粘虫核型多角体病毒凋亡抑制基因的定位、序列和启动子结构
作者：彭艳华 杨复华 齐义鹏 黄永秀
单位：武汉大学病毒研究所，武汉 430072
关键词：杆状病毒；凋亡抑制基因；基因定位；Southern 印迹；序列分析；启动子结构
中国病毒学990112 摘 要 以AcNPV凋亡抑制基因p35为探针，与LsNPV DNA的限制性片段和LsNPV DNA EcoRV片段杂交，发现EcoRV 5.5kb片段有强烈的杂交信号。将此片段亚克隆后，测定了1244bp序列，发现一个完整的ORF，推导的302个氨基酸与AcNPV p 35蛋白有70.4%的氨基酸同源性，证明所测ORF为LsNPV的p 35基因。结构分析发现其5′端有早期基因启动子元件GC、ACGT和TATA box。有22 bp的顺向重复序列，包括由两个重叠的TATA box和上下游两个ACGT motif组成的两套启动子元件，这些结构特征与AcNPV的凋亡抑制基因十分相似。
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Location, Sequence and Promoter Structure of Apoptosis-Inhibiting Gene of Leucania seperate Nuclear Polyhedrosis Virus
Peng Yanhua Yang Fuhua Qi Yipeng Huang Yongxin
(Institute of Virology, Wuhan University, Wuhan 430072)
Abstract LsNPV DNA restriction fragments were hybridized with p 35 gene fragment of AcNPV. The 5.5 kb fragment of LsNPV was cleaved by single and double degestion and its physical map was constructed. After subcloning and sequencing, a intact ORF that is 906 bp in length, deduced amino acids are 302 in number was found. There are GC, ACGT motif and TATA box which are specific sequence of promoter of baculoviruses early gene. This ORF of LsNPV was compared with p 35 gene of AcNPV, and 80.4% nucleotide sequence homology and 70.4% amino acid sequence homology were found between two genes. Furthermore, in its promoter region there is 22 bp forward repeat, including 2 sets of promoter units, each is composed of 2 overlapping TATA box and 2 sets of ACGT motif in the upstream and the downstream of TATA box.
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Key words Baculovirus, Apoptosis-inhibiting gene, Location of gene, Southorn blot, Sequence analysis, Structure of promoter
细胞凋亡(Apoptosis)又称细胞程序性死亡(Programmed cell death)，是细胞受内外剌激后由基因调控的自杀过程，它是维持机体稳态的主要机制之一。无论是病理状态还是正常生理状态下的细胞凋亡的研究都有重要理论和现实意义[1]，特别是对AIDS病及癌症的治疗，延缓机体衰老可能带来重大突破[2]。目前，在杆状病毒、腺病毒、疱疹病毒和逆转录病毒等病毒中都发现了与细胞凋亡相关的基因[1～4]。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的细胞凋亡抑制基因p35[4]不仅可抑制寄主细胞、幼虫、蛹和成虫的细胞凋亡，而且对人神经细胞的凋亡有同样的抑制作用，并且可能还与病毒的寄主范围和DNA复制有关。很有可能在生命进化的历史长河中，从病毒、线虫，到昆虫、植物、动物以至人的细胞凋亡机制都是高度保守的[1]。虽然对AcNPVp35基因研究比较深入，但仍存在不少问题，如p35基因作用的靶细胞、细胞的信号传递、基因的转录控制、调控过程中的调节因子、其它杆状病毒是否存在与AcNPVp 35的同功同源基因、p 35基因的多功能与细胞凋亡抑制功能的关系等。因此，以中国特有的一种杆状病毒粘虫核型多角体病毒(LsNPV)为材料，寻找与AcNPVp35同源的基因，探索其与寄主细胞凋亡、病毒复制、寄主范围的关系具有重要的意义。
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1 材料与方法
