L-精氨酸抑制高胆固醇饮食诱发的大鼠动脉血管细胞间粘附分子表达
作者：霍玉庆 徐成斌 张杰 张彤 崔俊峰 尹春琳 金晓峰
单位：霍玉庆 徐成斌 张彤 崔俊峰 尹春琳 金晓峰 北京市，北京医科大学人民医院 心内科 100044；张杰 山东泰安中医院
关键词：L-精氨酸 血管细胞间粘附分子 单核细胞
摘要 目的摘要 目的:观察L-精氨酸抗动脉粥样硬化的作用是否与其抑制大鼠动脉血管细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM-1)的表达有关。方法:Wistar大鼠24只,随机分为NC组(普通饲料及饮水),CC组(饲料中含4%胆固醇,1%胆酸),AC组(饲料中含4%胆固醇,1%胆酸,饮水中含3%L-精氨酸盐酸盐);每组8只。8周后采血,处死Wistar大鼠取其主动脉作ICAM-1的免疫组织化学及信使核糖核酸(mRNA)Northern Blot分析。结果:AC及CC组大鼠的血清胆固醇浓度无显著差异,但明显高于NC组。NC及CC组大鼠血清L-精氨酸浓度无明显差异,但明显低于AC组(P<0.01)。L-精氨酸抑制高胆固醇膳食诱发的大鼠动脉ICAM-1表达。结论:L-精氨酸抑制动脉ICAM-1表达作用可能是其抑制高胆固醇膳食诱发的动脉粥样硬化的分子机制之一。
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Dietary L-arginine Attenuates Expression of Vascular Intercellular Adhesion Molecule in the Aorta of Hypercholesterolemic Rats
Huo Yuqing,Xu Chengbin,Zhang Jie,et al.
Department of Cardiology,People's Hospital,Beijing Medical University,Beijing(100044)
Abstract Objective:To determine whether the anti-atherogenic effect of L-arginine is due to an inhibition of vascular intercellular adhesion molecule expression in the aorta of hypercholesterolemic rats.Method:Twenty four male Wistar rats were randomized into three groups:Group NC was given normal diet(NC,n=8),group CC 4% cholesterol and 1% cholic acid diet(CC,n=8)and group AC 4% cholesterol and 1% cholic acid diet supplemented with 3% L-arginine in drinking water(n=8).After 8 weeks blood samples were collected for biochemical studies,and the aortas were harvested for Northern Blot and immunohistochemical studies.Results:The results showed:①Serum cholesterol concentrations of rats of the AC and CC groups showed no significant difference,but were significantly higher than those of the NC group.②Serum L-arginine concentrations of the NC and CC groups showed no significant difference,but were significantly lower than that of the AC group(p<0.01).③Dietary L-arginine supplementation(group AC)significantly reduced the expression of vascular intercellular adhesion molecule (ICAM-1) both at the protein and messenger ribonucleic acid (mRNA)levels.Conclusion:Inhibitory effect of dietary supplementation of L-arginine on ICAM-1 expression may be one of the mechanisms of the antiatherosclerotic effect of L-arginine.
