BM210955对破骨细胞骨吸收的抑制作用
作者：金慰芳 高建军 王洪复 王博诚 胡名扬
单位：(金慰芳、高建军、王洪复)200032 上海医科大学老年医学研究中心；(王博诚、胡名扬)江苏省原子医学研究所
关键词：BM210955；破骨细胞；TRAP；吸收陷窝
中国骨质疏松杂志990105 摘要 细胞水平研究国产双磷酸盐药物-BM210955的骨吸收抑制作用。由1日龄
SD大鼠四肢长骨分离破骨细胞(OC)并接种于牛皮质骨薄切片上，在不同浓度BM210955作用下培养，定时取骨片作TRAP免疫组化染色，计数阳性多核细胞后，经超声去除细胞后作甲苯胺蓝染色，光镜下作吸收陷窝计数，数据以
表示，并与对照比较作t检验。结果显示：①BM210955能降低体外培养OC的数目，10-8mol/L组的TRAP阳性多核细胞较对照组减少73%，差异具有非常显著性，P<0.01。②BM210955抑制OC的陷窝形成能力，10-10、10-8mol/L组的抑制率分别为76.32%和87.99%，均与对照有明显差异，P<0.01。③上述结果与剂量有关，剂量越高，抑制效应越明显。Inhibitory effect of BM210955 on bone resorption osteoclasts
, 百拇医药
Jin Weifang,Gao Jianjun, Wang Hongfu,et al
Research Center of Geriatric Medicine,Shanghai Medical University,Shanghai 200032,China
Abstract The aim of this study was to evaluate the effects of BM210955(a compound of bisphosphonate manufactured in China)on resorption capacity of osteoclasts in vitro.The osteoclasts isolated from the long bone of 1-day-old rats were cultured on bone slices.After incubation in different concentrations of BM210955,the cells were fixed and stained for tartrate resistant acid phosphatase(TRAP).TRAP-positive multinucleated cells containing three or more nuclei were counted as osteoclasts.After the cells were stripped off by ultrasonication,the bone slices were stained in toludine blue.The excavated lacunae were counted under light microscope(LM).The results showed that the TRAP-positive multinucleated cells were reduced by 73%(P<0.01) in BM210955 treated group then in control.The decrease rates of pit number in 10-10mol/L and 10-8mol/L BM210955 group were 76.32%(P<0.01) and 87.99%(P<0.01).
, 百拇医药
Key words BM210955 Osteoclasts TRAP Resorption Lacunae
破骨细胞骨吸收功能活跃是骨质疏松症发生的病理生理之一。对OC骨吸收功能的抑制是防治OP的主要药理基础[1]。双磷酸盐(BP)是一类与骨基质焦磷酸结构相类似的骨吸收抑制药物，具有高效、稳定的特点，在OP防治中的作用已为国内外所肯定[2]。BM210955为江苏省原子核研究所研制合成的新型双磷酸盐药物，本文在细胞水平定量研究其药效并阐明其抑制OC骨吸收机制将会为其临床推广应用提供重要依据。
1 材料与方法
1.1 材料：1日龄SD大鼠(上海医科大学放射医学研究所动物房，合格证34)；MEM、胎牛血清(Gibco)；BM210955(江苏省原子核研究所)；TRAP孵育液[3](萘酚AS-BI磷酸钠、六偶氮副品红、酒石酸钾钠)为自配；甲苯胺蓝(E-Merck)染液、锯式切片机(Leitz 1600型德国)；光学显微镜(Nikon日本)；超声波清洗仪(上海必能信超声有限公司SB2200型)。
