显著性水平(表2)。
表2 CS2对星形胶质细胞Na+-K+-ATP酶活性影响(±s) CS2(μmol/L)
样本
Na+-K+-ATP酶活性
0
5
12.56±2.87
, 百拇医药
10
5
9.42±4.46
100
5
8.52±3.57
1000
5
5.54±3.37*
10000
5
4.36±2.03*
, http://www.100md.com
F值
4.69
P值
0.0078
讨 论
本研究发现CS2可对神经胶质细胞产生明显的毒性损伤，表现为脱落数增加，细胞形状改变及Na+-K+-ATP酶活性的异常。超微结构改变主要表现为内质网肿胀、扩张，溶酶体及髓样小体含量增加等弥漫性改变，其中髓样小体的形成可能是由于CS2对细胞膜结构的直接破坏作用，导致细胞器膜通透性改变，细胞器发生肿胀、变性、坏死，溶酶体吞噬形成。并在整体实验[7]中也发现CS2可导致星形胶质细胞的增生及形态改变，与体外实验结果有相似之处。最近研究[8]认为，CS2可与蛋白质结合后，导致蛋白质分子间及分子内的共价交联，认为这是导致CS2病理改变的基础。推测CS2对于星形胶质细胞的影响，可能是由于CS2与细胞膜上的蛋白质发生反应，导致细胞膜结构的异常，进而影响了膜结合酶的活性。提示星形胶质细胞的体外培养可为神经性毒物的评价提供一种辅助方法，细胞膜上结合酶的活性可作为评价毒性的一种重要的标志物。
, 百拇医药
参考文献
1.Johnsen H.Lud SP，Matikainen，et al.Occupational neurotoxicity: Criteria document for evaluation of existing data.National Institutes of Occupational Health.Denmark(Nordic Council of Minister)，1992.
2.Veroncsi B.In vitro screening batteries for neurotoxicants.Ncurotoxicology 1992,13:185～196.
3.Green S.Validation and in vitro neurotoxicity.Clinical and Experimental and Physiology，1995，22:383～384.
, http://www.100md.com
4.Eng LF.Experimental Models for astrocyte activation and fibrous gliosis.In Glial-neuronal Communication in Development and Regeneration (H.H.Althaus and W.Scifert.Eds).Springer-verlag，Heidelberg，1987,27～40.
5.Olson JE，Holtzman D.Respiration in rat cerebral astrocytes from primary culture.Journal of Neuroscience Research，1980,5:497～506.
6.刘彦芳.免疫组织化学.北京：人民卫生出版社，1990，66.
7.Leong SF，Leung TKC.Diabetes induced by atreptozocin causes reduced Na+-K+-ATPase in the brain.Neurochemical Research，1996,16:1161～1165.
8.Graham DG，Amarnath V，Valentine WM，et al.Pathogenic studies of hexane and carbon disulfide neurotoxicity.Critical Reviews in Toxicology，1995,25(2):91～112.
(修回日期 1998年11月), http://www.100md.com
单位：高艳华 梁友信 (上海医科大学劳动卫生学教研室 200032)； 傅慰祖 张胜年 (上海市劳动卫生职业病防治研究所)
关键词：二硫化碳；细胞毒性；星形胶质细胞；Na+-K+-ATP酶
卫生毒理学杂志990101 内容摘要 为探讨CS2的神经毒性机制及体外评价方法，我们研究了CS2对原代星形胶质细胞的毒性，采用常规培养方法，观察CS2染毒(0，10，100，1000，10000μmol/L对星形胶质细胞脱落、细胞形态学、及Na+-K+-ATP酶活性的影响。结果表明：CS2染毒可使细胞脱落数增加，且与接触剂量和接触时间有关；细胞形态学明显异常，电镜下观察表现为髓样小体的形成及空泡样改变；Na+-K+-ATP酶活性下降。提示CS2对于星形胶质细胞有明显的毒性，此酶活性的下降可作为CS2毒性的一种标志物。
, 百拇医药
Cytotoxic effects of CS2 on the cultured astrocytes in rats
Gao Yan-hua Liang You-xin Fu Wei-zu et al.
(Dept.Occupational Health，Shanghai Medical University，200032)
Astrocytes were cultivated with CS2 at levels of 10,100,1000,10000μmol/L,respectively.The detached cells increased with the increase of CS2 concentration and exposure duration.By light microscope,the morphologic characteristics were observed changed in CS2-treated cells.Mitochondria Swelling,endoplasmic rcticulum cnlarging and corpus mcdullar incrcasing were found using EM.There was also a significant reduction of Na+-K+-ATPase activity in CS2 treated cells.