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Key words L-arginine;Intercellular adhesion molecule;Monocyte
单核细胞对血管壁的粘附及在血管壁内的募集是动脉粥样硬化发生时最早的病理改变[1,2]。近年研究发现,内皮源性舒张因子一氧化氮(NO)的前体物质L-精氨酸可抑制单核细胞对血管壁的粘附从而抑制高胆固醇诱发的动脉粥样硬化[3]。为进一步探讨这一作用的分子机制,本实验用免疫组织化学及Northern Blot方法观察L-精氨酸对高胆固醇饲喂的Wistar大鼠主动脉血管细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM-1)表达的影响。
1 材料和方法
主要试剂 胆固醇、胆酸、L-精氨酸购于北京化学试剂总公司。羊抗ICAM-1抗体购于中山试剂公司。含大鼠ICAM-1互补脱氧核糖核酸(cDNA)链的片断(570 bp,内切酶位点为pstI、KpnI)的质粒由美国Emory大学Russel教授提供。α32磷-三磷酸脱氧胞苷(α32P-dCTP)购于北京亚辉公司。探针标记所用试剂盒为美国Promega公司产品。
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动物与分组 体重300 g左右的Wistar大鼠24只(1997年9月选自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心),随机分为3组,正常对照组(NC组)8只,普通饲料及饮水;单纯胆固醇组(CC组)8只,饲料中含4%胆固醇,1%胆酸;L-精氨酸+胆固醇组(AC组)8只,饲料中含4%胆固醇,1%胆酸,饮水中含3%的L-精氨酸盐酸盐;各组均饲喂8周。
观察项目与方法 ①生化测定:8周后,麻醉下经心脏取血,测定血浆胆固醇(改进Allain法)及游离L-精氨酸浓度(高压液相分析)。②免疫组织化学分析:取腹主动脉全长剪切为数段,取0.5 cm左右的血管段固定于4%多聚甲醛中,其余血管段用于提取信使核糖核酸(mRNA)。常规酒精脱水,石蜡包埋,横段连续切片,厚4 μm,每隔8张取1张,每份血管标本取4张。生物素—亲和素—过氧化物酶免疫组织化学法进行ICAM-1的免疫组织化学分析,3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶30分钟,5%的牛血清白蛋白阻断非特异性结合,羊抗ICAM-1抗体(1∶400)4℃过夜,生物素化兔抗羊抗体(1∶200)孵育60分钟,链酶亲和素标记的辣根过氧化物酶(1∶200)孵育30分钟,二氨基联苯胺—过氧化氢显色。计算机图像分析仪对免疫组织化学结果进行灰度值测定。③Northern Blot分析:异硫氰酸胍一步法提取组织总核糖核酸(RNA)[4]。紫外分光仪定量,每组取30 μg RNA上样电泳,转膜,用α32P-dCTP标记的cDNA探针杂交,洗膜后-70℃压片24小时,常规显影定影后,洗脱液处理尼龙膜,α32P-dCTP标记的β-actin探针再次杂交,以检测上样RNA的完整性与加样的准确性。
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统计学处理:各数值以
±s表示,配对t检验进行计量资料分析。
2 结果
2.1 血清胆固醇与L-精氨酸浓度
饲喂至8周的Wistar大鼠各组血清胆固醇浓度为NC组:1.61±0.70 mmol/L,CC组:8.76±1.46 mmol/L,AC组:8.84±1.22 mmol/L,AC组与CC组的血清胆固醇浓度差别无显著性,但两组的血清胆固醇浓度明显高于NC组4倍左右。各组的L-精氨酸浓度为NC组:46±15 μmol/L,CC组:52±11 μmol/L,AC组:116±21 μmol/L,NC组与CC组的血清L-精氨酸浓度差别无显著性,而AC组的血清L-精氨酸浓度较另两组高1倍以上,有显著差别(P<0.01)。
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2.2 L-精氨酸对血管壁血管细胞间粘附分子的影响(图1)
计算机图像分析示3组ICAM-1表达的灰度值分别为NC组:25.70±5.30,CC组:179.26±10.71,AC组:82.56±12.68,3组中各组n=30次,3组的灰度值间有显著差别(P<0.01)。
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图1 大鼠主动脉血管细胞间粘附分子(ICAM-1)的免疫组织化学(×200)。NC组显示ICAM-1轻度表达(图1a),CC组内皮及内膜平滑肌细胞ICAM-1表达明显升高(图1b),饲喂L-精氨酸后ICAM-1的表达明显受到抑制(图1c)
2.3 L-精氨酸对血管壁血管细胞间粘附分子信使核糖核酸的影响
大鼠主动脉血管细胞间粘附分子信使核糖核酸表达检测见图2。Northern Blot的结果提示AC组的ICAM-1 mRNA的表达明显被抑制,低于CC组。
