去纤酶对冠状动脉损伤后C-fos基因表达的影响*
作者：向定成 黄大显 盖鲁粤 刘宏斌
单位：向定成：广州军区广州总医院心内科，广东 510010；黄大显 盖鲁粤 刘宏斌：解放军总医院心内科，北京 100853
关键词：去纤酶；癌基因；再狭窄
去纤酶对冠状动脉损伤后C 摘要 目的：探讨去纤酶抑制血管损伤后内膜增生的机制。方法：以犬冠状动脉内植入过大钽丝支架致血管内膜过度增生为动物模型，用常规组织方法、免疫组化及mRNA原位杂交技术分别检测新生内膜厚度、新生内膜中血管平滑肌细胞增生及C-fos基因的转录情况，并采用随机对照方法观察去纤酶对血管损伤后内膜增生程度、α平滑肌肌动蛋白表达及C-fos基因转录的影响。结果：去纤酶组新生内膜厚度、α平滑肌肌动蛋白的表达及C-fos的转录水平均显著低于对照组(P分别<0.05及0.01)。结论：去纤酶可能通过影响C-fos基因的转录水平而抑制血管平滑肌细胞增生，这可能是该药抑制血管损伤后的内膜增生反应的作用机制之一。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 977.3
The effects of defibrase on expression of C-fos oncogene
in the injury of coronary arteries
Xiang Dingcheng,huang Daxian, Gai Luyue, Liuhongbin
(Department of Cardiology, Generalhospital of Guangzhou Armed Force, Guangzhou 510010)
Abstract Objective：To investigate themechanism of defibrase inhibiting the neointimal proliferation after vascular injury.Methods: Oversized tantalum coils were implanted into coronary arteries in 19 dogs.Ten dogs were randomly treated with defibrase (group A) and the others (group B) received two doses ofheparin only.The dogs werekilled 28 days after the implantation.Histopathology withhematoxylin-eosin staining, immunohistochemisty with α-Actinmonocolon-antibody and in situhybridization were employed to investigate the neointimal and to detect the proliferation of vascularmuscle cells and the expression of C-fos oncogene.A computer image analysis system wasUsed tomeasure the neointimal thickness and the stain density indexes of α-Actin and C-fos.Results：The neointimal thickness, the expression of α-Actin and the transcription of C-fos oncogene were lower in group A than in group B.Conclusion:Defibrase decreased the intimalhyperplasia, whichmight be the results of inhibiting the proliferation of vascularmuscle cells by decreasing the expression of C-fos oncogene.
, 百拇医药
Key words defibrase; oncogene; restenosis
近年来，经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)的发展已日趋成熟，但术后高达 25%～50% 的再狭窄率仍是影响该技术远期疗效的主要因素〔1〕，再狭窄发生的机制中血管平滑肌细胞过度增生可能是关键的环节之一〔2〕，笔者拟以犬冠状动脉内植入过大支架致血管内膜过度增生为动物模型，用免疫组化及原位杂交技术检测增生组织中平滑肌细胞增生及C-fos基因的mRNA表达情况，并观察去纤酶对其转录水平以及新生内膜增生程度的影响。
1 材料和方法
1.1 动物分组 家犬 19 只，体重 15～18kg，随机分为对照组(n=9)和去纤酶组(n=10)，分别于术前 30min静注肝素 3mg/kg或去纤酶 0.1U/kg，2.5%硫喷妥钠 20mg/kg静脉麻醉，按文献〔3〕方法植入冠脉内钽丝支架，血管与支架直径比例为 1.0∶1.3，术后对照组即刻皮下注射肝素 5mg/kg，治疗组每间隔 2 d静脉注射去纤酶(北京爱施康科技开发中心提供)0.1U/kg，两组动物均 4 周后处死；分离支架段血管，切成 2～3mm小段，立即用改良Carnoy液固定 2h，石蜡包埋后作连续切片分别作常规组织学染色、免疫组化及原位杂交。
, 百拇医药
1.2 免疫组化 采用α平滑肌肌动蛋白(α-Actin)单克隆抗体按LSAB法〔4〕作免疫组化染色，单克隆抗体及免疫组化试剂盒均为DAKO公司产品，设不加单克隆抗体的阴性对照。
