丙型肝炎患者外周血单个核细胞对特异性HCV抗原增殖反应
作者：窦骏 刘克洲 陈智 沃建尔 何南祥 徐陈槐
单位：310003 杭州，浙江医科大学一附院传染病研究所；第一作者窦骏现在南京铁道医学院210009
关键词：
中华传染病杂志990120 丙型肝炎病毒(HCV)的发病机制和机体对HCV的免疫应答目前尚不十分清楚。为此，我们研究了丙型肝炎(HC)患者外周血单个核细胞(PBMC)对HCV特异性抗原的增殖反应，从细胞免疫的角度分析机体抗HCV免疫功能及其与临床预后的相关性。
材料与方法
一、病例来源
1995年7月～1997年1月浙江医科大学附属一院及浙江省人民医院住院和门诊急、慢性HC患者24例，其中急性3例，慢性21例；男18例，女6例，年龄25岁～65岁。诊断依据1995年第五次全国传染病与寄生虫病学术会议修订的标准。
, 百拇医药
二、材料
(一) 抗原 HCV CP9、NS4合成肽、C、E1、E2、NS3基因重组抗原分别由本所、北京医科大学、北京中国药品生物制品检定所提供。
(二) 抗体
1. 鼠抗人淋巴细胞单克隆抗体(McAb)抗CD4+、抗CD8+、异硫氰酸(FITC)标记的羊抗鼠IgG，购于武汉生物制品研究所，用于荧光显微镜检测CD4+、CD8+细胞表型。
2. FITC-抗-CD4+、FITC-抗-CD8+鼠抗人McAb，购于北京医科大学McAb研究室，用流式细胞仪(FACS)检验CD4+、CD8+细胞表型。
, 百拇医药
三、方法
(一) HCV RNA、抗-HCV检测 按常规逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-nested-PCR)和放射免疫方法进行。
(二) PBMC对HCV抗原的增殖反应 常规分离PBMC，调细胞浓度为2×106/ ml，于96孔细胞培养板每孔加入2×105细胞，每一实验组共设5个复孔，其中4个复孔加入同一HCV抗原。对照组不加抗，阳性对照组加PHA，均设3个复孔(不做CD4+、CD8+细胞表型检测时，实验组仅设3个复孔，其余相同)。温育6天后取加入HCV抗原和未加抗原的细胞各1孔，用荧光显微镜/FACS检测PBMC在抗原刺激前后CD4+、CD8+细胞表型百分率，余3孔加3H-TdR 0.5μCi/孔，继续培养16～18小时收集细胞，在液闪计数仪上测cpm,以刺激指数(SI)表示PBMC对HCV抗原的增殖反应，并以SI≥2.1为阳性[1]。
, 百拇医药
(三) 荧光显微镜、FACS检测CD4+、CD8+细胞表型 按武汉生物制品研究所试剂盒说明书和参考文献[2]方法分别操作。
(四) 统计方法 t检验和F检验。
结果
一、HC患者PBMC对不同剂量合成肽增殖反应
不同剂量合成肽刺激HC患者PBMC的增殖反应不同，随着抗原剂量加大，PBMC的增殖反应愈加明显，但每孔加入8μg或12μg时CP9的SI分别为1.72和1.75；NS4的SI分别为1.68和1.73经t检验，两者差异无显著性(P>0.05)。而正常人PBMC对CP9、NS4抗原的刺激后，均未出现明显增殖反应。
, http://www.100md.com 二、HC患者PBMC对不同HCV抗原的增殖反应
见表1。按PBMC出现增殖反应SI≥2.1的比例，在各抗原间依次为26.7%(C)、25%(CP9)、18.2%(E1)、18.2%(E2)、16.7%(NS4)和9.1%(NS3)，其中C区抗原引起PBMC的增殖反应最为明显。2例急性HC患者的PBMC对HCV不同区抗原均出现阳性增殖反应，且血清HCV RNA阴转伴ALT正常。
表1 HC患者PBMC对不同HCV抗原刺激的增殖反应 患者
年龄
性别
ALT
抗-
, 百拇医药
HCV
HCV
RNA
基因
型
PBMC增殖反应(SI)
合成肽
重组抗原
PHA
CP9
NS4
C
E1
, 百拇医药
E2
NS3
1
65
M
A
+
+
Ⅱ
1.10
1.05
5.96
2*
, 百拇医药
37
F
N
+
-
Ⅱ
2.27
2.13
7.20
3
28
M
A
+
, http://www.100md.com
+
Ⅱ
1.46
1.55
6.29
4
48
M
N
+
+
Ⅲ
1.81
1.85
, http://www.100md.com
12.68
5
54
F
A
+
+
Ⅱ
2.79
1.13
12.15
6
28
M
, 百拇医药
A
+
+
Ⅰ/Ⅱ
1.80
2.03
14.00
7
61
M
NT
+
-
Ⅱ
, 百拇医药
1.08
2.14
12.07
8
29
M
A
+
+
Ⅱ/Ⅲ
1.96
1.77
7.03
, 百拇医药 9
27
F
A
-
+
Ⅱ
1.26
1.98
11.8
10
28
M
A
, 百拇医药
+
+
Ⅱ/Ⅲ
1.91
1.74
2.68
8.74
11
34
M
N
+
-
Ⅱ
, http://www.100md.com
2.16
3.50
1.96
8.23
12
48
M
N
+
+
NT
1.80
1.47
, http://www.100md.com 1.48
12.46
13*
27
F
A
+
+
NT
1.60
1.32
1.67
9.19