图2 大鼠主动脉血管细胞间粘附分子信使核糖核酸表达检测(Northern Blot)。NC组饲喂普通饲料 CC组饲喂高胆固醇饲料 AC组饲喂高胆固醇,饮水中加入L-精氨酸 ICAM-1:主动脉血管细胞间粘附分子
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3 讨论
本实验结果显示NC组大鼠的主动脉壁内膜ICAM-1微量表达,CC组大鼠主动脉内皮及内膜平滑肌细胞ICAM-1表达明显升高,内皮尤甚,AC组大鼠主动脉内膜的ICAM-1表达明显下降。3组大鼠血管壁组织ICAM-1的Northern Blot结果提示ICAM-1 mRNA的表达CC组明显高于NC组,而AC组的ICAM-1 mRNA表达明显被L-精氨酸所抑制。故推测L-精氨酸对ICAM-1表达的抑制是其抑制动脉粥样硬化发生发展的分子机制之一。
大量单核细胞在血管壁粘附并穿壁募集于内膜是动脉粥样硬化发生、发展的关键因素。1984年,Joris等[2]运用enface方法在高胆固醇鼠的主动脉内皮观察到随着血清胆固醇浓度的升高,粘附于内皮的单核细胞数量增多,并证实单核细胞穿壁进入内皮下吞噬脂质成为泡沫细胞并进而进展为典型的动脉粥样硬化斑块。渗透入血管壁的单核细胞吞噬脂质形成泡沫细胞后可返回血流,将脂质输送到肝脏进行代谢。若某些因素阻滞这些细胞返回血流而在血管壁内募集,则这些细胞可合成和释放许多因子,促使细胞外基质的合成堆积,并促使血管平滑肌细胞的增殖和向内膜下迁移,由此导致动脉粥样硬化的形成及进展[5～7]。阻滞这些细胞返回血流的分子机制之中,细胞膜表面表达的粘附分子是其重要一员,如粘附分子之一的ICAM-1,它与细胞表面的配体结合后,可阻滞相应的单核/巨噬细胞、淋巴细胞返回血流。一些研究亦发现表达于血管细胞的ICAM-1是与动脉粥样硬化的发生及严重程度显著相关的分子之一[8]。L-精氨酸抑制ICAM-1的表达在一定程度上阻断了单核细胞对血管的粘附及在血管壁的募集这一病理过程,从而抑制了动脉粥样硬化的发生发展。此结果亦为研制新的一氧化氮的供体及衍生物作为有效的抗动脉粥样硬化药物提供了新的理论依据。
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作者简介：霍玉庆 男 31岁 住院医师 博士
参考文献
1 Ross R.Pathogenesis of atherosclerosis.N Engl J Med,1986,314:488—492.
2 Joris I,Zand T,Nunnarl JJ,et al.Studies on the pathogenesis of atherosclerosis,Am J Pathol,1983,113:341—352.
3 Tsao PS,McEvory LM,Drexler H,et al.Enhanced endothelial adhesiveness in hypercholesterolemia is attenuated by L-arginine.Circulation,1994,89:2176—2184.
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4 Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-choroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156—159.
5 Ross R,Masuda J,Raines EW,et al.Localization of PDGF-β protein in macrophage in all phases of atherogenesis.Science,1990,248:1009—1015.
6 Assoian RK,Fleurdelys BE,Stevenson HC,et al.Expression and secretion of type beta transforming growth factor by activated human macrophages.Proc Natl Acad Sci USA,1987,84:6020—6027.
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7 Bjorkerud S.Effects of transforming growth factor-β1 on human arterial smooth muscle cell in vitro.Arterioscler Thromb,1991,11:892—902.
8 O'Brien KD,McDonald TO,Chat A,et al.Neovascular expression of E-selectin,intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 in human atherosclerosis and their relation to intimal leukocyte content.Circulation,1996,93:677—683.