1.3 原位杂交 用光敏生物素标记的C-fos探针(200bp，军事医学科学院提供)作mRNA原位杂交。
1.4 图像定量分析 采用IBAS-2000型图像处理系统，将免疫组化及原位杂交切片图像摄入计算机，用系统内设定的程序测定切片上新生内膜的染色密度，选定测定范围后系统自动分析并显示单位面积的染色密度值，将阳性切片测量值减去阴性对照片测量值即为相对染色密度指数。
1.5 统计学处理 两均数t检验。
2 结果
光镜下可见支架段血管内膜显著增生，α-Actin免疫组化染色表明内膜增生组织中有大量血管平滑肌细胞，原位杂交检测到增生组织中α-fos癌基因mRNA阳性染色主要分布于增生的血管平滑肌细胞，图像分析测定结果见附表，去纤酶组测定值均低于对照组。
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附表 图像定量分析结果(
±s，相对密度值)
肝素组(n=9)
去纤酶组(n=10)
新生内膜厚度(μm)
405±139
212±79*
α-Actin免疫组化
32.6±11.2
19.3±10.8*
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C-fos原位杂交
45.8±13.2
23.4±10.0**
*，**分别为与肝素组比较P<0.05及0.01
3 讨论
我们已报道了去纤酶抑制冠状动脉损伤后内膜增生反应的初步实验结果〔5〕，为进一步探讨去纤酶抑制血管内膜增生反应的机制，我们用免疫组化及原位杂交技术检测了新生内膜中血管平滑肌细胞及C-fos基因的转录情况，结果表明新生内膜中含有大量血管平滑肌细胞，且平滑肌细胞中有C-fos癌基因的高水平转录，已知C-fos属即早期癌基因(Immediate-early gene)，常在血小板源生长因子、表皮生长因子等作用下迅速转录，其表达产物在细胞对其它因子的调控中起极其重要的作用，与细胞增殖周期的启动有关，阳性结果表明细胞处于增殖活跃期〔6〕，相关的研究表明C-fos的转录常在损伤后 30min达高峰〔7〕，但本结果显示在支架植入后 4 周仍可检测到C-fos癌基因的mRNA，可能与支架的慢性刺激作用导致血管平滑肌细胞呈持续性增生有关。从附表可见去纤酶治疗组新生内膜厚度显著低于对照组，而其α-Actin的免疫组化染色密度指数和C-fos癌基因mRNA的阳性杂交信号强度均低于对照组，说明去纤酶在该动物模型上具有降低血管损伤后的内膜增生程度的作用，该作用可能与去纤酶降低C-fos癌基因的转录进而抑制血管平滑肌细胞增生有关。有关去纤酶抑制C-fos癌基因转录的确切机制尚不清楚，推测可能与该药抑制血小板的活性〔8〕有关，因为在血管损伤后有大量的血小板激活、聚集和粘附并释放大量血小板源生长因子，该因子又可进一步激活C-fos等即早期癌基因的转录从而启动平滑肌细胞的增殖周期，因此，抑制血小板活性可能是去纤酶影响C-fos转录的途径之一。此外，我们在最近的研究中发现，去纤酶尚可抑制血管损伤后内皮细胞中V-sis基因的激活和血小板源生长因子的表达〔9〕，而后者是启动C-fos癌基因转录和表达的重要调节因子。其详细的作用机制尚待进一步的研究加以阐明。
, 百拇医药
*“八五”军队医药卫生科研基金资助项目，批准号 91A010-0044
参考文献
[1]Weitraub WS.Restenosis after coronary angioplasty: a progress report.Primary Cardiology, 1994，20(1)∶39
[2]Wilcox JN.Molecular biology: insight into the causes and prevention of restenosis after arterial intervention.Am J Cardiol, 1993，72∶88E
[3]向定成，盖鲁粤，黄大显 等.犬冠状动脉内植入过大钽丝支架—一种新的再狭窄模型.临床心血管病杂志，1997，13(4)∶225
, 百拇医药
[4]Lawrencem, Watson L, Pettijohn T et al.Immunohistochemical localization of proliferating cells, basic fibroblast growth factor and Fos protein following iliac artery balloon angioplasty inhypercholesterolemic rabbits.In Vivo, 1995，9(1)∶27
[5]向定成，黄大显，盖鲁粤.去纤酶对实验性犬冠状动脉成形术后内膜增生的抑制作用.中国循环杂志，1996，11(5)∶278
[6]SharmahS, Wunschm, Brand T et al.Molecular biology of coronary vascular andmyocardial responses to ischemia.J Cardiovasc Pharmacol, 1992，20∶231
, 百拇医药
[7]Badimon L, Alfon J, Royo T et al.Cell biology of restenosis post-angioplasty.Z-Kardiol, 1995,84(4)∶145
[8]向定成，黄大显，盖鲁粤等.去纤酶及肝素预防冠状动脉介入治疗后早期血栓形成的作用比较.中华内科杂志，1997,36(12)∶799
[9]向定成，黄大显，盖鲁粤等.去纤酶对血管损伤后内膜V-sis基因转录和PDGF-BB表达的影响.解放军医学杂志，1998,23(1)∶8
(1998—08—13收稿，1998—09—22修回), 百拇医药
单位：向定成：广州军区广州总医院心内科，广东 510010；黄大显 盖鲁粤 刘宏斌：解放军总医院心内科，北京 100853
