放射诱发肾癌细胞凋亡及Fas/Apo-1基因表达的改变
作者：王俊杰 董秀癑 申文江 俞莉章 李亚刚 汪春林
单位：100034 北京医科大学第一医院肿瘤治疗中心(王俊杰、申文江、李亚刚、汪春林)；泌尿外科研究所(俞莉章)；中国医学科学院协和医科大学肿瘤医院(董秀癑)
关键词：
中华放射肿瘤学杂志990121 凋亡(apoptosis)是一种细胞自主的死亡过程，凋亡对于维护组织器官的自身稳定具有重要的作用。高热、激素、血清和IL-2缺失，以及射线均可以诱发细胞凋亡。肾癌是临床上放射抗拒的肿瘤之一，关于射线是否能够诱发肾癌细胞凋亡，及其放射抗拒性的机制目前仍不十分清楚，为此我们研究10 MV-X线诱发肾癌细胞凋亡和肾癌细胞Fas/Apo-1基因表达的关系。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
, http://www.100md.com
肾颗粒细胞癌细胞系(GRC-1)由北京医科大学第一医院泌尿外科研究所提供，培养基为RPMI-1640，含15%小牛血清，37 ℃，5%CO2培养箱中培养。
流式细胞仪：FACSort(美国Becton Dickinson公司)。
细胞培养接近单层时，常规消化细胞制成单细胞悬液，分装在2 mL培养瓶中，分别接受不同剂量照射。
照射条件：10 MV-X线，剂量率3 Gy/min，加2 cm等效组织填充物，分别照射不同剂量后继续培养48小时，进行流式细胞仪检测和免疫细胞化学分析
1.2 脱氧核苷酰转移酶末端标记(TUNEL)流式细胞检测法：采用美国PharMingen公司试剂盒进行细胞凋亡分析。1×106细胞悬液用PBS缓冲液洗2次，加5%多聚甲醛固定15分钟，1 500 r/min离心10分钟，弃上清，PBS洗1次。加标记染液50 μL，37 ℃，60分钟，PBS洗1次，加碘化丙锭(PI)染液，避光30分钟。流式细胞仪检测，利用Cell Quest软件处理结果。每次实验均设阴性和阳性对照，实验重复2次。
, http://www.100md.com
相关癌基因表达强度的判断方法采用SPTM法：Fas/Apo-1基因表达阳性表现为细胞膜系统褐黄色染色，根据下列标准判断其表达强度：无膜系统染色阴性(-)；膜系统染色阳性(+)。随机选取5个高倍视野(×400)作为观察区，求5个视野内阳性细胞数的平均值。Fas/Apo-1基因在细胞膜系统标记指数(Labling Index,LI),根据以下公式计算：
实验重复2次。
2 结果
根据流式细胞分析，未照射组阳性细胞为1.02%；5，10和20 Gy照射组阳性细胞率分别为7.03%，4.22%和36.09%。
免疫组化分析GRC-1细胞Fas/Apo-1基因的变化：未照射组Fas/Apo-1基因表达的标记指数为19.2%；照射20 Gy组Fas/Apo-1基因表达标记指数31.8%。
, http://www.100md.com
3 讨论
我们利用10 MV-X线照射肾癌细胞研究发现5，10 Gy照射后细胞凋亡数量均低于10%，而20 Gy照射后凋亡数量明显增加，达36%。杨宝龙等利用相同细胞系经10 Gy照射后，琼脂糖凝胶电泳分析亦没有发现具细胞凋亡特征的DNA带(Ladder)。我们认为射线杀伤肾癌细胞可能是通过诱发细胞克隆源性死亡和凋亡2种机制来实现的，细胞凋亡相对细胞克隆源性死亡放射敏感性较低。如若提高临床肿瘤的局部控制率，应提高照射剂量以杀死相对不敏感的凋亡亚群，同时联合应用诱发肾癌细胞凋亡的化疗药物以期提高肾癌治疗的疗效。
Fas/Apo-1在免疫系统中调控细胞凋亡具有重要的作用，Fas/Apo-1是一种跨膜蛋白，又称Fas/Apo-1蛋白、Fas/Apo-1抗原和Fas/Apo-1受体，属于神经生长因子和肿瘤坏死因子受体超家族成员。Fas/Apo-1分子是细胞凋亡的信号受体，它与Fas/Apo-1抗体或配体(Fas Ligand,FasL)结合后，胞浆经过蛋白介导，激活细胞凋亡基因，诱发Fas/Apo-1分子所在细胞凋亡。Fas/Apo-1介导的细胞凋亡要求细胞膜上有一定强度Fas/Apo-1抗原的表达和细胞凋亡信号传导系统的各个环节结构完整。本研究结果提示20 Gy照射后，肾癌细胞Fas/Apo-1蛋白增加。但Fas/Apo-1蛋白表达增加是否可以影响其它细胞凋亡基因的表达进而诱发细胞凋亡及通过照射后肾癌Fas/Apo-1蛋白的增加能否配合生物治疗以提高肾癌综合治疗的疗效，需进一步深入研究。
