细胞凋亡检测的研究进展及其与疾病的关系
作者：李晓军 武建国
单位：南京军区南京总医院 全军医学检验中心，南京210002
关键词：
临床检验杂志990132 细胞凋亡(Apoptosis)是细胞生命周期中的重要组成部分。Apoptosis一词源于希腊文，指秋天树叶凋落，它是一种不同于坏死的由基因调控的细胞主动性死亡过程，可见于胚胎发育、组织发生、组织分化、细胞癌变等过程[1]。在免疫学上，细胞凋亡参与介导胸腺及周围T细胞耐受，细胞毒T细胞介导靶细胞溶解等过程[2]。细胞凋亡是当今医学界研究的热点之一，已渗透到生物学、基础医学、临床治疗和药物筛选等许多领域。对细胞凋亡(Ap)机制的探讨，为临床上研究某些疑难病症如AIDS、肿瘤、自身免疫病等发病机制及治疗策略开辟了新的领域。
许多因素可诱导凋亡或抑制凋亡，如激素、细胞因子、抗体、超抗原、粘附分子、免疫细胞(K、NK)、化疗药物、致癌药、生长因子缺失、高温、放射线等，根据靶细胞不同，某些物质可能有双重作用。细胞内与Ap有关的基因可分两类：①诱导凋亡基因：野生型P 53、Ced-3、Ced-4、c-myc、ICE家族、Fas/Apo-1、reaper、hid等；②抑制凋亡基因：Bc1-2、Ced-9、V-raf、EBV-CMP 1等[3、4]。目前判断Ap的方法很多，主要依据细胞形态学改变、细胞膜通透性变化、DNA片段化等一系列指标。
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1 细胞凋亡的形态学及生化特征
细胞凋亡与坏死不同，表现在发生机制、形态学和生物化学等各个方面。细胞坏死亦称病理性死亡，是缺氧、代谢毒物等有害因子作用于细胞引起的炎症反应，早期改变主要是细胞肿胀、质膜破裂、溶酶体酶释放，最终导致细胞和组织的炎症反应；而凋亡则是发生于正常生理状态下的细胞死亡，其始发因素往往源于细胞内外的死亡信息，通过信息传递而导致某些基因的转录、翻译，这些蛋白质最终作用于细胞引起Ap。Ap主要表现在细胞萎缩，核染色质致密，常聚集于核膜上，呈境界分明的新月形或块状小体，胞膜皱摺或出泡(blebbing)，完整细胞膜将细胞器及碎片包裹成多个小体，形成凋亡小体。凋亡小体被邻近吞噬细胞吞噬，不引起周围组织的炎症反应[1、5]。细胞Ap的生化特征是基因组DNA发生有规律的不可逆性降解，核小体之间的连接部双螺旋DNA被特异性Ca2+/Mg2+依赖的DNA内切酶断裂成含180～200 bp的多倍寡核小体片段，在含EB的琼脂糖电泳上呈典型的梯状(ladder)条带。
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2 细胞Ap常用的检测方法
2.1 细胞形态学观察法 目前认为凋亡细胞特异性的形态学改变是判断Ap最可靠的指标[6]。
2.1.1 光学显微镜 组织切片或细胞涂片经HE或甲基绿-派诺宁染色后，在油镜下观察，Ap细胞体积缩小，胞质浓缩，核染色质密度增高，呈致密浓染的块状或颗粒状。由于光镜不能早期发现Ap细胞核及细胞器的改变，故常不作为单独判断Ap的指标。
2.1.2 电子显微镜 电镜下观察，Ap细胞染色质固缩，常聚集于核膜上呈境界分明的块状或新月形小体，初期细胞可见完整的细胞器，细胞膜完整，凋亡小体形成。目前一致认为，电镜下获得凋亡细胞特征性的形态学改变是判断细胞Ap的最可靠依据。
2.1.3 荧光显微镜 对体外培养的活细胞经荧光色素处理，可在荧光显微镜下观察细胞形态改变。常用荧光色素有①吖啶橙；②Hoechst 33258或Hoechst 33342；③碘化丙啶(PI)；④溴乙锭(EB)。前两种可分别进入活细胞和死细胞，而后两种荧光素仅能进入死细胞。不同的荧光素使核着染不同颜色的荧光，正常细胞呈均匀荧光染色，而Ap细胞呈致密浓染的颗粒状或块状荧光。荧光镜检查简便易行，但定量定位均不如后面提到的流式细胞计数法可靠。
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2.2 反映凋亡细胞膜改变的方法