1.1 材料
LsNPV和E.coli TG1为本室保存，AcNPVp35基因载体由美国Georgia大学Miller教授赠送；限制性内切酶、随机引物标记试剂盒、银染测序试剂盒为Promega或华美公司产品；32pdCTP从中国科学院华瑞公司购买。
1.2 方法
碱法小量提取质粒DNA，按Summers[5]程序提取病毒粒子DNA，用低融点琼脂糖回收DNA片段，随机引物法制备放射性DNA探针，按《分子克隆实验手册》所述方法[6]进行DNA克隆转化、原位杂交和Southetn blot。按银染测序试剂盒说明书用ddNTP/PCR/银染色测序，并用DNAsis和PROsis软件分析所测序列的同源性、启动子结构和氨基酸组成等。
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2 实验结果
2.1 LsNPV DNA的限制性消化和p 35基因的Southern杂交定位
LsNPV DNA经EcoRV、EcoRI、Xhol和HindⅢ分别完全消化(图1a)。EcoRI酶切得到20个片段，分别为： 20.1、18.5、15.0、12.6、10.2、10.2、8.9、8.1、7.5、7.5、7.0、6.7、6.4、5.8、5.4、5.0、4.8、4.1、3.8、3.1kb，共计153.5kb。EcoRV酶切得到19个片段，分别为：21.7、16.9、14.85、12.6、10.2、9.1、8.4、8.4、7.6、7.3、6.5、5.5、5.5、4.8、4.3、4.3、3.6、3.2、2.6kb,共计157.0kb。Xhol酶切得到21个片段，分别为： 16.4、14.3、12.2、11.2、8.8、8.5、7.85、7.3、7.3、6.7、6.7、6.4、5.8、5.58、5.5、4.98、4.3、3.8、3.5、3.2、2.1kb,共计153.21kb。HindⅢ酶切得到16个片段，分别是：22.1、18.2、17.1、15.1、12.1、11.1、8.5、8.5、7.3、7.2、7.0、5.7、5.3、5.0、4.8、3.5，共计158.7kb。转膜后与AcNPVp 35基因探针杂交，结果如图1b，可见AcNPVp 35基因探针与LsNPV DNA的4种限制性内切酶切的某些片段产生较强的杂交信号，它们分别是： EcoRV-5.5kb,EcoRI-5.0和3.8kb，XhoI-3.5和2.1kb,HindⅢ-3.5和5.0kb。
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图1 LsNPV DNA的限制性消化及Southern blot
Fig.1 Restriction digestion of LsNPV DNA and Southern hybridization
1. λDNA/HindⅢ； 2. EcoRV; 3. EcoRI; 4. HindⅢ； 5. Xhol
2.2 LsNPV DNA限制性片段的随机克隆和p 35基因的原位杂交定位
为了确证Southern blot结果，我们将LsNPV DNA的EcoRV单酶切混合产物19个片段，分别插入pBluescript DNA的同一位点，获得随机克隆片段文库。将随机克隆的重组菌落与AcNPVp35基因探针进行两轮原位杂交，随机挑选有杂交信号的菌落16个，提取质粒DNA并电泳，发现其大小一致，约8.5kb，根据Southern结果，估计其中应含有EcoRV的5.5kb,将此阳性重组质粒命名为pLsEv5.5。
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2.3 重组质粒的鉴定和插入片段的物理图谱
阳性质组质粒pLsEV5.5 DNA经EcoRV酶切释放一条5.5kb插入片段与一条2.96kb载体片段，转膜后再用AcNPVp 35基因探针进行Southern blot，结果在5.5kb位置有强烈杂交信号(照片省
略)，获得了与第一次Southern杂交和原位杂交相同的结果。因此，我们认为重组质粒pLsEv5.5中的插入片段可能含有与AcNPVp 35同源的基因。回收5.5kb片段，用不同的限制性内切酶单、双酶消化，发现EcoRI、Xhol、HindⅢ、BglⅡ和HincⅡ等5种酶在此片段上仅有一个切点，SalI有5个切点，结果见图2和表1。
图2 阳性重组质粒pLsEv5.5 DNA的酶切图谱 a.单酶切b.双酶切
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Fig.2a A single digestion of 5.5 kb positive clone fragment with endonuclease
1.Sall;2.EcoR1;3.Xhol.4.λDNA by HindⅢ;5.HindⅢ;6.BglⅡ;7.HincⅡ.
Fig.2b Double digestion of 5.5 kb positive clone fragment with endonuclease
1.Xhol+BglⅡ;2.Xhol+Sall;3.HindⅢ+Xhol;4.λDNA by HindⅢ;
5.EcoRI+Sall;6.BglⅡ+Sall;7.HindⅢ+EcoRI;8.HincⅡ+BgⅡ.
