胸腺上皮细胞上清液促进85细胞增殖的研究
作者：龙建平1 黄 卫2
单位：1中山医科大学分子医学研究中心(510089)； 2广东省心血管病研究所(510080)
关键词：人胸腺上皮细胞；上清液；增殖；生存
广东医学990103 【摘要】 目的 比较不同培养条件下原代人胸腺上皮细胞生长情况，观察上清液对T细胞株85细胞增殖及存活的效应。方法 原代胸腺上皮细胞培养、85细胞增殖测定、台盼兰试验及FACS分析。结果 含血清的培养基与含生长因子的培养基均能培养出原代胸腺上皮细胞，TES上清单独能促使85细胞增殖且能提高85细胞的存活率。结论 研究发现含血清的培养基与含生长因子的培养基培养效果无明显差异，仅剪切也能培养纯净的胸腺上皮细胞。TES上清单独能促使85细胞增殖，提示上清液中可能存在一种未知的细胞因子。上清液能维持85细胞生存，可能与影响T细胞生长周期有关。
, http://www.100md.com
The studies of effect of supernatant from thymic epithelial culture on 85 cell proliferation Long Jianping, Huang Wei. Research Center of the Molecular Medicine, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089
【Abstract】 Objective Primary human thymic epithelial cell growth was compared under different culture conditions. The effect of supernatant on T cell line 85 cell proliferation and on 85 cell survival were investigated. Methods Culture of human thymic epithelial cells. Proliferation assay of 85 cells, Trypan-blue staining and FACS analysis. Results Serum containing medium and growth factor containing medium both could culture primary thymic epithelial cells. TES alone could promote the proliferation of 85 cells and improve the survival rate of 85 cells. Conclusion There was no obvious difference between serum containing medium and growth factor containing medium. Cutting alone could culture pure thymic epithelial cell. TES could promote the proliferation of 85 cells. This indicate that there are maybe unknown factors in supernatants. TES could maitain 85 cell's subsistence. Maybe supernatant affect growth cycle of T cell line.
, 百拇医药
【Key words】 Human thymic epithelial cell Supernatant Proliferation Subsistence
胸腺是T细胞分化发育的场所。源于骨髓的前T细胞迁入胸腺后，在胸腺微环境作用下，经阳性和阴性选择过程，发育分化成功能性T细胞迁至外周[1，2]。胸腺微环境由胸腺上皮细胞为主体的胸腺基质细胞组成，通过产生细胞因子或(和)与胸腺细胞直接作用而影响T细胞增殖分化。目前对胸腺基质细胞如何影响成熟T细胞株的研究较少。为此，本文利用体外原代培养人胸腺上皮细胞，观察胸腺上皮细胞上清液(TES)对T细胞株85细胞的影响。
1 材料与方法
1.1 人胸腺上皮细胞的培养 胸腺取自胸外科手术的儿童，年龄为7～12岁。无菌去除结缔组织被膜，将胸腺组织剪成约0.5 mm的碎块，Hanks液洗3遍，去除胸腺细胞。用0.15%的胰酶消化组织块10 min，Hanks液洗3遍。另一组组织碎块不用胰酶消化。将组织块接种到培养瓶中，37℃ 5% CO2 4 h，轻轻加入10% FCS-DMEM培养液或DM培养液(DMEM培养基中加入胰岛素5 μg/mL、氢化可的松2.7×10-6 mol/L、EGF 10 ng/mL组成DM培养液)。3 d后待上皮细胞从组织块中长出时，换新培养液。换液时吸走胸腺细胞和未贴壁的组织块。
, 百拇医药
1.2 培养上清液的制备 当胸腺上皮细胞在培养瓶底部行将长满时，换成无血清培养液(DM培养组不变)，培养12 h，收集上清液。上清液经0.45 μm的滤膜过滤，分装，-20℃冻存备用。
1.3 85细胞增殖测定 85细胞培养于10% FCS-RPMI中。将1×105/mL 85细胞加入96孔培养板内，每孔100 μL，再于每孔内加1∶10、1∶20、1∶40、1∶80不同稀释度的TES，对照组分别加IL-250 u/mL或培养液。置37 ℃ 5% CO2条件下培养24 h、48 h、72 h,培养结束前18 h加入3H-TdR 37 kBq/孔(1 μCi/孔)。收集细胞，测定CPM值。