2.2.1 染料排斥法 除了电镜能反映细胞膜完整性外，还可用染料排斥法，如台盼蓝、PI等。坏死细胞膜破损，被染料着染；而Ap细胞膜完整，不被着染，但在体外培养的细胞最终也会发生继发性坏死，因此，此法不能单独用来判断Ap。
2.2.2 流式细胞仪观察法 另一种方法是判断胞质膜的不对称性。在正常细胞膜上，磷脂酰丝氨酸基团(PS)位于胞质侧；而在细胞凋亡早期，膜上此基团则转向胞外侧，以利于被吞噬。因此，磷脂酰丝氨酸基团位置的改变，可作为凋亡细胞一个标志。膜联蛋白中的Annexin Ⅴ，即锚定蛋白，是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，即锚定蛋白(anchorin)，与磷脂酰丝氨酸有强亲和力。将此蛋白质标记上荧光素(FLUOS或AlexaTM 568)，与PI(或BOBOTM-1)一起处理悬浮细胞，通过流式细胞仪即可观察细胞Ap情况；因PI选择性与坏死细胞而不与凋亡细胞结合，可将凋亡细胞和坏死细胞区别开来。将此蛋白标记上生物素，可通过免疫组化的方法对组织切片或细胞涂片进行凋亡细胞的检测[7、8]。该法还可进行双重(或多重)标记，将Annexin Ⅴ与抗细胞膜表型抗体同时应用，可在测定凋亡细胞同时测定细胞表型特异性。如用两种发不同颜色的荧光素，PI(橙色)和FITC(绿色)，分别标记抗CD 4单克隆抗体和Annexin Ⅴ，与PI一起通过流式细胞仪，可同时观测研究细胞表型与细胞凋亡的关系。
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2.3 反映DNA有规律断裂的方法 Ap过程中,DNA有规律地断裂可以通过下述几种方法检测出来。
2.3.1 琼脂糖凝胶电泳法 细胞悬液经裂解消化按常规法提取DNA后，于含EB的琼脂糖凝胶中进行电泳，正常细胞DNA呈单一条带；细胞Ap时呈典型的梯状条带，系180～200 bp左右的及多聚核小体的梯状DNA条带；坏死时则呈模糊的弥散状条带。DNA电泳法是判断Ap的经典方法，但对于一些特殊类型的不发生DNA断裂的细胞Ap可能缺乏诊断价值。
2.3.2 流式细胞仪观察法 此法系通过荧光色素如PI、Hoechst等亲DNA的特性分析悬浮细胞DNA含量的直方图来达到判断细胞Ap的目的[6、9]。①PI染色法：Ap细胞经PI染色，流式细胞仪检测在正常细胞G1期的峰前增加一个特异性亚二倍体核型峰，即Ap细胞特有的Ap峰。此法优点是可以定量，灵敏度高；缺点是不能观察S期和G2期凋亡的细胞，不能区别死细胞和活细胞。②Hoechst-PI法：此法可克服PI法的不足。Hoechst可被活细胞摄取，与DNA结合呈蓝色荧光；PI使死细胞呈红色荧光。因此，在直方图上可以根据红蓝两种荧光判断三种细胞。正常细胞呈弱蓝、弱红光；Ap细胞呈强蓝、弱红光；坏死细胞呈弱蓝、强红光。
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2.3.3 DNA末端标记法 利用Ap细胞在核酸内切酶的作用下，DNA断裂产生粘性末端的原理，用外源修饰化的核苷酸对这些断裂的DNA 3′末端用原位切口平移法或原位末端标记法进行标记，再用免疫学的方法对Ap细胞进行定量、定位测定。所用标记物包括生物素[10]、地高辛、荧光素[11]，用标记上这些物质的核苷酸与组织切片、细胞涂片或悬浮细胞进行处理，处理后可直接通过荧光显微镜或流式细胞仪观察；也可再加上酶标记的抗地高辛抗体、抗荧光素抗体或酶标记亲和素及相应底物用光学显微镜观察。
2.3.4 ELISA[12] 对Ap细胞内DNA片段的检测还可用ELISA法。悬浮细胞经裂解、高速离心去除核的成分后，取上清加入已包被有抗组蛋白抗体的反应板微孔，反应后再加酶标抗DNA抗体，若上清中含断裂的DNA片段，则可通过此双抗体夹心法得以检出。
3 细胞凋亡与疾病的关系