表1 pLsEv5.5中插入片段的单酶和双酶消化结果
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Table 1 Single and double digestion of 5.5 kb insert fragment in pLsEv5.5 单酶消化
Single digestion
片段数
Number of fragments
片段大小(kb)
Sizes of frangments (kb)
双酶消化
Double digestion
片段数
Number of fragments
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片段大小(kb)
Sizes of frangments (kb)
EcoRI
2
2.0，3.5
Xhol-BglⅡ
3
0.6，0.6，4.3
XhoI
2
0.6，4.9
HindⅢ-XhoI
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3
0.6，0.65，4.25
HindⅢ
2
1.25，4.25
HindⅢ-EcoRI
3
0.75，1.25，3.5
BglⅡ
2
0.6，4.9
BglⅡ-SalI
, 百拇医药
7
0.2，0.6，0.7，0.71，0.72，0.76，1.8
SalI
6
0.2，0.71，0.72
0.76，1.3，1.8
XhoI-SalI
7
0.2，0.4，0.71，0.72，0.76，1.2，1.3
HincⅡ
2
, 百拇医药 2.1，3.4
EcoRI-SalI
7
0.2，0.2，0.51，0.72，0.76，1.3，1.8
HincⅡ-BglⅡ
3
0.6，1.5，3.4
根据上述结果，按文献[7]提出的双酶消化法构建DNA物理图谱的三三规则构建了此5.5 kb片段的物理图谱(图3)。
图3 pLsEv5.5中的5.5 kb插入片段的物理图谱和亚克隆战略
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Fig.3 The physical map and subcloning of 5.5 kb insert fragment in pLsEv5.5
EI：EcoRI; X:Xhol; Hd:HindⅢ
2.4 LsNPVp 35基因序列和推导的氨基酸序列
AcNPVp35基因长1.25kb，因此估计在LsNPV EcoRV 5.5kb片段中p35基因仅占约1/5。为了测定p35基因序列并推导其氨基酸序列，我们采用随机散弹法并根据dot blot杂交结果，测定了Xhol-HindⅢ和HindⅢ-EcoRI两个亚片段共1244bp序列(图4)。用DNAsis和PROsis软件分析，发现了一个完整的ORF，从5′端198bp的ATG起始到终止密码TAA的T止共906bp,编码302个氨基酸。终止密码区有两个poly A加尾信号AATAAA。此ORF与AcNPVp35基因的核苷酸同源性为80.4%，氨基酸同源性为70.4%，证明所测序列为LsNPV的p35基因。
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图4 LsNPVp 35基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列及与AcNPVp35基因的比较
Fig.4 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the LsNPV c35 gene p35 gene is shown below the nucleotide sequence of LsNPV p35 gene. Two dots indicate an identical nucleotide, and the deduced amino acid sequence of LsNPV p35 are shown above the corresponding nucleotide sequence. The stop codon of the LsNPVp35 gene and the poly A signal sequence AATAAA are underlined.
2.5 LsNPVp 35基因启动子的结构分析
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经计算机用DNAsis软件分析发现，LsNPVp35基因与AcNPVp35基因启动子结构十分相似，几乎在同一位置发现有两个TATA box，其上游有两个ACGT motif,再上游有两个GCmotif,这是杆状病毒早期基因的典型启动子结构。AcNPVp35和LsNPVp35基因启动子区37bp中仅有3个核苷酸不同，将它们在此区域的特征序列比较如下：
LsNPV:-132 GCGCG/GCGCG/ACGT/ACGT-GA-GCGT/T-T-TATATTATAAAT/70
AcNPV:-132 GCGCG/GCGCG/ACGT/ACGT-GA-ACGT/T-T-TATATTATTATA/70
另外，LsNPVp 35基因有两个从ACGT起始紧密相连的22 bp顺向重复序列，每个重复序列中在ACGT之后是两个重叠的TATA box。因此，p 35基因包括两套启动子单元，似乎这一基因的典型早期启动子结构是双拷贝的，而每份拷贝又各具有两个重叠的TATA box和上下游两个ACGT motif,即：
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-88
有趣的是AcNPVp 35基因的5′端也有非常相似的22bp顺向重复结构。
3 讨论
为准确定位LsNPV的p35基因，我们用AcNPVp35基因探针进行了Southern blot和二轮Dot blot杂交，所选阳性克隆再经Southern blot杂交，证明LsNPV EcoRV5.5kb片段含有AcNPVp35基因的同源序列。物理图谱的构建为此片段的亚克隆提供了前提。序列分析证实，该片段上含有一完整的开放阅读框架，它与AcNPVp35基因核苷酸同源性为80.4%，推导的氨基酸同源性为70.4%，结果提示此ORF为LsNPV的p35基因。到目前为止，已经报道的杆状病毒凋亡抑制基因有AcNPV[1]和BmNPV[4]的p35基因，黄杉毒刺蛾核型多角体病毒(OpNPV)[8]和苹果卷叶蛾颗粒体病毒(CpGV)[9]的iap基因。我们的研究结果表明LsNPV中存在与AcNPVp35基因同源的基因，它具有杆状病毒早期基因的特征性转录起始元件ACGT，即具有典型的早期基因启动子特征。根据王家旺等报道[10]，ACGT和CAGT都是早期基因启动子的组成元件，但ACGT在TATA box上游，CAGT在TATA box下游，本文报道的p35基因符合这一特征。LsNPVp35基因启动子区的22 bp顺向重复序列中的两套启动子元件是很有特色的结构，很可能这一特征性结构保证了p35基因的强转录和多点起始。这种特征性结构除AcNPV和LsNPVp35基因外，在其他基因中极为少见，因此，它可能与特异性的凋亡抑制有关。本工作为下步LsNPVp35基因的功能研究奠定了基础。
