PCR-微孔板反向杂交法检测HBV DNA
作者：钱雷 王惠民 陈德训 施健*
单位：滨海县人民医院检验科，江苏滨海224500
关键词：HBV DNA；聚合酶链反应；微孔板；杂交
临床检验杂志990109 摘要 用PCR-微孔板反向杂交法检测HBV DNA，通过固定于板上的捕获探针与5′端带有生物素的PCR扩增产物杂交后，加入酶标亲合素通过酶联反应显色。本法检测敏感度明显高于电泳法，检测时间约是Keller法的1/10。
PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测只能确定产物的大小，不能确定扩增产物的特异性，而点杂交和Southern杂交法时间长，技术难度大[1、2]。我们用微孔板反向杂交检测扩增产物方法，取得了满意效果。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料
1.1.1 引物 在HBV前C及C区设计引物，正反向引物顺序分别为5′biotin-TTGCCTTCT GACTTCTTTCC与5′biotin-CGAGGGAGTTCT TCTTCTAG，由中科院上海细胞所合成，产物437 bp。捕获探针序列为5′AGACCACCAAATGCCCC TATC，由上海浩源公司合成。
1.1.2 PCR扩增反应液 终浓度为1×Buffer，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，0.01 g/dl明胶，引物浓度各0.32 μmol/L。25 μl反应液中含1 U Taq DNA聚合酶(华美公司)。
1.1.3 杂交液 称取25 mg聚蔗糖400，25 mg牛血清蛋白，25 mg聚乙烯吡咯啉酮，6.25 mg牛DNA，加入0.5 mol/L HCl 18.75 ml，NaCl 5.47 g，Na3C6H5O7.2H2O 2.75 g，加水至100 ml。
, 百拇医药
1.1.4 辣根过氧化物酶标亲合素 华美公司产品，用pH 7.4 PBS 1∶150稀释成酶应用液。
1.1.5 显色液 pH 5.0磷酸-柠檬酸缓冲液9.9 ml，加入10 g/L TMB 0.1 ml和30%H2O2 10 μl。
1.1.6 杂交微孔板由上海浩源公司提供。
1.1.7 仪器 GeneAmp 9600型扩增仪，美国Perkin Elmer公司。
1.1.8 样品来源 全部样品均来自本院门诊及住院病人。
1.2 方法
1.2.1 模板制备及PCR扩增 120 mmol/L脂肪酸钠水溶液20 μl加入待检血清40 μl，99℃ 15 min，12 000 r/min离心15 min，吸取上清液5 μl加入20 μl PCR反应液中，于PCR扩增仪94℃ 2 min后，94℃ 40 s、55℃ 40 s、72℃ 55 s，35次循环，72℃延伸5 min。
, 百拇医药
1.2.2 预杂交 取捕获探针液和等量0.25 mol/L NaOH混匀，杂交微孔板每孔内加入25 μl上述混合液和100 μl杂交液，混匀后37℃ 40 min，弃去预杂交反应液，倒置于干净吸水纸上使干。
1.2.3 杂交反应 每个PCR反应管中加入25 μl 0.25 mol/L NaOH与扩增产物混匀，取25 μl加入经预杂交的微孔板内，再加入100 μl杂交液，37℃ 50 min，用pH 7.4 PBS洗涤3次，拍干。
1.2.4 显色 在每孔内加入酶应用液100 μl，37℃ 15 min，pH 7.4 PBS洗涤3次，拍干，加入显色液100 μl，37℃ 10 min，再加入终止液(2 mol/L H2SO4)100 μl，于酶标仪450 nm比色。
1.2.5 结果判断 先用空白孔校零点，然后读取各孔吸光度值。样品A值/阴性对照平均A值≥2.1判断为阳性，否则为阴性。阴性对照平均A值<0.05时以0.05计算。
, 百拇医药
2 结果
2.1 取1份已知病毒拷贝数据的阳性血清用正常血清作系列稀释，扩增产物同时作微孔板反向杂交法和琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色法检测，结果见表1。
表1 PCR-微孔板反向杂交法检测灵敏度 血清稀释倍数
病毒拷贝数
杂交法
450 nm处吸光度
溴化乙锭法
未稀释
2×105
1.45
, http://www.100md.com
4+
101
2×104
1.41
3+
102
2×103
1.31
2+
103
2×102
, http://www.100md.com 1.28
+
104
20
0.47
-
105
2
0.24
-
106
0
0.04
, 百拇医药
-
阴性血清
0
0.04
-
2.2 为了检测本方法的重复性，取3份阳性血清病毒浓度分别为5×106颗粒/ml、5×104颗粒/ml、5×102颗粒/ml，重复检测20次，CV值分别为8.5%、4.3%、6.2%。