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近年来的研究表明，Ap异常可导致某些疾病的发生发展，如Ap功能受抑可见于肿瘤、自身免疫病(AID)、病毒感染等；Ap功能增强则见于AIDS、骨质疏松、神经退变性疾病等[13](表1)。
表1 凋亡与疾病的关系 与Ap减少有关的疾病
与Ap增多有关的疾病
癌症
前列腺癌
囊泡淋巴瘤
乳腺癌
卵巢癌
自身免疫病
SLE
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糖尿病
银屑病
病毒感染
疱疹病毒
痘病毒
腺病毒
神经退变性疾病
Parkinson病
Alzheimer病
肌萎缩性侧索硬化症
视网膜色素沉着症
再生障碍性贫血
, http://www.100md.com 缺血性损伤
心肌梗塞
中风
再灌注损伤
急性暴发性肝炎
AIDS
3.1 Ap与AID 细胞生理性的正常死亡对于机体清除自身反应淋巴细胞是十分重要的，Ap受阻在AID发病机制中起重要作用。Lpr和gld小鼠系AID(如SLE、干燥综合征、类风湿性关节炎等)的动物模型，已经证实这两类小鼠存在Fas/Fas-L功能缺陷。Fas蛋白是一种能传导Ap信息引起细胞Ap的死亡因子，其重要作用之一就是参与机体中枢性和外周性免疫耐受机制，从而起稳定免疫系统功能的作用，由于Lpr和gld小鼠胸腺细胞Fas或Fas-L表达水平明显下降，体内大量自身反应T细胞逃避了胸腺细胞的阴性选择，堆积在周围淋巴器官，导致大量自身抗体的产生，发生类似于人类SLE的AID[14、15]。Cheng[16]的研究结果表明，SLE病人血清中存在高水平的可溶性Fas，它能与细胞上Fas蛋白竞争性地与Fas-L结合，抑制Fas介导的淋巴细胞的克隆选择。
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除了Fas/Fas-L在诱导Ap中起重要作用外，其它因素如自身抗体、Bcl-2等对于细胞Ap的调控也十分重要[17、18]。自身抗体是AID的重要标志之一。目前认为SLE病人巨噬细胞吞噬凋亡小体的功能下降，凋亡细胞内容物(包括DNA、RNA、核蛋白等成分)外溢，作为自身抗原刺激外周血B淋巴细胞，诱导自身抗体产生。这种自身抗体反过来又能穿入淋巴细胞内，与胞内核抗原结合，阻止细胞停止在某一周期，抑制某些基因的表达，引起细胞Ap。已证实能引起Ap的自身抗体有抗DNA抗体、抗RNP抗体[17]、狼疮抗凝因子、抗恢复蛋白(recoverin)抗体[18]等。迄今为止，发现与Ap功能下降有关的自身免疫病还有类风湿性关节炎、Ⅰ型糖尿病(IDDM)、银屑病等。
3.2 Ap与肿瘤
人类许多肿瘤细胞特别是一些代谢性肿瘤细胞对某些生理性致Ap因子不敏感。正常机体组织细胞只在特异性生长因子存在的内环境中维持其存活，在非生理环境下则不能存活，而某些肿瘤细胞则能逃避这一环境限制。目前认为，造成这种异常表现的原因从分子机制上考虑有以下几种可能。①Bcl-2基因异常表达：Bcl-2是第一个被确认的存活基因，是在人囊泡淋巴瘤细胞中染色体易位断点上发现的，最初认为是癌基因。Bcl-2可抑制许多因素引起的Ap，Bcl-2的抑制基因可阻断Bcl-2的作用，诱导肿瘤细胞Ap[13]。Bcl-2及其相关基因产物异常表达能抑制肿瘤细胞发生凋亡。前列腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤等细胞Bcl-2过度表达常提示这些病人预后不良。Bcl-2及其同源蛋白的过度表达还能增强细胞对化疗药物(如阿糖胞苷、氨甲喋呤、长春新碱及顺铂)的抗药性，体外实验表明，过度表达Bcl-2及相关基因可导致抗药表型的形成。②P53基因表达下降：P53是一种Ap诱导基因，是介导由DNA损伤引起Ap的重要基因。肿瘤细胞P53基因表达不足，使细胞对由DNA损伤诱导的Ap不敏感，因而对化疗及放疗效果不佳，这种细胞比正常细胞更易发生基因突变。