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* 国家自然科学基金资助项目
** 联系作者
参考文献
[1] Roy N, Mahadevan M S, Mclean M et al. The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is partially deleted in individuals with spinal muscular atrophy. Cell, 1995,80:167～178
[2] Clem R J, Robson M, Miller L K. Influenec of infection route on the infectivity of baculovirns mutants lacking the apoptosis-inhibiting gene p 35 and adjacent gene p94. J Virol, 1994,68(10):6759～6772
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[3] Clem R J, Fechheimer M, Miller L K. Prevention of apoptosis by a baculovirus gene during infection of insect cells. Science, 1991, 254:1388～1390
[4] Kimita S G, Mijima K, Maeda S. Identification and characterization of p 35 gene of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus that prevents virus-induced apoptosis. J Virol, 1993,67(1)455～463
[5] Summers M D, Smith G E. A manual of methods for baculovirus vactors and insect cell culture procedures. Texas Agric. Exp Stn Bwll. 1987,33～35
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[6] 萨姆布鲁克J，费里奇E F，曼尼柯蒂斯 T. 分子克隆实验指南. 第2版. 北京： 科学出版社，1993
[7] 齐义鹏，黄永秀. 大尺蠖核型多角体病毒DNA的限制性消化和物理图谱. 病毒学报，1987，3(3)264～269
[8] Noteborn M H M, Todd D, Verschueren C A J et al. A single chicken anemia virus protein induces apoptosis. J Virol, 1994,68(1):346～351
[9] Birnbaum M J, Clem R J, Miller L K. An apoptosis-inhibiting gene from a nuclear polyhedrosis virus encoding a polypetide with Cys/His sequence motifs. J Virol, 1994,68(4):2521～2528
[10] 王家旺，齐义鹏，黄永秀等. 杆状病毒早期基因的结构与功能. 病毒学报，1995，11(3)： 285～287
收稿日期1998-03-02修回日期：1998-08-24, 百拇医药
单位：武汉大学病毒研究所，武汉 430072
关键词：杆状病毒；凋亡抑制基因；基因定位；Southern 印迹；序列分析；启动子结构
中国病毒学990112 摘 要 以AcNPV凋亡抑制基因p35为探针，与LsNPV DNA的限制性片段和LsNPV DNA EcoRV片段杂交，发现EcoRV 5.5kb片段有强烈的杂交信号。将此片段亚克隆后，测定了1244bp序列，发现一个完整的ORF，推导的302个氨基酸与AcNPV p 35蛋白有70.4%的氨基酸同源性，证明所测ORF为LsNPV的p 35基因。结构分析发现其5′端有早期基因启动子元件GC、ACGT和TATA box。有22 bp的顺向重复序列，包括由两个重叠的TATA box和上下游两个ACGT motif组成的两套启动子元件，这些结构特征与AcNPV的凋亡抑制基因十分相似。
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Location, Sequence and Promoter Structure of Apoptosis-Inhibiting Gene of Leucania seperate Nuclear Polyhedrosis Virus
Peng Yanhua Yang Fuhua Qi Yipeng Huang Yongxin
(Institute of Virology, Wuhan University, Wuhan 430072)
Abstract LsNPV DNA restriction fragments were hybridized with p 35 gene fragment of AcNPV. The 5.5 kb fragment of LsNPV was cleaved by single and double degestion and its physical map was constructed. After subcloning and sequencing, a intact ORF that is 906 bp in length, deduced amino acids are 302 in number was found. There are GC, ACGT motif and TATA box which are specific sequence of promoter of baculoviruses early gene. This ORF of LsNPV was compared with p 35 gene of AcNPV, and 80.4% nucleotide sequence homology and 70.4% amino acid sequence homology were found between two genes. Furthermore, in its promoter region there is 22 bp forward repeat, including 2 sets of promoter units, each is composed of 2 overlapping TATA box and 2 sets of ACGT motif in the upstream and the downstream of TATA box.