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1.2 薄骨片制备 取新鲜牛股骨皮质-30℃贮存，临用时经锯式切片机纵向切成50μm厚5 mm×5 mm大小骨片，蒸馏水中超声清洗10分钟×3次自然干燥，紫外线照射消毒备用。
1.3 破骨细胞分离和培养 参照文献[3]，取新生SD大鼠(1日龄)分离四肢长骨(股骨、肱骨、胫骨)，清除骨表面软组织和骨骺，骨干部分放入盛有MEM培养液(15%胎牛血清，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.0～7.1)的玻璃平皿中，用解剖刀纵剖后将骨质内表面轻刮入培养液，吸管反复吹打骨质碎片2分钟，静止30秒钟后将上层细胞悬液均匀接种于预置薄骨片的24孔培养板中，每孔4片，加培养液至1 ml，常规培养(37℃ 5%CO2 95%空气)30分钟，用MEM培养液冲掉未贴壁细胞，更换培养液，每孔2 ml，继续培养，每24小时换液一次。
1.4 药物干预 培养5小时后分别加入不同浓度BM210955 100μl，对照组加等量生理盐水。培养液每24小时换1次，药物同时加入。
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1.5 TRAP阳性细胞观察与计数 参照文献[3]方法，设药物加入时间为0时，分别于0时、培养3天取骨片，经2.5%戊二醛，4℃固定10分钟，蒸馏水洗3次，浸入TRAP孵育液，37℃孵育50分钟，蒸馏水冲洗后光镜观察，作多核TRAP阳性细胞计数。数据以表示，结果与对照组作t检验。
1.6 骨片吸收陷窝计数 参照文献[4]，每24小时取出骨片，25%戊二醛固定7分钟，0.25 mol/L氢氧化铵超声清洗5分钟×3次，系列酒精脱水，1%甲苯胺蓝室温下染色3～4分钟，蒸馏水清洗后光镜下观察，100倍下对整张骨片作陷窝计数，结果以陷窝数/骨片表示。每时相点4张，骨片数据以表示。
2 结果
2.1 对体外培养OC生存力的影响
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OC生存力是影响其骨吸收的重要方面，利用TRAP染色观察BP对OC生存数的影响结果见表1。
表1 各组骨片TRAP阳性多核细胞计数结果 组别
培养时间(天)
0
3
对照组
132.63±46.5
26.75±7.8
10-12mol/L
—
23.00±13.6
, 百拇医药
10-10mol/L
—
17.75±7.4
10-8mol/L
—
7.00±6.9*
注：,n=4,与对照组比，*P<0.01
OC接种密度为每张骨片130个左右，经过3天培养，对照组TRAP阳性多核细胞为30个左右，接近25%，10-12 mol/L、10-10mol/L组的OC细胞数较对照组减少14%和33.6%，与对照组比较无统计学意义。10-8mol/L组是7个左右，较对照组减少73.8%，明显低于对照，P<0.01。BP浓度越大，OC数下降越明显。
, 百拇医药
2.2 对OC骨吸收能力的影响
BP的主要药理基础是抑制骨吸收。采用破骨细胞骨片吸收陷窝光镜计量法观察BM210955对体外培养OC骨吸收功能的影响结果如图1。
图1 BM210955对破骨细胞骨吸收能力的抑制作用
注：，n=4
随着培养时间的延长，吸收陷窝数增加，药物组的吸收陷窝增加受到抑制，抑制作用与药物剂量有关，剂量越高，抑制效应越明显。培养3天的结果(表2)表明，10-10、10-8mol/L的吸收陷窝数量分别为36、18个/骨片，明显低于对照组，P<0.01。
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表2 培养3天骨片吸收陷窝数及BM210955抑制率 组别
陷窝数/骨片
抑制率(%)
P值
对照组
152.00±9.09
—
—
10-12mol/L
104.00±46.20
31.58
, 百拇医药 >0.05
10-10mol/L
36.00±14.76
76.32
<0.01
10-8mol/L
18.25±7.27
87.99
<0.01
3 讨论
BP是P-C-P基团为特征的磷酸盐复合物，在体内非常稳定，不被酶水解。根据其α-C上侧链的不同分为不同种类，共同特征是与磷酸钙和骨矿盐特异结合，并也是其影响骨代谢的结构基础。与矿盐结合后的BP对骨代谢主要表现为二个方面的作用，一是抑制矿盐结晶的形成而抑制骨矿化，另一作用是抑制骨吸收。前者只有在较高浓度下出现，如人口服Etidronate 800 mg/d才表现出对骨矿化的抑制作用，而抑制骨吸收的有效剂量为400 mg/d。骨矿化抑制作用限制了该药的推广应用。OP防治的要求是较强的骨吸收抑制作用，较弱或无矿化抑制作用，为此新一代BP不断问世，在药效、安全性和耐受性等方面有了较大的提高[2]，BM210955为新一代中最具有潜力的药物。