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3.3 Ap与病毒感染 病毒感染导致宿主靶细胞发生凋亡，是机体预防病毒扩散的防御机制之一，其作用借助于细胞毒T淋巴细胞(CTL)。携有Fas-L的CTL遇到Fas阳性的病毒感染细胞后，可诱导其凋亡。CTL的这一作用在抗病毒感染中有重要意义，因为随着靶细胞基因组DNA的降解，可以有效地阻止病毒基因的扩增，防止病毒扩散。AIDS病人HIV感染后，HIV中gp 120蛋白与CD 4分子结合，被认为是导致CD 4+细胞Ap的重要因素，可能有直接启动Ap基因的作用。此外，HIV感染后的免疫细胞产生细胞因子(如TNF)或表达Fas，也可能导致CD 4+细胞因Ap而耗竭。病毒感染细胞，细胞利用Ap来杀死病毒，控制病毒扩散；同时病毒为了生存需要，也调动自身防御机制抑制凋亡的发生，如腺病毒产生的分子量19 000蛋白EIB能直接抑制细胞Ap。此外，EB病毒的BHRF 1，非洲猪瘟病毒的LMW5-HL均是Bcl-2类似基因；棒状病毒产生的Ap基因抑制物(IAP)及P35也对Ap具有抑制作用。病毒Ap抑制基因的产生对于病毒感染潜伏期的维持具有重要意义。
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3.4 Ap与神经系统疾病 迄今发现与Ap有关的神经系统疾病包括：Alzheimer′s病、Parkinson′s病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、色素性视网膜炎、脊肌萎缩症等。细胞凋亡导致中枢神经系统(CNS)特异部位神经元细胞渐进性死亡是产生上述疾病CNS功能障碍的重要机制之一。体外试验表明，遗传性ALS与编码铜-锌超氧化物歧化酶的基因发生突变有关，此类患者由于细胞内自由基解毒功能下降而造成自由基堆积引起细胞凋亡。用存活生长因子或抗氧化剂治疗可抑制细胞凋亡。脊肌萎缩症是一种多发于儿童的伴有脊索运动神经元进行性缺失的神经退变性疾病。最近研究发现其发病与一种被称为神经元细胞凋亡抑制蛋白(NAIP)基因有关，NAIP与棒状病毒凋亡抑制蛋白(IAP)具有同源性，而后者目前发现能抑制昆虫细胞凋亡，NAIP基因突变势必导致运动神经元对AP敏感性增高。Alzheimer′s病常伴有β淀粉样肽的堆积，β-淀粉样前体蛋白的基因突变与某种类型的家族性Alzheimer′s病有关。目前研究已证实，β淀粉样肽能诱导神经元细胞的凋亡。与色素性视网膜炎发病有关的基因包括三种光感受器基因：视紫红质、环鸟苷酸磷酸酸二酯酶、外周蛋白(peripherin)基因，其中任何一种基因发生突变均可导致光感受器细胞凋亡。
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4.5 Ap与缺血性损伤 以往的观点认为，组织器官发生缺血性损伤(如心肌梗塞、中风等)是由急性血流灌注障碍而导致细胞坏死引起。最近研究发现，缺血损伤的中心部位的细胞确实由于坏死而快速死亡，而位于中心部位外周的细胞则发生凋亡现象。体外试验表明心肌或神经元细胞缺氧可导致凋亡，推测心肌细胞或神经元细胞因缺血而死亡与细胞凋亡有关。体外试验也发现，凋亡抑制剂可控制缺血损伤部位的扩散。Gottlieb[19]等发现，兔缺血-再灌注心肌细胞出现DNA降解片段及核染色质浓缩现象，而正常或缺血但未再灌注的心肌细胞无此现象。提示心肌细胞凋亡是再灌注心肌损伤的特征之一，此现象可能与再灌注引起自由基和Ca2+内流增加有关。因此，当心肌梗塞等缺血性损伤发生时，一方面要实施恢复血流的再灌注，另一方面还要考虑到因细胞凋亡而造成的再灌注损伤，应考虑施加一种能改变心肌细胞凋亡阈值的药物，来防治再灌注损伤。
总之，对细胞凋亡现象及本质的不断深入研究，将为某些疾病发病机制的探讨及寻找有效防治措施提供一条新的研究领域。
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参考文献
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(1998-09-05收稿), 百拇医药