(收稿:1998-03-20 修回:1998-11-09), 百拇医药
单位：霍玉庆 徐成斌 张彤 崔俊峰 尹春琳 金晓峰 北京市，北京医科大学人民医院 心内科 100044；张杰 山东泰安中医院
关键词：L-精氨酸 血管细胞间粘附分子 单核细胞
摘要 目的摘要 目的:观察L-精氨酸抗动脉粥样硬化的作用是否与其抑制大鼠动脉血管细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM-1)的表达有关。方法:Wistar大鼠24只,随机分为NC组(普通饲料及饮水),CC组(饲料中含4%胆固醇,1%胆酸),AC组(饲料中含4%胆固醇,1%胆酸,饮水中含3%L-精氨酸盐酸盐);每组8只。8周后采血,处死Wistar大鼠取其主动脉作ICAM-1的免疫组织化学及信使核糖核酸(mRNA)Northern Blot分析。结果:AC及CC组大鼠的血清胆固醇浓度无显著差异,但明显高于NC组。NC及CC组大鼠血清L-精氨酸浓度无明显差异,但明显低于AC组(P<0.01)。L-精氨酸抑制高胆固醇膳食诱发的大鼠动脉ICAM-1表达。结论:L-精氨酸抑制动脉ICAM-1表达作用可能是其抑制高胆固醇膳食诱发的动脉粥样硬化的分子机制之一。
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Dietary L-arginine Attenuates Expression of Vascular Intercellular Adhesion Molecule in the Aorta of Hypercholesterolemic Rats
Huo Yuqing,Xu Chengbin,Zhang Jie,et al.
Department of Cardiology,People's Hospital,Beijing Medical University,Beijing(100044)
Abstract Objective:To determine whether the anti-atherogenic effect of L-arginine is due to an inhibition of vascular intercellular adhesion molecule expression in the aorta of hypercholesterolemic rats.Method:Twenty four male Wistar rats were randomized into three groups:Group NC was given normal diet(NC,n=8),group CC 4% cholesterol and 1% cholic acid diet(CC,n=8)and group AC 4% cholesterol and 1% cholic acid diet supplemented with 3% L-arginine in drinking water(n=8).After 8 weeks blood samples were collected for biochemical studies,and the aortas were harvested for Northern Blot and immunohistochemical studies.Results:The results showed:①Serum cholesterol concentrations of rats of the AC and CC groups showed no significant difference,but were significantly higher than those of the NC group.②Serum L-arginine concentrations of the NC and CC groups showed no significant difference,but were significantly lower than that of the AC group(p<0.01).③Dietary L-arginine supplementation(group AC)significantly reduced the expression of vascular intercellular adhesion molecule (ICAM-1) both at the protein and messenger ribonucleic acid (mRNA)levels.Conclusion:Inhibitory effect of dietary supplementation of L-arginine on ICAM-1 expression may be one of the mechanisms of the antiatherosclerotic effect of L-arginine.
