链霉亲合素酶法检测T淋巴细胞亚群
作者：王赤林 王振明
单位：王赤林(长沙市中心血站输血研究室，长沙410001)；王振明(湖南医科大学附属第二医院中心实验室)
关键词：
链霉亲合素酶法检测T淋巴细胞亚群 用生物素-链霉亲合素-过氧化物酶(Biotin-Streptavidin-Peroxidase)法检测T淋巴细胞亚群，结果如下。
1 材料与方法
1.1 试剂 鼠抗人CD3、CD4、CD8单克隆抗体，生物素偶联兔抗鼠IgG，过氧化物酶标记链霉亲合素以及AEC底物等均购自美国Sigma公司。
1.2 细胞涂片制备 按常规方法用淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞，PBS(0.01 mol/L,pH 7.4)洗涤2次，取沉淀细胞在用95%乙醇擦洗干净的玻片上涂3个直径为5 mm左右的薄膜，使细胞单个分散，室温晾干后置于用95%乙醇稀释成1%的过氧化氢中固定1 min，PBS洗涤2次。
1.3 细胞免疫组化染色 擦干涂片圈外水份，分别加鼠抗人CD3、CD4、CD8单抗各1滴，置湿盒中37℃ 20 min，PBS(0.01 mol/L,pH 7.4，含0.05% Tween 20)洗涤4次。加生物素偶联兔抗鼠IgG 1滴，37℃ 20 min后洗涤。然后加酶标记链霉亲合素1滴，37℃ 20 min洗涤4次。
1.4 显色与复染 临用时配底物，1 ml蒸馏水中加相应底物各1滴，混匀后加1滴于细胞涂片，37℃ 5～15 min，低倍镜下观察细胞膜出现明显红色后用蒸馏水洗涤中止显色。加苏木素复染液1滴，复染5～10 s后用PBS(不含Tween 20)洗净。高倍镜下计数200个单个核细胞中阳性T淋巴细胞的百分比。
2 结果
整个细胞表面染成鲜红色，胞核被掩盖者为强阳性细胞，细胞周边胞膜染成红色而胞核呈淡蓝色者为阳性细胞。整个细胞呈淡蓝色者为阴性细胞。测定了20名18～55岁正常男女T淋巴细胞亚群水平，其结果(
±s)是，CD3为70.9±5.5%，CD4为41.3±5.6%，CD8为26.4±4.6%，CD4/CD8=1.56±0.12，该结果与免疫荧光法参考值相似。
3 讨论
为获得理想的结果，应注意单个核细胞分离后需用PBS洗涤2次，玻片须干净、脱脂，细胞涂片不宜太厚，涂片须置湿盒中，37℃时切勿使所加试剂蒸干。严格掌握复染时间。高倍镜观结果时加1滴PBS使染色片湿润，观察效果更佳。偶有粒细胞及单核细胞可呈假阳性，但其细胞较大，核的形态与淋巴细胞不同，核染成淡红色而胞膜呈淡蓝色，易区分。
(1998-03-09收稿，1998-07-28修回), http://www.100md.com
单位：王赤林(长沙市中心血站输血研究室，长沙410001)；王振明(湖南医科大学附属第二医院中心实验室)
关键词：
链霉亲合素酶法检测T淋巴细胞亚群 用生物素-链霉亲合素-过氧化物酶(Biotin-Streptavidin-Peroxidase)法检测T淋巴细胞亚群，结果如下。
1 材料与方法
1.1 试剂 鼠抗人CD3、CD4、CD8单克隆抗体，生物素偶联兔抗鼠IgG，过氧化物酶标记链霉亲合素以及AEC底物等均购自美国Sigma公司。
1.2 细胞涂片制备 按常规方法用淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞，PBS(0.01 mol/L,pH 7.4)洗涤2次，取沉淀细胞在用95%乙醇擦洗干净的玻片上涂3个直径为5 mm左右的薄膜，使细胞单个分散，室温晾干后置于用95%乙醇稀释成1%的过氧化氢中固定1 min，PBS洗涤2次。
1.3 细胞免疫组化染色 擦干涂片圈外水份，分别加鼠抗人CD3、CD4、CD8单抗各1滴，置湿盒中37℃ 20 min，PBS(0.01 mol/L,pH 7.4，含0.05% Tween 20)洗涤4次。加生物素偶联兔抗鼠IgG 1滴，37℃ 20 min后洗涤。然后加酶标记链霉亲合素1滴，37℃ 20 min洗涤4次。
1.4 显色与复染 临用时配底物，1 ml蒸馏水中加相应底物各1滴，混匀后加1滴于细胞涂片，37℃ 5～15 min，低倍镜下观察细胞膜出现明显红色后用蒸馏水洗涤中止显色。加苏木素复染液1滴，复染5～10 s后用PBS(不含Tween 20)洗净。高倍镜下计数200个单个核细胞中阳性T淋巴细胞的百分比。
2 结果
整个细胞表面染成鲜红色，胞核被掩盖者为强阳性细胞，细胞周边胞膜染成红色而胞核呈淡蓝色者为阳性细胞。整个细胞呈淡蓝色者为阴性细胞。测定了20名18～55岁正常男女T淋巴细胞亚群水平，其结果(
±s)是，CD3为70.9±5.5%，CD4为41.3±5.6%，CD8为26.4±4.6%，CD4/CD8=1.56±0.12，该结果与免疫荧光法参考值相似。3 讨论
为获得理想的结果，应注意单个核细胞分离后需用PBS洗涤2次，玻片须干净、脱脂，细胞涂片不宜太厚，涂片须置湿盒中，37℃时切勿使所加试剂蒸干。严格掌握复染时间。高倍镜观结果时加1滴PBS使染色片湿润，观察效果更佳。偶有粒细胞及单核细胞可呈假阳性，但其细胞较大，核的形态与淋巴细胞不同，核染成淡红色而胞膜呈淡蓝色，易区分。
(1998-03-09收稿，1998-07-28修回), http://www.100md.com