单位：南京军区南京总医院 全军医学检验中心，南京210002
关键词：
临床检验杂志990132 细胞凋亡(Apoptosis)是细胞生命周期中的重要组成部分。Apoptosis一词源于希腊文，指秋天树叶凋落，它是一种不同于坏死的由基因调控的细胞主动性死亡过程，可见于胚胎发育、组织发生、组织分化、细胞癌变等过程[1]。在免疫学上，细胞凋亡参与介导胸腺及周围T细胞耐受，细胞毒T细胞介导靶细胞溶解等过程[2]。细胞凋亡是当今医学界研究的热点之一，已渗透到生物学、基础医学、临床治疗和药物筛选等许多领域。对细胞凋亡(Ap)机制的探讨，为临床上研究某些疑难病症如AIDS、肿瘤、自身免疫病等发病机制及治疗策略开辟了新的领域。
许多因素可诱导凋亡或抑制凋亡，如激素、细胞因子、抗体、超抗原、粘附分子、免疫细胞(K、NK)、化疗药物、致癌药、生长因子缺失、高温、放射线等，根据靶细胞不同，某些物质可能有双重作用。细胞内与Ap有关的基因可分两类：①诱导凋亡基因：野生型P 53、Ced-3、Ced-4、c-myc、ICE家族、Fas/Apo-1、reaper、hid等；②抑制凋亡基因：Bc1-2、Ced-9、V-raf、EBV-CMP 1等[3、4]。目前判断Ap的方法很多，主要依据细胞形态学改变、细胞膜通透性变化、DNA片段化等一系列指标。
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1 细胞凋亡的形态学及生化特征
细胞凋亡与坏死不同，表现在发生机制、形态学和生物化学等各个方面。细胞坏死亦称病理性死亡，是缺氧、代谢毒物等有害因子作用于细胞引起的炎症反应，早期改变主要是细胞肿胀、质膜破裂、溶酶体酶释放，最终导致细胞和组织的炎症反应；而凋亡则是发生于正常生理状态下的细胞死亡，其始发因素往往源于细胞内外的死亡信息，通过信息传递而导致某些基因的转录、翻译，这些蛋白质最终作用于细胞引起Ap。Ap主要表现在细胞萎缩，核染色质致密，常聚集于核膜上，呈境界分明的新月形或块状小体，胞膜皱摺或出泡(blebbing)，完整细胞膜将细胞器及碎片包裹成多个小体，形成凋亡小体。凋亡小体被邻近吞噬细胞吞噬，不引起周围组织的炎症反应[1、5]。细胞Ap的生化特征是基因组DNA发生有规律的不可逆性降解，核小体之间的连接部双螺旋DNA被特异性Ca2+/Mg2+依赖的DNA内切酶断裂成含180～200 bp的多倍寡核小体片段，在含EB的琼脂糖电泳上呈典型的梯状(ladder)条带。
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2 细胞Ap常用的检测方法
2.1 细胞形态学观察法 目前认为凋亡细胞特异性的形态学改变是判断Ap最可靠的指标[6]。
2.1.1 光学显微镜 组织切片或细胞涂片经HE或甲基绿-派诺宁染色后，在油镜下观察，Ap细胞体积缩小，胞质浓缩，核染色质密度增高，呈致密浓染的块状或颗粒状。由于光镜不能早期发现Ap细胞核及细胞器的改变，故常不作为单独判断Ap的指标。
2.1.2 电子显微镜 电镜下观察，Ap细胞染色质固缩，常聚集于核膜上呈境界分明的块状或新月形小体，初期细胞可见完整的细胞器，细胞膜完整，凋亡小体形成。目前一致认为，电镜下获得凋亡细胞特征性的形态学改变是判断细胞Ap的最可靠依据。
2.1.3 荧光显微镜 对体外培养的活细胞经荧光色素处理，可在荧光显微镜下观察细胞形态改变。常用荧光色素有①吖啶橙；②Hoechst 33258或Hoechst 33342；③碘化丙啶(PI)；④溴乙锭(EB)。前两种可分别进入活细胞和死细胞，而后两种荧光素仅能进入死细胞。不同的荧光素使核着染不同颜色的荧光，正常细胞呈均匀荧光染色，而Ap细胞呈致密浓染的颗粒状或块状荧光。荧光镜检查简便易行，但定量定位均不如后面提到的流式细胞计数法可靠。
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2.2 反映凋亡细胞膜改变的方法