1.4 台盼兰试验 85细胞培养于10% FCS-RPMI或DM中，将1×105/mL 85细胞加入96孔培养板内，每孔100 μL，再于每孔内加1∶10的TES，对照组分别加IL-2
, 百拇医药
50 u/mL\,IL-6 50 u/mL或培养液100 μL。置于37℃ 5% CO2培养箱内培养24 h。取细胞进行0.5%台盼兰染色，计数死细胞数。
1.5 FACS分析85细胞 85细胞培养于10% FCS-RPMI或DM中，将1×105/mL 85细胞加入96孔培养板内，每孔100 μL,再于每孔内加1∶10的TES，对照组分别加IL-2 50 u/mL、IL-6 50 u/mL或培养液100 μL。置于37℃ 5% CO2培养箱内培养24 h。然后在上述各组加入0.3 mmol/L Dio(Sigma产品)染色30 min。PBS洗，离心1 500 r/min 10 min。弃掉上清液后，每管加入0.5 mL PBS液作流式细胞仪分析(Becton Dickinson FACScan美国)。
2 结果
, 百拇医药 2.1 原代培养条件的比较 胸腺组织体外培养3 d后，可见大量游离的淋巴细胞和已贴壁生长的上皮样细胞。第10天后，上皮细胞形成多个集落，呈相嵌状。第15～20天，胸腺上皮细胞在培养瓶底部长满。仅剪切的组织块与剪切后加消化的组织块相比较，两者生长情况良好，无明显差异。10% FCS-DMEM与DM培养液相比较，两者生长情况亦无明显差异(见表1)。
表1 原代培养条件的比较 胸腺
剪切
剪切+消化
10% FCS-RPMI
DM
生长
1
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+
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2
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3
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6
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2.2 TES对85细胞株的作用 TES单独使用能促使85细胞增殖，实验组与对照组相比，CPM值有明显差异(P<0.01)。源于10% FCS-RPMI与源于DM的上清液均可促使85细胞增殖。TES作用48 h的效应高于作用24 h，而TES作用72 h对85细胞无效应(见表2)。源于血清的TES与源于DM的TES对85细胞的效应无明显差异。表2 TES对85细胞增殖的效应(CPM) 阴性对照
, 百拇医药
阳性对照
1∶10 TES
24 h
48 h
72 h
24 h
48 h
72 h
24 h
48 h
72 h
5 330
3 496
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160
11 693
184 618
107 170
36 245
64 303
1 020
2.3 TES对85细胞存活的影响 TES能维持85细胞存活，与阴性对照组相比，TES能明显提高85细胞的存活率(P<0.01)。而IL-6单独不能维持85细胞生存(见表3)。胸腺上皮细胞与85细胞共同培养，不能维持85细胞的存活(未显示结果)。表3 TES对85细胞存活的影响 成分
台盼兰染色
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(%死细胞)
细胞生存率
FACS分析(%)
培养液
47
21
IL-6 50 u/mL
51
27
IL-2 50 u/mL
11
83
TES 1∶10
, 百拇医药
15
75
3 讨论
胸腺细胞分化过程是极为复杂的，受多种细胞表面抗原分子及多种细胞因子的相互作用。任何能够影响细胞表面抗原分子表达或细胞因子产生的外界因素如抗原、丝裂原、药物等均可影响细胞的分化、增殖过程[3，4]。TES上清可促使增殖反应，实质上是TEC上清中含有的细胞因子的作用。近年来很多研究表明胸腺上皮细胞可分泌多种细胞因子，如CSFs、IL-1、IL-6、IL-7、、IL-8、SCF、LIF、TNFα、TNFγ和TGFβ。人们认为许多基质细胞的功能可以被细胞因子所代替[5～7]。85细胞是一种IL-2依赖型T细胞株，必须给予IL-2才能生存。未见到TES上清中存在IL-2的报道，然而本文所获的TES上清单独能促使85细胞的增殖，提示上清液中可能存在一种未知的细胞因子，值得进一步探讨。此外，TES能短时间维持85细胞生存。作者认为TES中的细胞因子不仅影响胸腺细胞的分化发育，对T细胞株也有作用，可能影响T细胞株的生长周期。尚需做大量工作深入研究。
, 百拇医药
胸腺上皮细胞体外培养技术是研究T细胞发育机制的有效手段之一。近年来常规培养胸腺上皮细胞的方法一般对培养条件要求高，需要一定的生长因子、滋养细胞等。本研究发现含血清的培养基与含生长因子的培养基培养效果无明显差异，仅剪切也能培养纯净的胸腺上皮细胞。关键在于尽可能除去胸腺组织包膜以及用Hanks液充分漂洗组织。本研究提供了一种简单、经济、可行的培养方法。
4 参考文献
1 Nikolic Zugic J. Phenotypic and functional stages in the intrathymic development of T cell. Immunol Today, 1991, 12(2):65