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Key words L-arginine;Intercellular adhesion molecule;Monocyte
单核细胞对血管壁的粘附及在血管壁内的募集是动脉粥样硬化发生时最早的病理改变[1,2]。近年研究发现,内皮源性舒张因子一氧化氮(NO)的前体物质L-精氨酸可抑制单核细胞对血管壁的粘附从而抑制高胆固醇诱发的动脉粥样硬化[3]。为进一步探讨这一作用的分子机制,本实验用免疫组织化学及Northern Blot方法观察L-精氨酸对高胆固醇饲喂的Wistar大鼠主动脉血管细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM-1)表达的影响。
1 材料和方法
主要试剂 胆固醇、胆酸、L-精氨酸购于北京化学试剂总公司。羊抗ICAM-1抗体购于中山试剂公司。含大鼠ICAM-1互补脱氧核糖核酸(cDNA)链的片断(570 bp,内切酶位点为pstI、KpnI)的质粒由美国Emory大学Russel教授提供。α32磷-三磷酸脱氧胞苷(α32P-dCTP)购于北京亚辉公司。探针标记所用试剂盒为美国Promega公司产品。
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动物与分组 体重300 g左右的Wistar大鼠24只(1997年9月选自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心),随机分为3组,正常对照组(NC组)8只,普通饲料及饮水;单纯胆固醇组(CC组)8只,饲料中含4%胆固醇,1%胆酸;L-精氨酸+胆固醇组(AC组)8只,饲料中含4%胆固醇,1%胆酸,饮水中含3%的L-精氨酸盐酸盐;各组均饲喂8周。
观察项目与方法 ①生化测定:8周后,麻醉下经心脏取血,测定血浆胆固醇(改进Allain法)及游离L-精氨酸浓度(高压液相分析)。②免疫组织化学分析:取腹主动脉全长剪切为数段,取0.5 cm左右的血管段固定于4%多聚甲醛中,其余血管段用于提取信使核糖核酸(mRNA)。常规酒精脱水,石蜡包埋,横段连续切片,厚4 μm,每隔8张取1张,每份血管标本取4张。生物素—亲和素—过氧化物酶免疫组织化学法进行ICAM-1的免疫组织化学分析,3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶30分钟,5%的牛血清白蛋白阻断非特异性结合,羊抗ICAM-1抗体(1∶400)4℃过夜,生物素化兔抗羊抗体(1∶200)孵育60分钟,链酶亲和素标记的辣根过氧化物酶(1∶200)孵育30分钟,二氨基联苯胺—过氧化氢显色。计算机图像分析仪对免疫组织化学结果进行灰度值测定。③Northern Blot分析:异硫氰酸胍一步法提取组织总核糖核酸(RNA)[4]。紫外分光仪定量,每组取30 μg RNA上样电泳,转膜,用α32P-dCTP标记的cDNA探针杂交,洗膜后-70℃压片24小时,常规显影定影后,洗脱液处理尼龙膜,α32P-dCTP标记的β-actin探针再次杂交,以检测上样RNA的完整性与加样的准确性。
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统计学处理:各数值以
±s表示,配对t检验进行计量资料分析。2 结果
2.1 血清胆固醇与L-精氨酸浓度
饲喂至8周的Wistar大鼠各组血清胆固醇浓度为NC组:1.61±0.70 mmol/L,CC组:8.76±1.46 mmol/L,AC组:8.84±1.22 mmol/L,AC组与CC组的血清胆固醇浓度差别无显著性,但两组的血清胆固醇浓度明显高于NC组4倍左右。各组的L-精氨酸浓度为NC组:46±15 μmol/L,CC组:52±11 μmol/L,AC组:116±21 μmol/L,NC组与CC组的血清L-精氨酸浓度差别无显著性,而AC组的血清L-精氨酸浓度较另两组高1倍以上,有显著差别(P<0.01)。
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2.2 L-精氨酸对血管壁血管细胞间粘附分子的影响(图1)
计算机图像分析示3组ICAM-1表达的灰度值分别为NC组:25.70±5.30,CC组:179.26±10.71,AC组:82.56±12.68,3组中各组n=30次,3组的灰度值间有显著差别(P<0.01)。
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图1 大鼠主动脉血管细胞间粘附分子(ICAM-1)的免疫组织化学(×200)。NC组显示ICAM-1轻度表达(图1a),CC组内皮及内膜平滑肌细胞ICAM-1表达明显升高(图1b),饲喂L-精氨酸后ICAM-1的表达明显受到抑制(图1c)
2.3 L-精氨酸对血管壁血管细胞间粘附分子信使核糖核酸的影响
大鼠主动脉血管细胞间粘附分子信使核糖核酸表达检测见图2。Northern Blot的结果提示AC组的ICAM-1 mRNA的表达明显被抑制,低于CC组。