2.2.1 染料排斥法 除了电镜能反映细胞膜完整性外，还可用染料排斥法，如台盼蓝、PI等。坏死细胞膜破损，被染料着染；而Ap细胞膜完整，不被着染，但在体外培养的细胞最终也会发生继发性坏死，因此，此法不能单独用来判断Ap。
2.2.2 流式细胞仪观察法 另一种方法是判断胞质膜的不对称性。在正常细胞膜上，磷脂酰丝氨酸基团(PS)位于胞质侧；而在细胞凋亡早期，膜上此基团则转向胞外侧，以利于被吞噬。因此，磷脂酰丝氨酸基团位置的改变，可作为凋亡细胞一个标志。膜联蛋白中的Annexin Ⅴ，即锚定蛋白，是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，即锚定蛋白(anchorin)，与磷脂酰丝氨酸有强亲和力。将此蛋白质标记上荧光素(FLUOS或AlexaTM 568)，与PI(或BOBOTM-1)一起处理悬浮细胞，通过流式细胞仪即可观察细胞Ap情况；因PI选择性与坏死细胞而不与凋亡细胞结合，可将凋亡细胞和坏死细胞区别开来。将此蛋白标记上生物素，可通过免疫组化的方法对组织切片或细胞涂片进行凋亡细胞的检测[7、8]。该法还可进行双重(或多重)标记，将Annexin Ⅴ与抗细胞膜表型抗体同时应用，可在测定凋亡细胞同时测定细胞表型特异性。如用两种发不同颜色的荧光素，PI(橙色)和FITC(绿色)，分别标记抗CD 4单克隆抗体和Annexin Ⅴ，与PI一起通过流式细胞仪，可同时观测研究细胞表型与细胞凋亡的关系。
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2.3 反映DNA有规律断裂的方法 Ap过程中,DNA有规律地断裂可以通过下述几种方法检测出来。
2.3.1 琼脂糖凝胶电泳法 细胞悬液经裂解消化按常规法提取DNA后，于含EB的琼脂糖凝胶中进行电泳，正常细胞DNA呈单一条带；细胞Ap时呈典型的梯状条带，系180～200 bp左右的及多聚核小体的梯状DNA条带；坏死时则呈模糊的弥散状条带。DNA电泳法是判断Ap的经典方法，但对于一些特殊类型的不发生DNA断裂的细胞Ap可能缺乏诊断价值。
2.3.2 流式细胞仪观察法 此法系通过荧光色素如PI、Hoechst等亲DNA的特性分析悬浮细胞DNA含量的直方图来达到判断细胞Ap的目的[6、9]。①PI染色法：Ap细胞经PI染色，流式细胞仪检测在正常细胞G1期的峰前增加一个特异性亚二倍体核型峰，即Ap细胞特有的Ap峰。此法优点是可以定量，灵敏度高；缺点是不能观察S期和G2期凋亡的细胞，不能区别死细胞和活细胞。②Hoechst-PI法：此法可克服PI法的不足。Hoechst可被活细胞摄取，与DNA结合呈蓝色荧光；PI使死细胞呈红色荧光。因此，在直方图上可以根据红蓝两种荧光判断三种细胞。正常细胞呈弱蓝、弱红光；Ap细胞呈强蓝、弱红光；坏死细胞呈弱蓝、强红光。
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2.3.3 DNA末端标记法 利用Ap细胞在核酸内切酶的作用下，DNA断裂产生粘性末端的原理，用外源修饰化的核苷酸对这些断裂的DNA 3′末端用原位切口平移法或原位末端标记法进行标记，再用免疫学的方法对Ap细胞进行定量、定位测定。所用标记物包括生物素[10]、地高辛、荧光素[11]，用标记上这些物质的核苷酸与组织切片、细胞涂片或悬浮细胞进行处理，处理后可直接通过荧光显微镜或流式细胞仪观察；也可再加上酶标记的抗地高辛抗体、抗荧光素抗体或酶标记亲和素及相应底物用光学显微镜观察。
2.3.4 ELISA[12] 对Ap细胞内DNA片段的检测还可用ELISA法。悬浮细胞经裂解、高速离心去除核的成分后，取上清加入已包被有抗组蛋白抗体的反应板微孔，反应后再加酶标抗DNA抗体，若上清中含断裂的DNA片段，则可通过此双抗体夹心法得以检出。
3 细胞凋亡与疾病的关系