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Key words Baculovirus, Apoptosis-inhibiting gene, Location of gene, Southorn blot, Sequence analysis, Structure of promoter
细胞凋亡(Apoptosis)又称细胞程序性死亡(Programmed cell death)，是细胞受内外剌激后由基因调控的自杀过程，它是维持机体稳态的主要机制之一。无论是病理状态还是正常生理状态下的细胞凋亡的研究都有重要理论和现实意义[1]，特别是对AIDS病及癌症的治疗，延缓机体衰老可能带来重大突破[2]。目前，在杆状病毒、腺病毒、疱疹病毒和逆转录病毒等病毒中都发现了与细胞凋亡相关的基因[1～4]。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的细胞凋亡抑制基因p35[4]不仅可抑制寄主细胞、幼虫、蛹和成虫的细胞凋亡，而且对人神经细胞的凋亡有同样的抑制作用，并且可能还与病毒的寄主范围和DNA复制有关。很有可能在生命进化的历史长河中，从病毒、线虫，到昆虫、植物、动物以至人的细胞凋亡机制都是高度保守的[1]。虽然对AcNPVp35基因研究比较深入，但仍存在不少问题，如p35基因作用的靶细胞、细胞的信号传递、基因的转录控制、调控过程中的调节因子、其它杆状病毒是否存在与AcNPVp 35的同功同源基因、p 35基因的多功能与细胞凋亡抑制功能的关系等。因此，以中国特有的一种杆状病毒粘虫核型多角体病毒(LsNPV)为材料，寻找与AcNPVp35同源的基因，探索其与寄主细胞凋亡、病毒复制、寄主范围的关系具有重要的意义。
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1 材料与方法
1.1 材料
LsNPV和E.coli TG1为本室保存，AcNPVp35基因载体由美国Georgia大学Miller教授赠送；限制性内切酶、随机引物标记试剂盒、银染测序试剂盒为Promega或华美公司产品；32pdCTP从中国科学院华瑞公司购买。
1.2 方法
碱法小量提取质粒DNA，按Summers[5]程序提取病毒粒子DNA，用低融点琼脂糖回收DNA片段，随机引物法制备放射性DNA探针，按《分子克隆实验手册》所述方法[6]进行DNA克隆转化、原位杂交和Southetn blot。按银染测序试剂盒说明书用ddNTP/PCR/银染色测序，并用DNAsis和PROsis软件分析所测序列的同源性、启动子结构和氨基酸组成等。
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2 实验结果
2.1 LsNPV DNA的限制性消化和p 35基因的Southern杂交定位
LsNPV DNA经EcoRV、EcoRI、Xhol和HindⅢ分别完全消化(图1a)。EcoRI酶切得到20个片段，分别为： 20.1、18.5、15.0、12.6、10.2、10.2、8.9、8.1、7.5、7.5、7.0、6.7、6.4、5.8、5.4、5.0、4.8、4.1、3.8、3.1kb，共计153.5kb。EcoRV酶切得到19个片段，分别为：21.7、16.9、14.85、12.6、10.2、9.1、8.4、8.4、7.6、7.3、6.5、5.5、5.5、4.8、4.3、4.3、3.6、3.2、2.6kb,共计157.0kb。Xhol酶切得到21个片段，分别为： 16.4、14.3、12.2、11.2、8.8、8.5、7.85、7.3、7.3、6.7、6.7、6.4、5.8、5.58、5.5、4.98、4.3、3.8、3.5、3.2、2.1kb,共计153.21kb。HindⅢ酶切得到16个片段，分别是：22.1、18.2、17.1、15.1、12.1、11.1、8.5、8.5、7.3、7.2、7.0、5.7、5.3、5.0、4.8、3.5，共计158.7kb。转膜后与AcNPVp 35基因探针杂交，结果如图1b，可见AcNPVp 35基因探针与LsNPV DNA的4种限制性内切酶切的某些片段产生较强的杂交信号，它们分别是： EcoRV-5.5kb,EcoRI-5.0和3.8kb，XhoI-3.5和2.1kb,HindⅢ-3.5和5.0kb。
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图1 LsNPV DNA的限制性消化及Southern blot
Fig.1 Restriction digestion of LsNPV DNA and Southern hybridization
1. λDNA/HindⅢ； 2. EcoRV; 3. EcoRI; 4. HindⅢ； 5. Xhol
2.2 LsNPV DNA限制性片段的随机克隆和p 35基因的原位杂交定位