2 Adkins B, Mueller C, Okada CY, et al. Early events in T-cell maturation. Annu Rev Immunol, 1987,5:325
, 百拇医药
3 韩作宁，刘 白，马树俊，等.PMA和PHA对活化早期人胎儿胸腺细胞表型分化的研究.中华微生物学和免疫学杂志，1994，14(3)：143
4 Godfrey DI, Kennedy J, Gately MK,et al. IL-12 influences intrathymic T cell development. J Immunol, 1994, 152(6):2729
5 Eshel I, Savion N, Shoham J. Analsys of thymic stromal cell subpopulations grown in vitro on extracellular matrix in defined medium. Ⅱ. Cytokine activities in murine thymic epithelial and mesenchymal cell culture supernatants. J Immunol, 1990, 144(5):1563
6 Carding SR, Hayday AC, Bottomly K. Cytokines in T-cell development. Immunology Today, 1991, 12(7):239
7 田 兰，陈慰峰.几种细胞因子对成年小鼠CD-4CD-8胸腺细胞的增殖作用.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15(2)：77, 百拇医药(龙建平1 黄 卫2)
单位：1中山医科大学分子医学研究中心(510089)； 2广东省心血管病研究所(510080)
关键词：人胸腺上皮细胞；上清液；增殖；生存
广东医学990103 【摘要】 目的 比较不同培养条件下原代人胸腺上皮细胞生长情况，观察上清液对T细胞株85细胞增殖及存活的效应。方法 原代胸腺上皮细胞培养、85细胞增殖测定、台盼兰试验及FACS分析。结果 含血清的培养基与含生长因子的培养基均能培养出原代胸腺上皮细胞，TES上清单独能促使85细胞增殖且能提高85细胞的存活率。结论 研究发现含血清的培养基与含生长因子的培养基培养效果无明显差异，仅剪切也能培养纯净的胸腺上皮细胞。TES上清单独能促使85细胞增殖，提示上清液中可能存在一种未知的细胞因子。上清液能维持85细胞生存，可能与影响T细胞生长周期有关。
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The studies of effect of supernatant from thymic epithelial culture on 85 cell proliferation Long Jianping, Huang Wei. Research Center of the Molecular Medicine, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089
【Abstract】 Objective Primary human thymic epithelial cell growth was compared under different culture conditions. The effect of supernatant on T cell line 85 cell proliferation and on 85 cell survival were investigated. Methods Culture of human thymic epithelial cells. Proliferation assay of 85 cells, Trypan-blue staining and FACS analysis. Results Serum containing medium and growth factor containing medium both could culture primary thymic epithelial cells. TES alone could promote the proliferation of 85 cells and improve the survival rate of 85 cells. Conclusion There was no obvious difference between serum containing medium and growth factor containing medium. Cutting alone could culture pure thymic epithelial cell. TES could promote the proliferation of 85 cells. This indicate that there are maybe unknown factors in supernatants. TES could maitain 85 cell's subsistence. Maybe supernatant affect growth cycle of T cell line.