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近年来的研究表明，Ap异常可导致某些疾病的发生发展，如Ap功能受抑可见于肿瘤、自身免疫病(AID)、病毒感染等；Ap功能增强则见于AIDS、骨质疏松、神经退变性疾病等[13](表1)。
表1 凋亡与疾病的关系 与Ap减少有关的疾病
与Ap增多有关的疾病
癌症
前列腺癌
囊泡淋巴瘤
乳腺癌
卵巢癌
自身免疫病
SLE
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糖尿病
银屑病
病毒感染
疱疹病毒
痘病毒
腺病毒
神经退变性疾病
Parkinson病
Alzheimer病
肌萎缩性侧索硬化症
视网膜色素沉着症
再生障碍性贫血
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心肌梗塞
中风
再灌注损伤
急性暴发性肝炎
AIDS
3.1 Ap与AID 细胞生理性的正常死亡对于机体清除自身反应淋巴细胞是十分重要的，Ap受阻在AID发病机制中起重要作用。Lpr和gld小鼠系AID(如SLE、干燥综合征、类风湿性关节炎等)的动物模型，已经证实这两类小鼠存在Fas/Fas-L功能缺陷。Fas蛋白是一种能传导Ap信息引起细胞Ap的死亡因子，其重要作用之一就是参与机体中枢性和外周性免疫耐受机制，从而起稳定免疫系统功能的作用，由于Lpr和gld小鼠胸腺细胞Fas或Fas-L表达水平明显下降，体内大量自身反应T细胞逃避了胸腺细胞的阴性选择，堆积在周围淋巴器官，导致大量自身抗体的产生，发生类似于人类SLE的AID[14、15]。Cheng[16]的研究结果表明，SLE病人血清中存在高水平的可溶性Fas，它能与细胞上Fas蛋白竞争性地与Fas-L结合，抑制Fas介导的淋巴细胞的克隆选择。
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除了Fas/Fas-L在诱导Ap中起重要作用外，其它因素如自身抗体、Bcl-2等对于细胞Ap的调控也十分重要[17、18]。自身抗体是AID的重要标志之一。目前认为SLE病人巨噬细胞吞噬凋亡小体的功能下降，凋亡细胞内容物(包括DNA、RNA、核蛋白等成分)外溢，作为自身抗原刺激外周血B淋巴细胞，诱导自身抗体产生。这种自身抗体反过来又能穿入淋巴细胞内，与胞内核抗原结合，阻止细胞停止在某一周期，抑制某些基因的表达，引起细胞Ap。已证实能引起Ap的自身抗体有抗DNA抗体、抗RNP抗体[17]、狼疮抗凝因子、抗恢复蛋白(recoverin)抗体[18]等。迄今为止，发现与Ap功能下降有关的自身免疫病还有类风湿性关节炎、Ⅰ型糖尿病(IDDM)、银屑病等。
3.2 Ap与肿瘤
人类许多肿瘤细胞特别是一些代谢性肿瘤细胞对某些生理性致Ap因子不敏感。正常机体组织细胞只在特异性生长因子存在的内环境中维持其存活，在非生理环境下则不能存活，而某些肿瘤细胞则能逃避这一环境限制。目前认为，造成这种异常表现的原因从分子机制上考虑有以下几种可能。①Bcl-2基因异常表达：Bcl-2是第一个被确认的存活基因，是在人囊泡淋巴瘤细胞中染色体易位断点上发现的，最初认为是癌基因。Bcl-2可抑制许多因素引起的Ap，Bcl-2的抑制基因可阻断Bcl-2的作用，诱导肿瘤细胞Ap[13]。Bcl-2及其相关基因产物异常表达能抑制肿瘤细胞发生凋亡。前列腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤等细胞Bcl-2过度表达常提示这些病人预后不良。Bcl-2及其同源蛋白的过度表达还能增强细胞对化疗药物(如阿糖胞苷、氨甲喋呤、长春新碱及顺铂)的抗药性，体外实验表明，过度表达Bcl-2及相关基因可导致抗药表型的形成。②P53基因表达下降：P53是一种Ap诱导基因，是介导由DNA损伤引起Ap的重要基因。肿瘤细胞P53基因表达不足，使细胞对由DNA损伤诱导的Ap不敏感，因而对化疗及放疗效果不佳，这种细胞比正常细胞更易发生基因突变。