(收稿：1998-03-13 修回：1998-06-24), http://www.100md.com
单位：100034 北京医科大学第一医院肿瘤治疗中心(王俊杰、申文江、李亚刚、汪春林)；泌尿外科研究所(俞莉章)；中国医学科学院协和医科大学肿瘤医院(董秀癑)
关键词：
中华放射肿瘤学杂志990121 凋亡(apoptosis)是一种细胞自主的死亡过程，凋亡对于维护组织器官的自身稳定具有重要的作用。高热、激素、血清和IL-2缺失，以及射线均可以诱发细胞凋亡。肾癌是临床上放射抗拒的肿瘤之一，关于射线是否能够诱发肾癌细胞凋亡，及其放射抗拒性的机制目前仍不十分清楚，为此我们研究10 MV-X线诱发肾癌细胞凋亡和肾癌细胞Fas/Apo-1基因表达的关系。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
, http://www.100md.com
肾颗粒细胞癌细胞系(GRC-1)由北京医科大学第一医院泌尿外科研究所提供，培养基为RPMI-1640，含15%小牛血清，37 ℃，5%CO2培养箱中培养。
流式细胞仪：FACSort(美国Becton Dickinson公司)。
细胞培养接近单层时，常规消化细胞制成单细胞悬液，分装在2 mL培养瓶中，分别接受不同剂量照射。
照射条件：10 MV-X线，剂量率3 Gy/min，加2 cm等效组织填充物，分别照射不同剂量后继续培养48小时，进行流式细胞仪检测和免疫细胞化学分析
1.2 脱氧核苷酰转移酶末端标记(TUNEL)流式细胞检测法：采用美国PharMingen公司试剂盒进行细胞凋亡分析。1×106细胞悬液用PBS缓冲液洗2次，加5%多聚甲醛固定15分钟，1 500 r/min离心10分钟，弃上清，PBS洗1次。加标记染液50 μL，37 ℃，60分钟，PBS洗1次，加碘化丙锭(PI)染液，避光30分钟。流式细胞仪检测，利用Cell Quest软件处理结果。每次实验均设阴性和阳性对照，实验重复2次。
, http://www.100md.com
相关癌基因表达强度的判断方法采用SPTM法：Fas/Apo-1基因表达阳性表现为细胞膜系统褐黄色染色，根据下列标准判断其表达强度：无膜系统染色阴性(-)；膜系统染色阳性(+)。随机选取5个高倍视野(×400)作为观察区，求5个视野内阳性细胞数的平均值。Fas/Apo-1基因在细胞膜系统标记指数(Labling Index,LI),根据以下公式计算：
实验重复2次。
2 结果
根据流式细胞分析，未照射组阳性细胞为1.02%；5，10和20 Gy照射组阳性细胞率分别为7.03%，4.22%和36.09%。
免疫组化分析GRC-1细胞Fas/Apo-1基因的变化：未照射组Fas/Apo-1基因表达的标记指数为19.2%；照射20 Gy组Fas/Apo-1基因表达标记指数31.8%。
, http://www.100md.com
3 讨论
我们利用10 MV-X线照射肾癌细胞研究发现5，10 Gy照射后细胞凋亡数量均低于10%，而20 Gy照射后凋亡数量明显增加，达36%。杨宝龙等利用相同细胞系经10 Gy照射后，琼脂糖凝胶电泳分析亦没有发现具细胞凋亡特征的DNA带(Ladder)。我们认为射线杀伤肾癌细胞可能是通过诱发细胞克隆源性死亡和凋亡2种机制来实现的，细胞凋亡相对细胞克隆源性死亡放射敏感性较低。如若提高临床肿瘤的局部控制率，应提高照射剂量以杀死相对不敏感的凋亡亚群，同时联合应用诱发肾癌细胞凋亡的化疗药物以期提高肾癌治疗的疗效。
Fas/Apo-1在免疫系统中调控细胞凋亡具有重要的作用，Fas/Apo-1是一种跨膜蛋白，又称Fas/Apo-1蛋白、Fas/Apo-1抗原和Fas/Apo-1受体，属于神经生长因子和肿瘤坏死因子受体超家族成员。Fas/Apo-1分子是细胞凋亡的信号受体，它与Fas/Apo-1抗体或配体(Fas Ligand,FasL)结合后，胞浆经过蛋白介导，激活细胞凋亡基因，诱发Fas/Apo-1分子所在细胞凋亡。Fas/Apo-1介导的细胞凋亡要求细胞膜上有一定强度Fas/Apo-1抗原的表达和细胞凋亡信号传导系统的各个环节结构完整。本研究结果提示20 Gy照射后，肾癌细胞Fas/Apo-1蛋白增加。但Fas/Apo-1蛋白表达增加是否可以影响其它细胞凋亡基因的表达进而诱发细胞凋亡及通过照射后肾癌Fas/Apo-1蛋白的增加能否配合生物治疗以提高肾癌综合治疗的疗效，需进一步深入研究。
(收稿：1998-03-13 修回：1998-06-24), http://www.100md.com