, 百拇医药
BP的主要药理基础是抑制骨吸收，普遍认为这种抑制作用是其对OC直接作用的结果。BP依其与磷酸盐高度的亲和力而与暴露的骨矿盐紧密结合，骨吸收过程中随OC对骨矿盐的溶解释放出来，抑制OC的分化成熟和骨吸收活性。其直接作用表现为干扰细胞骨架系统、引起OC伪足收缩、抑制皱褶缘形成和溶酶体释放[5]。鉴于BP能引起OC形态和功能的变化，Fleisch认为这与BP对OC的代谢功能直接损伤有关。也有报道BP也能引起成骨细胞(OB)形态改变，为BP骨吸收机制的研究提供了新的思路，Sahni应用成骨细胞克隆-CRP10/30细胞证实在BP抑制OC骨吸收中OB的介导作用[6]，并认为这是由于BP抑制CRP10/30细胞促骨吸收因子的释放的结果，尤其在低浓度这种作用更明显。本文在骨片上培养OC数天，通过骨片形成陷窝的数目来衡量OC骨吸收功能，并观察国产BP BM210955的作用。结果表明BM210955对OC骨吸收功能有明显抑制作用并与剂量有关。
抑制OC分化成熟和诱导OC凋亡是BP作用的另一形式。OC的分化成熟需要OB的参与和调控，OB通过M-CSF、IL-6、IL-11及膜蛋白分子调控OC的分化成熟，同样在BP药效中发挥作用。Evans和Braidman[7]通过对胎鼠头盖骨OC观察发现BP能抑制OC的成熟，后被Hughes[8]和Nishikawa[9]通过骨髓细胞诱导培养、TRAP染色计数证实。这种作用与剂量相关并具有可恢复性，对OC分化后期的抑制作用比对OC前体增殖更重要。Nishikawa认为这种BP诱导OB分泌抑制因子，而不是抑制活化因子的作用。Hughes[10]观察到BP能促进OC凋亡，是正常的4～24倍。本文采用TRAP技术，通过比较骨片上OC培养不同时间的数目，观察BM210955对OC生存力的作用。结果表明10-8mol/L BM210955明显促进体外培养OC数目下降，这可能与其促进OC凋亡和抑制OC分化成熟有关，其机理有待进一步研究阐明。
, 百拇医药
本课题受卫生部“九五”攻关课题资助
作者简介：金慰芳，女，46岁，副教授。上海医科大学老年医学研究中心骨代谢研究室副主任，主要从事骨代谢实验室工作。参考文献
1 孟迅吾.骨质疏松症的预防和治疗对象.全国代谢性骨病学术研讨会论文汇编，1996.52-55.
2 Fleisch H.Prospective use of bisphosphonates in osteoporosis.J Clin Endocrinol Metab,1993,76(6):1397.
3 于明香，金慰芳，王洪复，等.破骨细胞体外培养与形态观察.上海医科大学学报，1996，23(1)：52.
4 高建军，金慰芳，王洪复.骨片吸收陷窝光镜计量法与益钙宁抑制骨吸收作用评价.上海医科大学学报.
, http://www.100md.com
5 Sato M,Grosser W.Effects of bisphosphonates on isolated rat osteoclasts as examined by reflected light microscopy.J Bone Miner Res,1990,5:31.
6 Sahni M,Guenther HL,Fleisch H.et al.Bisphosphonates act on rat bone resorption through the medication of osteoblasts.J Clin Invest,1993,91:2004.
7 Evans.C E,Braidman IP.Effects of two novel bisphosphonates on bone cells in vitro.Bone Miner,1994,38:822-825.
, 百拇医药
8 Hughes DE,MacDonald BR,Russell RGG,et al.Inhibition of osteoclast-like cell formation by bisphosponates in long-term cultures of human bone marrow.J Clin Invest,1989,83:1930.
9 Nishikawa M,Akatsu T,Katayama Y,et al.Bisphosphonates act on osteoblastic cells and inhibit osteoclast formation in mouse marrow cultures.Bone,1996,18:9.