关键词：去纤酶；癌基因；再狭窄
去纤酶对冠状动脉损伤后C 摘要 目的：探讨去纤酶抑制血管损伤后内膜增生的机制。方法：以犬冠状动脉内植入过大钽丝支架致血管内膜过度增生为动物模型，用常规组织方法、免疫组化及mRNA原位杂交技术分别检测新生内膜厚度、新生内膜中血管平滑肌细胞增生及C-fos基因的转录情况，并采用随机对照方法观察去纤酶对血管损伤后内膜增生程度、α平滑肌肌动蛋白表达及C-fos基因转录的影响。结果：去纤酶组新生内膜厚度、α平滑肌肌动蛋白的表达及C-fos的转录水平均显著低于对照组(P分别<0.05及0.01)。结论：去纤酶可能通过影响C-fos基因的转录水平而抑制血管平滑肌细胞增生，这可能是该药抑制血管损伤后的内膜增生反应的作用机制之一。
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中国图书资料分类法分类号 R 977.3
The effects of defibrase on expression of C-fos oncogene
in the injury of coronary arteries
Xiang Dingcheng,huang Daxian, Gai Luyue, Liuhongbin
(Department of Cardiology, Generalhospital of Guangzhou Armed Force, Guangzhou 510010)
Abstract Objective：To investigate themechanism of defibrase inhibiting the neointimal proliferation after vascular injury.Methods: Oversized tantalum coils were implanted into coronary arteries in 19 dogs.Ten dogs were randomly treated with defibrase (group A) and the others (group B) received two doses ofheparin only.The dogs werekilled 28 days after the implantation.Histopathology withhematoxylin-eosin staining, immunohistochemisty with α-Actinmonocolon-antibody and in situhybridization were employed to investigate the neointimal and to detect the proliferation of vascularmuscle cells and the expression of C-fos oncogene.A computer image analysis system wasUsed tomeasure the neointimal thickness and the stain density indexes of α-Actin and C-fos.Results：The neointimal thickness, the expression of α-Actin and the transcription of C-fos oncogene were lower in group A than in group B.Conclusion:Defibrase decreased the intimalhyperplasia, whichmight be the results of inhibiting the proliferation of vascularmuscle cells by decreasing the expression of C-fos oncogene.
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Key words defibrase; oncogene; restenosis
近年来，经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)的发展已日趋成熟，但术后高达 25%～50% 的再狭窄率仍是影响该技术远期疗效的主要因素〔1〕，再狭窄发生的机制中血管平滑肌细胞过度增生可能是关键的环节之一〔2〕，笔者拟以犬冠状动脉内植入过大支架致血管内膜过度增生为动物模型，用免疫组化及原位杂交技术检测增生组织中平滑肌细胞增生及C-fos基因的mRNA表达情况，并观察去纤酶对其转录水平以及新生内膜增生程度的影响。
1 材料和方法
1.1 动物分组 家犬 19 只，体重 15～18kg，随机分为对照组(n=9)和去纤酶组(n=10)，分别于术前 30min静注肝素 3mg/kg或去纤酶 0.1U/kg，2.5%硫喷妥钠 20mg/kg静脉麻醉，按文献〔3〕方法植入冠脉内钽丝支架，血管与支架直径比例为 1.0∶1.3，术后对照组即刻皮下注射肝素 5mg/kg，治疗组每间隔 2 d静脉注射去纤酶(北京爱施康科技开发中心提供)0.1U/kg，两组动物均 4 周后处死；分离支架段血管，切成 2～3mm小段，立即用改良Carnoy液固定 2h，石蜡包埋后作连续切片分别作常规组织学染色、免疫组化及原位杂交。
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1.2 免疫组化 采用α平滑肌肌动蛋白(α-Actin)单克隆抗体按LSAB法〔4〕作免疫组化染色，单克隆抗体及免疫组化试剂盒均为DAKO公司产品，设不加单克隆抗体的阴性对照。