2.3 180例临床样品用PCR-溴化乙锭法和PCR-微孔板分别检测，结果有60例两种方法均阳性，有6例微孔板法阳性而溴化乙锭染色阴性，对此6例患者进行血清学检查均为HBsAg阳性，临床亦表现有HBV慢性感染症状。
3 讨论
, http://www.100md.com
PCR-微孔板反向杂交法检测HBV DNA，微孔板包被有与BSA相连的寡核苷酸，预杂交使捕获探针与板相连，然后加入变性后的PCR扩增产物与捕获探针杂交，洗板后用酶标亲合素与扩增产物5′端标记的生物素反应，最后加入底物显色。
用PCR-微孔板反向杂交法检测HBV DNA有极高的敏感度，与Keller等[3]报道的Sandwich杂交法相当，但方法更为简易，检测时间约为Keller法的1/10，敏感度明显高于电泳法。
值得注意的是PCR-微孔板反向杂交法检测HBV DNA时仍需注意防污染，微孔板杂交法可确定扩增产物的特异性但并不能解决样品间污染导致假阳性问题。由于微孔板杂交法检测敏感度高，含5×106病毒颗粒/ml的血清扩增产物用双蒸水1∶1000稀释用微孔板法检测仍为阳性，故应绝对分区操作，戴一次性手套。微孔板检测注意事项类似ELISA，洗板液和杂交液应收集并酸化处理。
, 百拇医药
*南通医学院附属医院
参考文献
1 Gupta B P,et al.Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification.J Clin Microbiol，1992，30：1913
2 Kanake S,et al.Detection of hepatitis B virus DNA in serum of patients with chronic hepatitis using the polymerase chain reaction assay.Pro Natl Acad Sci USA，1989，86：312
3 Keller G H,et al.Detection of hepatitis B virus DNA in serum by the polymerase chain reaction amplification and microtiter sandwich hybridization.J Clin Microbiol，1990，28：1411
(1998-01-19收稿，1998-07-16修回), http://www.100md.com(钱雷 王惠民 陈德训 施健*)
单位：滨海县人民医院检验科，江苏滨海224500
关键词：HBV DNA；聚合酶链反应；微孔板；杂交
临床检验杂志990109 摘要 用PCR-微孔板反向杂交法检测HBV DNA，通过固定于板上的捕获探针与5′端带有生物素的PCR扩增产物杂交后，加入酶标亲合素通过酶联反应显色。本法检测敏感度明显高于电泳法，检测时间约是Keller法的1/10。
PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测只能确定产物的大小，不能确定扩增产物的特异性，而点杂交和Southern杂交法时间长，技术难度大[1、2]。我们用微孔板反向杂交检测扩增产物方法，取得了满意效果。
1 材料和方法
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1.1 材料
1.1.1 引物 在HBV前C及C区设计引物，正反向引物顺序分别为5′biotin-TTGCCTTCT GACTTCTTTCC与5′biotin-CGAGGGAGTTCT TCTTCTAG，由中科院上海细胞所合成，产物437 bp。捕获探针序列为5′AGACCACCAAATGCCCC TATC，由上海浩源公司合成。
1.1.2 PCR扩增反应液 终浓度为1×Buffer，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，0.01 g/dl明胶，引物浓度各0.32 μmol/L。25 μl反应液中含1 U Taq DNA聚合酶(华美公司)。
1.1.3 杂交液 称取25 mg聚蔗糖400，25 mg牛血清蛋白，25 mg聚乙烯吡咯啉酮，6.25 mg牛DNA，加入0.5 mol/L HCl 18.75 ml，NaCl 5.47 g，Na3C6H5O7.2H2O 2.75 g，加水至100 ml。
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1.1.4 辣根过氧化物酶标亲合素 华美公司产品，用pH 7.4 PBS 1∶150稀释成酶应用液。
1.1.5 显色液 pH 5.0磷酸-柠檬酸缓冲液9.9 ml，加入10 g/L TMB 0.1 ml和30%H2O2 10 μl。
1.1.6 杂交微孔板由上海浩源公司提供。