为了确证Southern blot结果，我们将LsNPV DNA的EcoRV单酶切混合产物19个片段，分别插入pBluescript DNA的同一位点，获得随机克隆片段文库。将随机克隆的重组菌落与AcNPVp35基因探针进行两轮原位杂交，随机挑选有杂交信号的菌落16个，提取质粒DNA并电泳，发现其大小一致，约8.5kb，根据Southern结果，估计其中应含有EcoRV的5.5kb,将此阳性重组质粒命名为pLsEv5.5。
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2.3 重组质粒的鉴定和插入片段的物理图谱
阳性质组质粒pLsEV5.5 DNA经EcoRV酶切释放一条5.5kb插入片段与一条2.96kb载体片段，转膜后再用AcNPVp 35基因探针进行Southern blot，结果在5.5kb位置有强烈杂交信号(照片省
略)，获得了与第一次Southern杂交和原位杂交相同的结果。因此，我们认为重组质粒pLsEv5.5中的插入片段可能含有与AcNPVp 35同源的基因。回收5.5kb片段，用不同的限制性内切酶单、双酶消化，发现EcoRI、Xhol、HindⅢ、BglⅡ和HincⅡ等5种酶在此片段上仅有一个切点，SalI有5个切点，结果见图2和表1。
图2 阳性重组质粒pLsEv5.5 DNA的酶切图谱 a.单酶切b.双酶切
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Fig.2a A single digestion of 5.5 kb positive clone fragment with endonuclease
1.Sall;2.EcoR1;3.Xhol.4.λDNA by HindⅢ;5.HindⅢ;6.BglⅡ;7.HincⅡ.
Fig.2b Double digestion of 5.5 kb positive clone fragment with endonuclease
1.Xhol+BglⅡ;2.Xhol+Sall;3.HindⅢ+Xhol;4.λDNA by HindⅢ;
5.EcoRI+Sall;6.BglⅡ+Sall;7.HindⅢ+EcoRI;8.HincⅡ+BgⅡ.
表1 pLsEv5.5中插入片段的单酶和双酶消化结果
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Table 1 Single and double digestion of 5.5 kb insert fragment in pLsEv5.5 单酶消化
Single digestion
片段数
Number of fragments
片段大小(kb)
Sizes of frangments (kb)
双酶消化
Double digestion
片段数
Number of fragments
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片段大小(kb)
Sizes of frangments (kb)
EcoRI
2
2.0，3.5
Xhol-BglⅡ
3
0.6，0.6，4.3
XhoI
2
0.6，4.9
HindⅢ-XhoI
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3
0.6，0.65，4.25
HindⅢ
2
1.25，4.25
HindⅢ-EcoRI
3
0.75，1.25，3.5
BglⅡ
2
0.6，4.9
BglⅡ-SalI
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7
0.2，0.6，0.7，0.71，0.72，0.76，1.8
SalI
6
0.2，0.71，0.72
0.76，1.3，1.8
XhoI-SalI
7
0.2，0.4，0.71，0.72，0.76，1.2，1.3
HincⅡ
2
, 百拇医药 2.1，3.4
EcoRI-SalI
7
0.2，0.2，0.51，0.72，0.76，1.3，1.8
HincⅡ-BglⅡ
3
0.6，1.5，3.4
根据上述结果，按文献[7]提出的双酶消化法构建DNA物理图谱的三三规则构建了此5.5 kb片段的物理图谱(图3)。
图3 pLsEv5.5中的5.5 kb插入片段的物理图谱和亚克隆战略
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Fig.3 The physical map and subcloning of 5.5 kb insert fragment in pLsEv5.5
EI：EcoRI; X:Xhol; Hd:HindⅢ
2.4 LsNPVp 35基因序列和推导的氨基酸序列