1.3 原位杂交 用光敏生物素标记的C-fos探针(200bp，军事医学科学院提供)作mRNA原位杂交。
1.4 图像定量分析 采用IBAS-2000型图像处理系统，将免疫组化及原位杂交切片图像摄入计算机，用系统内设定的程序测定切片上新生内膜的染色密度，选定测定范围后系统自动分析并显示单位面积的染色密度值，将阳性切片测量值减去阴性对照片测量值即为相对染色密度指数。
1.5 统计学处理 两均数t检验。
2 结果
光镜下可见支架段血管内膜显著增生，α-Actin免疫组化染色表明内膜增生组织中有大量血管平滑肌细胞，原位杂交检测到增生组织中α-fos癌基因mRNA阳性染色主要分布于增生的血管平滑肌细胞，图像分析测定结果见附表，去纤酶组测定值均低于对照组。
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附表 图像定量分析结果(
±s，相对密度值)肝素组(n=9)
去纤酶组(n=10)
新生内膜厚度(μm)
405±139
212±79*
α-Actin免疫组化
32.6±11.2
19.3±10.8*
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C-fos原位杂交
45.8±13.2
23.4±10.0**
*，**分别为与肝素组比较P<0.05及0.01
3 讨论
我们已报道了去纤酶抑制冠状动脉损伤后内膜增生反应的初步实验结果〔5〕，为进一步探讨去纤酶抑制血管内膜增生反应的机制，我们用免疫组化及原位杂交技术检测了新生内膜中血管平滑肌细胞及C-fos基因的转录情况，结果表明新生内膜中含有大量血管平滑肌细胞，且平滑肌细胞中有C-fos癌基因的高水平转录，已知C-fos属即早期癌基因(Immediate-early gene)，常在血小板源生长因子、表皮生长因子等作用下迅速转录，其表达产物在细胞对其它因子的调控中起极其重要的作用，与细胞增殖周期的启动有关，阳性结果表明细胞处于增殖活跃期〔6〕，相关的研究表明C-fos的转录常在损伤后 30min达高峰〔7〕，但本结果显示在支架植入后 4 周仍可检测到C-fos癌基因的mRNA，可能与支架的慢性刺激作用导致血管平滑肌细胞呈持续性增生有关。从附表可见去纤酶治疗组新生内膜厚度显著低于对照组，而其α-Actin的免疫组化染色密度指数和C-fos癌基因mRNA的阳性杂交信号强度均低于对照组，说明去纤酶在该动物模型上具有降低血管损伤后的内膜增生程度的作用，该作用可能与去纤酶降低C-fos癌基因的转录进而抑制血管平滑肌细胞增生有关。有关去纤酶抑制C-fos癌基因转录的确切机制尚不清楚，推测可能与该药抑制血小板的活性〔8〕有关，因为在血管损伤后有大量的血小板激活、聚集和粘附并释放大量血小板源生长因子，该因子又可进一步激活C-fos等即早期癌基因的转录从而启动平滑肌细胞的增殖周期，因此，抑制血小板活性可能是去纤酶影响C-fos转录的途径之一。此外，我们在最近的研究中发现，去纤酶尚可抑制血管损伤后内皮细胞中V-sis基因的激活和血小板源生长因子的表达〔9〕，而后者是启动C-fos癌基因转录和表达的重要调节因子。其详细的作用机制尚待进一步的研究加以阐明。
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*“八五”军队医药卫生科研基金资助项目，批准号 91A010-0044
参考文献
[1]Weitraub WS.Restenosis after coronary angioplasty: a progress report.Primary Cardiology, 1994，20(1)∶39
[2]Wilcox JN.Molecular biology: insight into the causes and prevention of restenosis after arterial intervention.Am J Cardiol, 1993，72∶88E
[3]向定成，盖鲁粤，黄大显 等.犬冠状动脉内植入过大钽丝支架—一种新的再狭窄模型.临床心血管病杂志，1997，13(4)∶225
, 百拇医药
[4]Lawrencem, Watson L, Pettijohn T et al.Immunohistochemical localization of proliferating cells, basic fibroblast growth factor and Fos protein following iliac artery balloon angioplasty inhypercholesterolemic rabbits.In Vivo, 1995，9(1)∶27
[5]向定成，黄大显，盖鲁粤.去纤酶对实验性犬冠状动脉成形术后内膜增生的抑制作用.中国循环杂志，1996，11(5)∶278
[6]SharmahS, Wunschm, Brand T et al.Molecular biology of coronary vascular andmyocardial responses to ischemia.J Cardiovasc Pharmacol, 1992，20∶231
, 百拇医药
[7]Badimon L, Alfon J, Royo T et al.Cell biology of restenosis post-angioplasty.Z-Kardiol, 1995,84(4)∶145
[8]向定成，黄大显，盖鲁粤等.去纤酶及肝素预防冠状动脉介入治疗后早期血栓形成的作用比较.中华内科杂志，1997,36(12)∶799
[9]向定成，黄大显，盖鲁粤等.去纤酶对血管损伤后内膜V-sis基因转录和PDGF-BB表达的影响.解放军医学杂志，1998,23(1)∶8
(1998—08—13收稿，1998—09—22修回), 百拇医药