, 百拇医药
Key words:carbon disulfide;astrocyte;cytotoxicity;Na+-K+-ATPase
外源性化学物神经毒作用的评估目前在国内外引起了广泛关注[1]。据估计大约有800多种工业毒物可引起神经行为改变，20000种化学物与神经毒作用有关，其中有机溶剂占很大的比例。细胞培养具有细胞单一、观察直接等优点，已成为筛选神经毒物，探索毒作用机制的重要方法[2，3]。CS2属神经性毒物，对于其毒作用机理尚有许多问题有待解决。近年来，有研究认为星形胶质细胞增生为有机溶剂中毒的共同标志物[4]，这种增生性反应与毒物所引起的多种毒性效应密切相关。因此，本研究通过细胞培养，在体外直接观察CS2对于原代培养星形胶质细胞的影响，以探讨CS2的毒作用机理，同时也为其它神经性毒物的体外评价方法提供借鉴。
, http://www.100md.com
材料与方法
1.试剂与药品：Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)培养基，Gibco公司；胰蛋白酶，Sigma；小牛血清，上海医科大学放医所；GFAP(Glical fibrillarg Acidic Protein)多克隆抗体、羊抗兔IgG抗血清、正常羊血清、兔过氧物酶抗过氧化物酶(PAP)，上海医科大学病理教研室；青霉素、链霉素，上海延安制药厂；二胺基联苯胺(DAB)，Dako公司。
实验动物：SD新生大鼠(1～3天龄)，由上海医科大学动物部提供。
2.分离培养方法：[5]
无菌状态下，将1～3天龄大鼠断头，迅速取脑，在解剖显微镜下剥离脑膜，去除血管组织，取皮层，充分剪碎后移入含有终浓度为0.25%胰蛋白酶的DMEM培养液中，充分混匀，37℃温育15分，加入1ml小牛血清终止反应，并加D-Hank's营养液清洗，1500r/min离心15分，共3次，弃上清，加入DMEM营养液，混匀，以血球计数板计数，调整细胞浓度为6×105/ml,并以苔盼蓝检查细胞存活率大于95%，将此浓度细胞悬液1ml接种于35mm塑料培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育，48小时后以D-Hank's液清洗，以除去碎片及少量细胞团块，并更换培养液，以后每周换液2～3次。
, http://www.100md.com
3.星形胶质细胞的免疫组化：[6]
取贴壁的星形胶质细胞，用PBS洗涤(3×5分)，然后在4%的多聚甲醛中固定20～30分；再以PBS洗涤(3×5分)，加正常羊血清(1∶20)，室温30分；加1∶400免抗牛GFAP抗体，4℃下过夜；如前洗涤；再加羊抗免IgG抗体(1∶200)，37℃孵育30分；如前洗涤，加兔PAP(1∶200)37℃作用30分，再以PBS洗涤5分；DAB显色1分，以PBS充分洗涤，经各级酒精脱水，二甲苯透明，最后以中性树胶封片，显微镜下观察。
4.染毒途径及测试指标：
星形胶质细胞培养成熟(2周左右)后，加入终浓度为0，10，100，1000及10000μmol/L的CS2。
(1)生长与脱壁的研究：分别于0，12，24，48，72小时后吸出培养液，离心后在显微镜下计数，以得到每皿脱落细胞数。
, http://www.100md.com
(2)形态学观察：星形胶质细胞染毒后，每天在倒置相差显微镜下观察；与CS2共培养72小时的细胞经PBS清洗后，以2.5%戊二醛固定，常规制备电镜标本，在JEDL JEM-1200EX Electron Macroscope下观察，并拍摄照片。
(3)Na+-K+-ATP酶的测定：在与CS2共同培养72小时后，吸出培液，加入0.25%胰蛋白酶0.5ml，37℃作用20分，以小牛血清终止反应，经清洗后，收集细胞用于测定Na+-K+-ATP酶活性[7]。结果用染毒组酶活性占对照组的百分比表示。
结 果
1.生长与脱壁：
接种12小时后，大部分细胞开始贴壁，少数细胞有突起，呈多角形。48小时后，细胞呈生长状态，为多角形；再以每两天分裂一次的速度增殖，培养10天后，细胞在培养皿内形成均匀单层贴壁，细胞呈梭形。以PAP法作免疫组化，证实分离的细胞为星形胶质细胞。待培养成熟后，加入含不同CS2浓度的二甲基亚砜(DMSO)溶液，计算不同染毒时间的脱壁细胞数，结果见表1，随着染毒剂量增高和染毒时间延长，细胞脱落数增加；24小时后，10000μmol/L染毒组与对照组相比差异达显著性水平。
, 百拇医药
表1 CS2对星形胶质细胞脱壁的影响(×103/
±s) CS2浓度样本
作用时间(小时)
0
12
24
48
72
0
5
6.8±4.0
, 百拇医药
6.4±2.7
5.4±2.3
9.4±4.4
8.4±6.5
10
5
7.0±4.1
9.8±2.6
10.8±3.7
13.4±4.5
25.4±9.9
100
, http://www.100md.com 5
8.2±6.2
9.6±5.3
15.0±4.4
19.6±10.4
25.6±17.0
1000
5
7.8±6.3
8.8±5.9
14.6±8.2
18.2±11.9
, 百拇医药 25.8±6.4
10000
5
5.8±4.3
8.4±3.9
18.2±10.4*
26.4±15.9*
40.8±17.2*