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【Key words】 Human thymic epithelial cell Supernatant Proliferation Subsistence
胸腺是T细胞分化发育的场所。源于骨髓的前T细胞迁入胸腺后，在胸腺微环境作用下，经阳性和阴性选择过程，发育分化成功能性T细胞迁至外周[1，2]。胸腺微环境由胸腺上皮细胞为主体的胸腺基质细胞组成，通过产生细胞因子或(和)与胸腺细胞直接作用而影响T细胞增殖分化。目前对胸腺基质细胞如何影响成熟T细胞株的研究较少。为此，本文利用体外原代培养人胸腺上皮细胞，观察胸腺上皮细胞上清液(TES)对T细胞株85细胞的影响。
1 材料与方法
1.1 人胸腺上皮细胞的培养 胸腺取自胸外科手术的儿童，年龄为7～12岁。无菌去除结缔组织被膜，将胸腺组织剪成约0.5 mm的碎块，Hanks液洗3遍，去除胸腺细胞。用0.15%的胰酶消化组织块10 min，Hanks液洗3遍。另一组组织碎块不用胰酶消化。将组织块接种到培养瓶中，37℃ 5% CO2 4 h，轻轻加入10% FCS-DMEM培养液或DM培养液(DMEM培养基中加入胰岛素5 μg/mL、氢化可的松2.7×10-6 mol/L、EGF 10 ng/mL组成DM培养液)。3 d后待上皮细胞从组织块中长出时，换新培养液。换液时吸走胸腺细胞和未贴壁的组织块。
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1.2 培养上清液的制备 当胸腺上皮细胞在培养瓶底部行将长满时，换成无血清培养液(DM培养组不变)，培养12 h，收集上清液。上清液经0.45 μm的滤膜过滤，分装，-20℃冻存备用。
1.3 85细胞增殖测定 85细胞培养于10% FCS-RPMI中。将1×105/mL 85细胞加入96孔培养板内，每孔100 μL，再于每孔内加1∶10、1∶20、1∶40、1∶80不同稀释度的TES，对照组分别加IL-250 u/mL或培养液。置37 ℃ 5% CO2条件下培养24 h、48 h、72 h,培养结束前18 h加入3H-TdR 37 kBq/孔(1 μCi/孔)。收集细胞，测定CPM值。
1.4 台盼兰试验 85细胞培养于10% FCS-RPMI或DM中，将1×105/mL 85细胞加入96孔培养板内，每孔100 μL，再于每孔内加1∶10的TES，对照组分别加IL-2
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50 u/mL\,IL-6 50 u/mL或培养液100 μL。置于37℃ 5% CO2培养箱内培养24 h。取细胞进行0.5%台盼兰染色，计数死细胞数。
1.5 FACS分析85细胞 85细胞培养于10% FCS-RPMI或DM中，将1×105/mL 85细胞加入96孔培养板内，每孔100 μL,再于每孔内加1∶10的TES，对照组分别加IL-2 50 u/mL、IL-6 50 u/mL或培养液100 μL。置于37℃ 5% CO2培养箱内培养24 h。然后在上述各组加入0.3 mmol/L Dio(Sigma产品)染色30 min。PBS洗，离心1 500 r/min 10 min。弃掉上清液后，每管加入0.5 mL PBS液作流式细胞仪分析(Becton Dickinson FACScan美国)。
2 结果
, 百拇医药 2.1 原代培养条件的比较 胸腺组织体外培养3 d后，可见大量游离的淋巴细胞和已贴壁生长的上皮样细胞。第10天后，上皮细胞形成多个集落，呈相嵌状。第15～20天，胸腺上皮细胞在培养瓶底部长满。仅剪切的组织块与剪切后加消化的组织块相比较，两者生长情况良好，无明显差异。10% FCS-DMEM与DM培养液相比较，两者生长情况亦无明显差异(见表1)。
表1 原代培养条件的比较 胸腺
剪切
剪切+消化
10% FCS-RPMI
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2.2 TES对85细胞株的作用 TES单独使用能促使85细胞增殖，实验组与对照组相比，CPM值有明显差异(P<0.01)。源于10% FCS-RPMI与源于DM的上清液均可促使85细胞增殖。TES作用48 h的效应高于作用24 h，而TES作用72 h对85细胞无效应(见表2)。源于血清的TES与源于DM的TES对85细胞的效应无明显差异。表2 TES对85细胞增殖的效应(CPM) 阴性对照
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阳性对照
1∶10 TES
24 h
48 h
72 h
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5 330
3 496