AcNPVp35基因长1.25kb，因此估计在LsNPV EcoRV 5.5kb片段中p35基因仅占约1/5。为了测定p35基因序列并推导其氨基酸序列，我们采用随机散弹法并根据dot blot杂交结果，测定了Xhol-HindⅢ和HindⅢ-EcoRI两个亚片段共1244bp序列(图4)。用DNAsis和PROsis软件分析，发现了一个完整的ORF，从5′端198bp的ATG起始到终止密码TAA的T止共906bp,编码302个氨基酸。终止密码区有两个poly A加尾信号AATAAA。此ORF与AcNPVp35基因的核苷酸同源性为80.4%，氨基酸同源性为70.4%，证明所测序列为LsNPV的p35基因。
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图4 LsNPVp 35基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列及与AcNPVp35基因的比较
Fig.4 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the LsNPV c35 gene p35 gene is shown below the nucleotide sequence of LsNPV p35 gene. Two dots indicate an identical nucleotide, and the deduced amino acid sequence of LsNPV p35 are shown above the corresponding nucleotide sequence. The stop codon of the LsNPVp35 gene and the poly A signal sequence AATAAA are underlined.
2.5 LsNPVp 35基因启动子的结构分析
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经计算机用DNAsis软件分析发现，LsNPVp35基因与AcNPVp35基因启动子结构十分相似，几乎在同一位置发现有两个TATA box，其上游有两个ACGT motif,再上游有两个GCmotif,这是杆状病毒早期基因的典型启动子结构。AcNPVp35和LsNPVp35基因启动子区37bp中仅有3个核苷酸不同，将它们在此区域的特征序列比较如下：
LsNPV:-132 GCGCG/GCGCG/ACGT/ACGT-GA-GCGT/T-T-TATATTATAAAT/70
AcNPV:-132 GCGCG/GCGCG/ACGT/ACGT-GA-ACGT/T-T-TATATTATTATA/70
另外，LsNPVp 35基因有两个从ACGT起始紧密相连的22 bp顺向重复序列，每个重复序列中在ACGT之后是两个重叠的TATA box。因此，p 35基因包括两套启动子单元，似乎这一基因的典型早期启动子结构是双拷贝的，而每份拷贝又各具有两个重叠的TATA box和上下游两个ACGT motif,即：
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有趣的是AcNPVp 35基因的5′端也有非常相似的22bp顺向重复结构。
3 讨论
为准确定位LsNPV的p35基因，我们用AcNPVp35基因探针进行了Southern blot和二轮Dot blot杂交，所选阳性克隆再经Southern blot杂交，证明LsNPV EcoRV5.5kb片段含有AcNPVp35基因的同源序列。物理图谱的构建为此片段的亚克隆提供了前提。序列分析证实，该片段上含有一完整的开放阅读框架，它与AcNPVp35基因核苷酸同源性为80.4%，推导的氨基酸同源性为70.4%，结果提示此ORF为LsNPV的p35基因。到目前为止，已经报道的杆状病毒凋亡抑制基因有AcNPV[1]和BmNPV[4]的p35基因，黄杉毒刺蛾核型多角体病毒(OpNPV)[8]和苹果卷叶蛾颗粒体病毒(CpGV)[9]的iap基因。我们的研究结果表明LsNPV中存在与AcNPVp35基因同源的基因，它具有杆状病毒早期基因的特征性转录起始元件ACGT，即具有典型的早期基因启动子特征。根据王家旺等报道[10]，ACGT和CAGT都是早期基因启动子的组成元件，但ACGT在TATA box上游，CAGT在TATA box下游，本文报道的p35基因符合这一特征。LsNPVp35基因启动子区的22 bp顺向重复序列中的两套启动子元件是很有特色的结构，很可能这一特征性结构保证了p35基因的强转录和多点起始。这种特征性结构除AcNPV和LsNPVp35基因外，在其他基因中极为少见，因此，它可能与特异性的凋亡抑制有关。本工作为下步LsNPVp35基因的功能研究奠定了基础。
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* 国家自然科学基金资助项目
** 联系作者
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收稿日期1998-03-02修回日期：1998-08-24, 百拇医药