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3.3 Ap与病毒感染 病毒感染导致宿主靶细胞发生凋亡，是机体预防病毒扩散的防御机制之一，其作用借助于细胞毒T淋巴细胞(CTL)。携有Fas-L的CTL遇到Fas阳性的病毒感染细胞后，可诱导其凋亡。CTL的这一作用在抗病毒感染中有重要意义，因为随着靶细胞基因组DNA的降解，可以有效地阻止病毒基因的扩增，防止病毒扩散。AIDS病人HIV感染后，HIV中gp 120蛋白与CD 4分子结合，被认为是导致CD 4+细胞Ap的重要因素，可能有直接启动Ap基因的作用。此外，HIV感染后的免疫细胞产生细胞因子(如TNF)或表达Fas，也可能导致CD 4+细胞因Ap而耗竭。病毒感染细胞，细胞利用Ap来杀死病毒，控制病毒扩散；同时病毒为了生存需要，也调动自身防御机制抑制凋亡的发生，如腺病毒产生的分子量19 000蛋白EIB能直接抑制细胞Ap。此外，EB病毒的BHRF 1，非洲猪瘟病毒的LMW5-HL均是Bcl-2类似基因；棒状病毒产生的Ap基因抑制物(IAP)及P35也对Ap具有抑制作用。病毒Ap抑制基因的产生对于病毒感染潜伏期的维持具有重要意义。
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3.4 Ap与神经系统疾病 迄今发现与Ap有关的神经系统疾病包括：Alzheimer′s病、Parkinson′s病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、色素性视网膜炎、脊肌萎缩症等。细胞凋亡导致中枢神经系统(CNS)特异部位神经元细胞渐进性死亡是产生上述疾病CNS功能障碍的重要机制之一。体外试验表明，遗传性ALS与编码铜-锌超氧化物歧化酶的基因发生突变有关，此类患者由于细胞内自由基解毒功能下降而造成自由基堆积引起细胞凋亡。用存活生长因子或抗氧化剂治疗可抑制细胞凋亡。脊肌萎缩症是一种多发于儿童的伴有脊索运动神经元进行性缺失的神经退变性疾病。最近研究发现其发病与一种被称为神经元细胞凋亡抑制蛋白(NAIP)基因有关，NAIP与棒状病毒凋亡抑制蛋白(IAP)具有同源性，而后者目前发现能抑制昆虫细胞凋亡，NAIP基因突变势必导致运动神经元对AP敏感性增高。Alzheimer′s病常伴有β淀粉样肽的堆积，β-淀粉样前体蛋白的基因突变与某种类型的家族性Alzheimer′s病有关。目前研究已证实，β淀粉样肽能诱导神经元细胞的凋亡。与色素性视网膜炎发病有关的基因包括三种光感受器基因：视紫红质、环鸟苷酸磷酸酸二酯酶、外周蛋白(peripherin)基因，其中任何一种基因发生突变均可导致光感受器细胞凋亡。
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4.5 Ap与缺血性损伤 以往的观点认为，组织器官发生缺血性损伤(如心肌梗塞、中风等)是由急性血流灌注障碍而导致细胞坏死引起。最近研究发现，缺血损伤的中心部位的细胞确实由于坏死而快速死亡，而位于中心部位外周的细胞则发生凋亡现象。体外试验表明心肌或神经元细胞缺氧可导致凋亡，推测心肌细胞或神经元细胞因缺血而死亡与细胞凋亡有关。体外试验也发现，凋亡抑制剂可控制缺血损伤部位的扩散。Gottlieb[19]等发现，兔缺血-再灌注心肌细胞出现DNA降解片段及核染色质浓缩现象，而正常或缺血但未再灌注的心肌细胞无此现象。提示心肌细胞凋亡是再灌注心肌损伤的特征之一，此现象可能与再灌注引起自由基和Ca2+内流增加有关。因此，当心肌梗塞等缺血性损伤发生时，一方面要实施恢复血流的再灌注，另一方面还要考虑到因细胞凋亡而造成的再灌注损伤，应考虑施加一种能改变心肌细胞凋亡阈值的药物，来防治再灌注损伤。
总之，对细胞凋亡现象及本质的不断深入研究，将为某些疾病发病机制的探讨及寻找有效防治措施提供一条新的研究领域。
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(1998-09-05收稿), 百拇医药