F值
0.17
0.50
2.82
, 百拇医药
1.92
4.29
P值
0.9519
0.7391
0.0528
0.0146
0.0115
2.形态学观察：
相差显微镜下可见，对照组细胞呈梭形生长，与CS2共同培养24小时后，细胞形态未见明显异常，48小时后细胞开始失去正常的形态，变为多角形或不规则形，随染毒浓度增加，细胞形态学改变加重。
, 百拇医药
3.透射电镜观察：
正常培养的星形胶质细胞，细胞核着色淡且疏松，核仁不明显，胞质的基质较疏松，着色均匀，有疏松分布的核糖体和内质网，线粒体数量多，体积小，可见到溶酶体(图1)。染毒组可见核周间隙增宽，内质网肿胀扩张，溶酶体含量增多，有大量髓样小体形成，胞浆内出现空泡。随染毒剂量增加，溶酶体及髓样小体含量增加，胶质微丝含量增多(图2)。
图1 对照组星形胶质细胞透射电镜观察(20000×)
图2 与10000μmol/L共同培养的星形胶质细胞透射电镜观察(24000×)
4.星形胶质细胞Na+-K+-ATP酶活力：
, http://www.100md.com
染毒72小时后，随染毒浓度的增加，Na+-K+-ATP酶的活力受到抑制，在1000μmol/L染毒组达到显著性水平(表2)。
表2 CS2对星形胶质细胞Na+-K+-ATP酶活性影响(
±s) CS2(μmol/L)样本
Na+-K+-ATP酶活性
0
5
12.56±2.87
, 百拇医药
10
5
9.42±4.46
100
5
8.52±3.57
1000
5
5.54±3.37*
10000
5
4.36±2.03*
, http://www.100md.com
F值
4.69
P值
0.0078
讨 论
本研究发现CS2可对神经胶质细胞产生明显的毒性损伤，表现为脱落数增加，细胞形状改变及Na+-K+-ATP酶活性的异常。超微结构改变主要表现为内质网肿胀、扩张，溶酶体及髓样小体含量增加等弥漫性改变，其中髓样小体的形成可能是由于CS2对细胞膜结构的直接破坏作用，导致细胞器膜通透性改变，细胞器发生肿胀、变性、坏死，溶酶体吞噬形成。并在整体实验[7]中也发现CS2可导致星形胶质细胞的增生及形态改变，与体外实验结果有相似之处。最近研究[8]认为，CS2可与蛋白质结合后，导致蛋白质分子间及分子内的共价交联，认为这是导致CS2病理改变的基础。推测CS2对于星形胶质细胞的影响，可能是由于CS2与细胞膜上的蛋白质发生反应，导致细胞膜结构的异常，进而影响了膜结合酶的活性。提示星形胶质细胞的体外培养可为神经性毒物的评价提供一种辅助方法，细胞膜上结合酶的活性可作为评价毒性的一种重要的标志物。
, 百拇医药
参考文献
1.Johnsen H.Lud SP，Matikainen，et al.Occupational neurotoxicity: Criteria document for evaluation of existing data.National Institutes of Occupational Health.Denmark(Nordic Council of Minister)，1992.
2.Veroncsi B.In vitro screening batteries for neurotoxicants.Ncurotoxicology 1992,13:185～196.
3.Green S.Validation and in vitro neurotoxicity.Clinical and Experimental and Physiology，1995，22:383～384.
, http://www.100md.com
4.Eng LF.Experimental Models for astrocyte activation and fibrous gliosis.In Glial-neuronal Communication in Development and Regeneration (H.H.Althaus and W.Scifert.Eds).Springer-verlag，Heidelberg，1987,27～40.
5.Olson JE，Holtzman D.Respiration in rat cerebral astrocytes from primary culture.Journal of Neuroscience Research，1980,5:497～506.
6.刘彦芳.免疫组织化学.北京：人民卫生出版社，1990，66.
7.Leong SF，Leung TKC.Diabetes induced by atreptozocin causes reduced Na+-K+-ATPase in the brain.Neurochemical Research，1996,16:1161～1165.
8.Graham DG，Amarnath V，Valentine WM，et al.Pathogenic studies of hexane and carbon disulfide neurotoxicity.Critical Reviews in Toxicology，1995,25(2):91～112.
(修回日期 1998年11月), http://www.100md.com