1.1.7 仪器 GeneAmp 9600型扩增仪，美国Perkin Elmer公司。
1.1.8 样品来源 全部样品均来自本院门诊及住院病人。
1.2 方法
1.2.1 模板制备及PCR扩增 120 mmol/L脂肪酸钠水溶液20 μl加入待检血清40 μl，99℃ 15 min，12 000 r/min离心15 min，吸取上清液5 μl加入20 μl PCR反应液中，于PCR扩增仪94℃ 2 min后，94℃ 40 s、55℃ 40 s、72℃ 55 s，35次循环，72℃延伸5 min。
, 百拇医药
1.2.2 预杂交 取捕获探针液和等量0.25 mol/L NaOH混匀，杂交微孔板每孔内加入25 μl上述混合液和100 μl杂交液，混匀后37℃ 40 min，弃去预杂交反应液，倒置于干净吸水纸上使干。
1.2.3 杂交反应 每个PCR反应管中加入25 μl 0.25 mol/L NaOH与扩增产物混匀，取25 μl加入经预杂交的微孔板内，再加入100 μl杂交液，37℃ 50 min，用pH 7.4 PBS洗涤3次，拍干。
1.2.4 显色 在每孔内加入酶应用液100 μl，37℃ 15 min，pH 7.4 PBS洗涤3次，拍干，加入显色液100 μl，37℃ 10 min，再加入终止液(2 mol/L H2SO4)100 μl，于酶标仪450 nm比色。
1.2.5 结果判断 先用空白孔校零点，然后读取各孔吸光度值。样品A值/阴性对照平均A值≥2.1判断为阳性，否则为阴性。阴性对照平均A值<0.05时以0.05计算。
, 百拇医药
2 结果
2.1 取1份已知病毒拷贝数据的阳性血清用正常血清作系列稀释，扩增产物同时作微孔板反向杂交法和琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色法检测，结果见表1。
表1 PCR-微孔板反向杂交法检测灵敏度 血清稀释倍数
病毒拷贝数
杂交法
450 nm处吸光度
溴化乙锭法
未稀释
2×105
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2.2 为了检测本方法的重复性，取3份阳性血清病毒浓度分别为5×106颗粒/ml、5×104颗粒/ml、5×102颗粒/ml，重复检测20次，CV值分别为8.5%、4.3%、6.2%。
2.3 180例临床样品用PCR-溴化乙锭法和PCR-微孔板分别检测，结果有60例两种方法均阳性，有6例微孔板法阳性而溴化乙锭染色阴性，对此6例患者进行血清学检查均为HBsAg阳性，临床亦表现有HBV慢性感染症状。
3 讨论
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PCR-微孔板反向杂交法检测HBV DNA，微孔板包被有与BSA相连的寡核苷酸，预杂交使捕获探针与板相连，然后加入变性后的PCR扩增产物与捕获探针杂交，洗板后用酶标亲合素与扩增产物5′端标记的生物素反应，最后加入底物显色。
用PCR-微孔板反向杂交法检测HBV DNA有极高的敏感度，与Keller等[3]报道的Sandwich杂交法相当，但方法更为简易，检测时间约为Keller法的1/10，敏感度明显高于电泳法。
值得注意的是PCR-微孔板反向杂交法检测HBV DNA时仍需注意防污染，微孔板杂交法可确定扩增产物的特异性但并不能解决样品间污染导致假阳性问题。由于微孔板杂交法检测敏感度高，含5×106病毒颗粒/ml的血清扩增产物用双蒸水1∶1000稀释用微孔板法检测仍为阳性，故应绝对分区操作，戴一次性手套。微孔板检测注意事项类似ELISA，洗板液和杂交液应收集并酸化处理。
, 百拇医药
*南通医学院附属医院
参考文献
1 Gupta B P,et al.Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification.J Clin Microbiol，1992，30：1913
2 Kanake S,et al.Detection of hepatitis B virus DNA in serum of patients with chronic hepatitis using the polymerase chain reaction assay.Pro Natl Acad Sci USA，1989，86：312
3 Keller G H,et al.Detection of hepatitis B virus DNA in serum by the polymerase chain reaction amplification and microtiter sandwich hybridization.J Clin Microbiol，1990，28：1411
(1998-01-19收稿，1998-07-16修回), http://www.100md.com(钱雷 王惠民 陈德训 施健*)