图2 大鼠主动脉血管细胞间粘附分子信使核糖核酸表达检测(Northern Blot)。NC组饲喂普通饲料 CC组饲喂高胆固醇饲料 AC组饲喂高胆固醇,饮水中加入L-精氨酸 ICAM-1:主动脉血管细胞间粘附分子
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3 讨论
本实验结果显示NC组大鼠的主动脉壁内膜ICAM-1微量表达,CC组大鼠主动脉内皮及内膜平滑肌细胞ICAM-1表达明显升高,内皮尤甚,AC组大鼠主动脉内膜的ICAM-1表达明显下降。3组大鼠血管壁组织ICAM-1的Northern Blot结果提示ICAM-1 mRNA的表达CC组明显高于NC组,而AC组的ICAM-1 mRNA表达明显被L-精氨酸所抑制。故推测L-精氨酸对ICAM-1表达的抑制是其抑制动脉粥样硬化发生发展的分子机制之一。
大量单核细胞在血管壁粘附并穿壁募集于内膜是动脉粥样硬化发生、发展的关键因素。1984年,Joris等[2]运用enface方法在高胆固醇鼠的主动脉内皮观察到随着血清胆固醇浓度的升高,粘附于内皮的单核细胞数量增多,并证实单核细胞穿壁进入内皮下吞噬脂质成为泡沫细胞并进而进展为典型的动脉粥样硬化斑块。渗透入血管壁的单核细胞吞噬脂质形成泡沫细胞后可返回血流,将脂质输送到肝脏进行代谢。若某些因素阻滞这些细胞返回血流而在血管壁内募集,则这些细胞可合成和释放许多因子,促使细胞外基质的合成堆积,并促使血管平滑肌细胞的增殖和向内膜下迁移,由此导致动脉粥样硬化的形成及进展[5～7]。阻滞这些细胞返回血流的分子机制之中,细胞膜表面表达的粘附分子是其重要一员,如粘附分子之一的ICAM-1,它与细胞表面的配体结合后,可阻滞相应的单核/巨噬细胞、淋巴细胞返回血流。一些研究亦发现表达于血管细胞的ICAM-1是与动脉粥样硬化的发生及严重程度显著相关的分子之一[8]。L-精氨酸抑制ICAM-1的表达在一定程度上阻断了单核细胞对血管的粘附及在血管壁的募集这一病理过程,从而抑制了动脉粥样硬化的发生发展。此结果亦为研制新的一氧化氮的供体及衍生物作为有效的抗动脉粥样硬化药物提供了新的理论依据。
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作者简介：霍玉庆 男 31岁 住院医师 博士
参考文献
1 Ross R.Pathogenesis of atherosclerosis.N Engl J Med,1986,314:488—492.
2 Joris I,Zand T,Nunnarl JJ,et al.Studies on the pathogenesis of atherosclerosis,Am J Pathol,1983,113:341—352.
3 Tsao PS,McEvory LM,Drexler H,et al.Enhanced endothelial adhesiveness in hypercholesterolemia is attenuated by L-arginine.Circulation,1994,89:2176—2184.
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4 Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-choroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156—159.
5 Ross R,Masuda J,Raines EW,et al.Localization of PDGF-β protein in macrophage in all phases of atherogenesis.Science,1990,248:1009—1015.
6 Assoian RK,Fleurdelys BE,Stevenson HC,et al.Expression and secretion of type beta transforming growth factor by activated human macrophages.Proc Natl Acad Sci USA,1987,84:6020—6027.
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7 Bjorkerud S.Effects of transforming growth factor-β1 on human arterial smooth muscle cell in vitro.Arterioscler Thromb,1991,11:892—902.
8 O'Brien KD,McDonald TO,Chat A,et al.Neovascular expression of E-selectin,intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 in human atherosclerosis and their relation to intimal leukocyte content.Circulation,1996,93:677—683.
(收稿:1998-03-20 修回:1998-11-09), 百拇医药