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2.3 TES对85细胞存活的影响 TES能维持85细胞存活，与阴性对照组相比，TES能明显提高85细胞的存活率(P<0.01)。而IL-6单独不能维持85细胞生存(见表3)。胸腺上皮细胞与85细胞共同培养，不能维持85细胞的存活(未显示结果)。表3 TES对85细胞存活的影响 成分
台盼兰染色
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(%死细胞)
细胞生存率
FACS分析(%)
培养液
47
21
IL-6 50 u/mL
51
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IL-2 50 u/mL
11
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TES 1∶10
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3 讨论
胸腺细胞分化过程是极为复杂的，受多种细胞表面抗原分子及多种细胞因子的相互作用。任何能够影响细胞表面抗原分子表达或细胞因子产生的外界因素如抗原、丝裂原、药物等均可影响细胞的分化、增殖过程[3，4]。TES上清可促使增殖反应，实质上是TEC上清中含有的细胞因子的作用。近年来很多研究表明胸腺上皮细胞可分泌多种细胞因子，如CSFs、IL-1、IL-6、IL-7、、IL-8、SCF、LIF、TNFα、TNFγ和TGFβ。人们认为许多基质细胞的功能可以被细胞因子所代替[5～7]。85细胞是一种IL-2依赖型T细胞株，必须给予IL-2才能生存。未见到TES上清中存在IL-2的报道，然而本文所获的TES上清单独能促使85细胞的增殖，提示上清液中可能存在一种未知的细胞因子，值得进一步探讨。此外，TES能短时间维持85细胞生存。作者认为TES中的细胞因子不仅影响胸腺细胞的分化发育，对T细胞株也有作用，可能影响T细胞株的生长周期。尚需做大量工作深入研究。
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胸腺上皮细胞体外培养技术是研究T细胞发育机制的有效手段之一。近年来常规培养胸腺上皮细胞的方法一般对培养条件要求高，需要一定的生长因子、滋养细胞等。本研究发现含血清的培养基与含生长因子的培养基培养效果无明显差异，仅剪切也能培养纯净的胸腺上皮细胞。关键在于尽可能除去胸腺组织包膜以及用Hanks液充分漂洗组织。本研究提供了一种简单、经济、可行的培养方法。
4 参考文献
1 Nikolic Zugic J. Phenotypic and functional stages in the intrathymic development of T cell. Immunol Today, 1991, 12(2):65
2 Adkins B, Mueller C, Okada CY, et al. Early events in T-cell maturation. Annu Rev Immunol, 1987,5:325
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3 韩作宁，刘 白，马树俊，等.PMA和PHA对活化早期人胎儿胸腺细胞表型分化的研究.中华微生物学和免疫学杂志，1994，14(3)：143
4 Godfrey DI, Kennedy J, Gately MK,et al. IL-12 influences intrathymic T cell development. J Immunol, 1994, 152(6):2729
5 Eshel I, Savion N, Shoham J. Analsys of thymic stromal cell subpopulations grown in vitro on extracellular matrix in defined medium. Ⅱ. Cytokine activities in murine thymic epithelial and mesenchymal cell culture supernatants. J Immunol, 1990, 144(5):1563
6 Carding SR, Hayday AC, Bottomly K. Cytokines in T-cell development. Immunology Today, 1991, 12(7):239
7 田 兰，陈慰峰.几种细胞因子对成年小鼠CD-4CD-8胸腺细胞的增殖作用.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15(2)：77, 百拇医药(龙建平1 黄 卫2)