10 Hughes DE,Wright K,Sasaki A,et al.Bisphosphonates promote apoptosis in murine osteoclasts in vitro and vivo.J Bone Miner Res,1995,10(10):1478., http://www.100md.com
单位：(金慰芳、高建军、王洪复)200032 上海医科大学老年医学研究中心；(王博诚、胡名扬)江苏省原子医学研究所
关键词：BM210955；破骨细胞；TRAP；吸收陷窝
中国骨质疏松杂志990105 摘要 细胞水平研究国产双磷酸盐药物-BM210955的骨吸收抑制作用。由1日龄
SD大鼠四肢长骨分离破骨细胞(OC)并接种于牛皮质骨薄切片上，在不同浓度BM210955作用下培养，定时取骨片作TRAP免疫组化染色，计数阳性多核细胞后，经超声去除细胞后作甲苯胺蓝染色，光镜下作吸收陷窝计数，数据以
表示，并与对照比较作t检验。结果显示：①BM210955能降低体外培养OC的数目，10-8mol/L组的TRAP阳性多核细胞较对照组减少73%，差异具有非常显著性，P<0.01。②BM210955抑制OC的陷窝形成能力，10-10、10-8mol/L组的抑制率分别为76.32%和87.99%，均与对照有明显差异，P<0.01。③上述结果与剂量有关，剂量越高，抑制效应越明显。Inhibitory effect of BM210955 on bone resorption osteoclasts, 百拇医药
Jin Weifang,Gao Jianjun, Wang Hongfu,et al
Research Center of Geriatric Medicine,Shanghai Medical University,Shanghai 200032,China
Abstract The aim of this study was to evaluate the effects of BM210955(a compound of bisphosphonate manufactured in China)on resorption capacity of osteoclasts in vitro.The osteoclasts isolated from the long bone of 1-day-old rats were cultured on bone slices.After incubation in different concentrations of BM210955,the cells were fixed and stained for tartrate resistant acid phosphatase(TRAP).TRAP-positive multinucleated cells containing three or more nuclei were counted as osteoclasts.After the cells were stripped off by ultrasonication,the bone slices were stained in toludine blue.The excavated lacunae were counted under light microscope(LM).The results showed that the TRAP-positive multinucleated cells were reduced by 73%(P<0.01) in BM210955 treated group then in control.The decrease rates of pit number in 10-10mol/L and 10-8mol/L BM210955 group were 76.32%(P<0.01) and 87.99%(P<0.01).
, 百拇医药
Key words BM210955 Osteoclasts TRAP Resorption Lacunae
破骨细胞骨吸收功能活跃是骨质疏松症发生的病理生理之一。对OC骨吸收功能的抑制是防治OP的主要药理基础[1]。双磷酸盐(BP)是一类与骨基质焦磷酸结构相类似的骨吸收抑制药物，具有高效、稳定的特点，在OP防治中的作用已为国内外所肯定[2]。BM210955为江苏省原子核研究所研制合成的新型双磷酸盐药物，本文在细胞水平定量研究其药效并阐明其抑制OC骨吸收机制将会为其临床推广应用提供重要依据。
1 材料与方法
1.1 材料：1日龄SD大鼠(上海医科大学放射医学研究所动物房，合格证34)；MEM、胎牛血清(Gibco)；BM210955(江苏省原子核研究所)；TRAP孵育液[3](萘酚AS-BI磷酸钠、六偶氮副品红、酒石酸钾钠)为自配；甲苯胺蓝(E-Merck)染液、锯式切片机(Leitz 1600型德国)；光学显微镜(Nikon日本)；超声波清洗仪(上海必能信超声有限公司SB2200型)。
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1.2 薄骨片制备 取新鲜牛股骨皮质-30℃贮存，临用时经锯式切片机纵向切成50μm厚5 mm×5 mm大小骨片，蒸馏水中超声清洗10分钟×3次自然干燥，紫外线照射消毒备用。
1.3 破骨细胞分离和培养 参照文献[3]，取新生SD大鼠(1日龄)分离四肢长骨(股骨、肱骨、胫骨)，清除骨表面软组织和骨骺，骨干部分放入盛有MEM培养液(15%胎牛血清，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.0～7.1)的玻璃平皿中，用解剖刀纵剖后将骨质内表面轻刮入培养液，吸管反复吹打骨质碎片2分钟，静止30秒钟后将上层细胞悬液均匀接种于预置薄骨片的24孔培养板中，每孔4片，加培养液至1 ml，常规培养(37℃ 5%CO2 95%空气)30分钟，用MEM培养液冲掉未贴壁细胞，更换培养液，每孔2 ml，继续培养，每24小时换液一次。
1.4 药物干预 培养5小时后分别加入不同浓度BM210955 100μl，对照组加等量生理盐水。培养液每24小时换1次，药物同时加入。
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1.5 TRAP阳性细胞观察与计数 参照文献[3]方法，设药物加入时间为0时，分别于0时、培养3天取骨片，经2.5%戊二醛，4℃固定10分钟，蒸馏水洗3次，浸入TRAP孵育液，37℃孵育50分钟，蒸馏水冲洗后光镜观察，作多核TRAP阳性细胞计数。数据以
表示，结果与对照组作t检验。1.6 骨片吸收陷窝计数 参照文献[4]，每24小时取出骨片，25%戊二醛固定7分钟，0.25 mol/L氢氧化铵超声清洗5分钟×3次，系列酒精脱水，1%甲苯胺蓝室温下染色3～4分钟，蒸馏水清洗后光镜下观察，100倍下对整张骨片作陷窝计数，结果以陷窝数/骨片表示。每时相点4张，骨片数据以
表示。2 结果
2.1 对体外培养OC生存力的影响
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OC生存力是影响其骨吸收的重要方面，利用TRAP染色观察BP对OC生存数的影响结果见表1。
表1 各组骨片TRAP阳性多核细胞计数结果 组别
培养时间(天)
0
3
对照组
132.63±46.5
26.75±7.8
10-12mol/L
—
23.00±13.6
, 百拇医药
10-10mol/L
—
17.75±7.4
10-8mol/L
—
7.00±6.9*
注：
,n=4,与对照组比，*P<0.01OC接种密度为每张骨片130个左右，经过3天培养，对照组TRAP阳性多核细胞为30个左右，接近25%，10-12 mol/L、10-10mol/L组的OC细胞数较对照组减少14%和33.6%，与对照组比较无统计学意义。10-8mol/L组是7个左右，较对照组减少73.8%，明显低于对照，P<0.01。BP浓度越大，OC数下降越明显。
, 百拇医药
2.2 对OC骨吸收能力的影响
BP的主要药理基础是抑制骨吸收。采用破骨细胞骨片吸收陷窝光镜计量法观察BM210955对体外培养OC骨吸收功能的影响结果如图1。
图1 BM210955对破骨细胞骨吸收能力的抑制作用
注：
，n=4随着培养时间的延长，吸收陷窝数增加，药物组的吸收陷窝增加受到抑制，抑制作用与药物剂量有关，剂量越高，抑制效应越明显。培养3天的结果(表2)表明，10-10、10-8mol/L的吸收陷窝数量分别为36、18个/骨片，明显低于对照组，P<0.01。
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表2 培养3天骨片吸收陷窝数及BM210955抑制率 组别
陷窝数/骨片
抑制率(%)
P值
对照组
152.00±9.09
—
—
10-12mol/L
104.00±46.20
31.58
, 百拇医药 >0.05
10-10mol/L
36.00±14.76
76.32
<0.01
10-8mol/L
18.25±7.27
87.99
<0.01
3 讨论
BP是P-C-P基团为特征的磷酸盐复合物，在体内非常稳定，不被酶水解。根据其α-C上侧链的不同分为不同种类，共同特征是与磷酸钙和骨矿盐特异结合，并也是其影响骨代谢的结构基础。与矿盐结合后的BP对骨代谢主要表现为二个方面的作用，一是抑制矿盐结晶的形成而抑制骨矿化，另一作用是抑制骨吸收。前者只有在较高浓度下出现，如人口服Etidronate 800 mg/d才表现出对骨矿化的抑制作用，而抑制骨吸收的有效剂量为400 mg/d。骨矿化抑制作用限制了该药的推广应用。OP防治的要求是较强的骨吸收抑制作用，较弱或无矿化抑制作用，为此新一代BP不断问世，在药效、安全性和耐受性等方面有了较大的提高[2]，BM210955为新一代中最具有潜力的药物。
, 百拇医药
BP的主要药理基础是抑制骨吸收，普遍认为这种抑制作用是其对OC直接作用的结果。BP依其与磷酸盐高度的亲和力而与暴露的骨矿盐紧密结合，骨吸收过程中随OC对骨矿盐的溶解释放出来，抑制OC的分化成熟和骨吸收活性。其直接作用表现为干扰细胞骨架系统、引起OC伪足收缩、抑制皱褶缘形成和溶酶体释放[5]。鉴于BP能引起OC形态和功能的变化，Fleisch认为这与BP对OC的代谢功能直接损伤有关。也有报道BP也能引起成骨细胞(OB)形态改变，为BP骨吸收机制的研究提供了新的思路，Sahni应用成骨细胞克隆-CRP10/30细胞证实在BP抑制OC骨吸收中OB的介导作用[6]，并认为这是由于BP抑制CRP10/30细胞促骨吸收因子的释放的结果，尤其在低浓度这种作用更明显。本文在骨片上培养OC数天，通过骨片形成陷窝的数目来衡量OC骨吸收功能，并观察国产BP BM210955的作用。结果表明BM210955对OC骨吸收功能有明显抑制作用并与剂量有关。
抑制OC分化成熟和诱导OC凋亡是BP作用的另一形式。OC的分化成熟需要OB的参与和调控，OB通过M-CSF、IL-6、IL-11及膜蛋白分子调控OC的分化成熟，同样在BP药效中发挥作用。Evans和Braidman[7]通过对胎鼠头盖骨OC观察发现BP能抑制OC的成熟，后被Hughes[8]和Nishikawa[9]通过骨髓细胞诱导培养、TRAP染色计数证实。这种作用与剂量相关并具有可恢复性，对OC分化后期的抑制作用比对OC前体增殖更重要。Nishikawa认为这种BP诱导OB分泌抑制因子，而不是抑制活化因子的作用。Hughes[10]观察到BP能促进OC凋亡，是正常的4～24倍。本文采用TRAP技术，通过比较骨片上OC培养不同时间的数目，观察BM210955对OC生存力的作用。结果表明10-8mol/L BM210955明显促进体外培养OC数目下降，这可能与其促进OC凋亡和抑制OC分化成熟有关，其机理有待进一步研究阐明。
, 百拇医药
本课题受卫生部“九五”攻关课题资助
作者简介：金慰芳，女，46岁，副教授。上海医科大学老年医学研究中心骨代谢研究室副主任，主要从事骨代谢实验室工作。参考文献
1 孟迅吾.骨质疏松症的预防和治疗对象.全国代谢性骨病学术研讨会论文汇编，1996.52-55.
2 Fleisch H.Prospective use of bisphosphonates in osteoporosis.J Clin Endocrinol Metab,1993,76(6):1397.
3 于明香，金慰芳，王洪复，等.破骨细胞体外培养与形态观察.上海医科大学学报，1996，23(1)：52.
4 高建军，金慰芳，王洪复.骨片吸收陷窝光镜计量法与益钙宁抑制骨吸收作用评价.上海医科大学学报.
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5 Sato M,Grosser W.Effects of bisphosphonates on isolated rat osteoclasts as examined by reflected light microscopy.J Bone Miner Res,1990,5:31.
6 Sahni M,Guenther HL,Fleisch H.et al.Bisphosphonates act on rat bone resorption through the medication of osteoblasts.J Clin Invest,1993,91:2004.
7 Evans.C E,Braidman IP.Effects of two novel bisphosphonates on bone cells in vitro.Bone Miner,1994,38:822-825.
, 百拇医药
8 Hughes DE,MacDonald BR,Russell RGG,et al.Inhibition of osteoclast-like cell formation by bisphosponates in long-term cultures of human bone marrow.J Clin Invest,1989,83:1930.
9 Nishikawa M,Akatsu T,Katayama Y,et al.Bisphosphonates act on osteoblastic cells and inhibit osteoclast formation in mouse marrow cultures.Bone,1996,18:9.
10 Hughes DE,Wright K,Sasaki A,et al.Bisphosphonates promote apoptosis in murine osteoclasts in vitro and vivo.J Bone Miner Res,1995,10(10):1478., http://www.100md.com