, http://www.100md.com
14*
25
M
N
+
-
Ⅱ
3.46
1.58
2.34
2.16
2.21
1.65
, 百拇医药
14.78
15
27
F
N
+
+
Ⅱ
1.01
1.32
1.01
1.45
1.40
, http://www.100md.com 0.97
7.51
16
41
F
NT
+
+
Ⅱ
1.2
1.15
1
0.99
1.04
, 百拇医药
1.12
6.61
17
40
M
N
+
+
Ⅱ
2.21
1.65
2.40
1.57
, http://www.100md.com 1.65
2.47
11.39
18
37
M
A
NT
+
Ⅱ
1.10
1.03
1.05
1.32
, 百拇医药
1.15
1.02
8.26
19
58
M
A
+
+
Ⅲ
2.18
2.1
2.40
, 百拇医药 1.62
1.59
1.50
9.63
20
49
M
A
NT
+
Ⅲ
1.28
1.16
1.09
, http://www.100md.com
1.28
1.10
1.03
6.63
21
60
M
A
+
+
Ⅰ/Ⅱ
1.24
1.38
, 百拇医药 2.08
2.34
2.23
1.17
9.50
22
32
M
NT
+
+
Ⅱ
1.18
1.07
, http://www.100md.com
1.61
1.55
1.14
1.25
8.30
23
54
M
NT
+
+
Ⅱ
1.45
, http://www.100md.com 1.22
1.34
1.03
1.05
1.23
7.49
24
30
M
A
+
+
Ⅲ
1.18
, http://www.100md.com
1.04
1.02
1.03
1.24
1.17
6.20
1.69
±0.63
1.61
±0.55
1.68
±0.58
, 百拇医药
1.49
±0.44
1.44
±0.44
1.33
±0.43
9.34
±2.67
阳性反应比较
6/24
4/24
4/15
2/11
, 百拇医药
2/11
1/11
*：急性肝炎 A：异常 N：正常 NT：未测
三、HC患者PBMC对HCV抗原刺激后CD4+、CD8+细胞增殖反应
见表2，HC患者PBMC在HCV抗原刺激后，经荧光显微镜、FACS检测，CD4+、CD8+淋巴细胞均发生增殖，CD4+淋巴细胞对CP9、C区抗原的增殖反应明显。数据经反正弦函数转换后，用t检验显示，与抗原刺激前相比，细胞增殖百分率变化显著。
表2 两种方法检测HC患者PBMC中CD4+、CD8+细胞增殖反应() 细胞表型
, http://www.100md.com
刺激前(%)
刺激后(%)
荧光显微镜
FACS
荧光显微镜
FACS
n=8
n=5
CP9
NS4
C区
CP9
, 百拇医药
NS4
C区
CD4+
43.26
±4.18
40.05
±3.48
48.73*
±3.49
47.07
±3.73
49.08**
, 百拇医药
±3.12
44.34*
±1.69
43.48
±1.92
44.78
±4.46*
CD8+
24.54
±3.02
20.27
±1.27
, http://www.100md.com
26.13
±1.31
25.99
±1.69
26.40
±2.34
21.19
±3.23
21.56
±2.33
22.5
±2.59
CD4+/CD8+
, http://www.100md.com
1.78
±0.26
1.97
±0.19
1.87
±0.20
1.82
±0.17
1.87
±0.26
2.09
±0.24
2.02
, http://www.100md.com
±0.18
1.99
±0.21
与刺激前相比：*P<0.05;**P<0.01
讨论
从8例HC患者PBMC对合成肽抗原增殖反应表明，抗原量加大引起PBMC增殖反应亦越强，但12μg/孔与8μg/孔抗原引起PBMC增殖反应的差异无显著性。为真实反映PBMC对抗原刺激后的增殖反应，又能节约昂贵的HCV抗原，故用8μg/孔抗原量为实验用刺激剂量。从表1、2结果可见，HCV感染患者PBMC确实存在细胞免疫反应，其中C区抗原的免疫原性最强。这一结果与Schupper等[3]的报道一致，但PBMC真正出现阳性增殖反应(SI≥2.1)的百分率平均只有19.7%，比对PHA引起的增殖反应要弱，总体免疫反应水平较低。这可能与患者体内病毒滴度低、免疫原性弱、机体对HCV反应低下及所选用HCV抗原的纯度不够等因素有关。
, 百拇医药
24例患者中，4例住院前HCV RNA阳性，本次检测已阴转，有3例伴ALT正常，其中2例为急性HC。虽然观察的病例数较少，但仍可发现HCV RNA阴转的病例主要集中在PBMC对HCV抗原有明显增殖反应的患者中，3例急性肝炎有2例PBMC对HCV抗原刺激出现阳性增殖反应。正如Botarelli等[4]认为，外周血T淋巴细胞虽不能清除HCV感染，但对HCV抗原刺激后增殖反应强弱，可能与HCV感染患者的临床预后有关。本研究结果提示，急性HC患者PBMC对HCV抗原刺激后的阳性增殖反应与其良好的预后有一定的相关性。当然这种相关性还需要用多种不同抗原对更多患者进行全面研究后方可能有更明确的答案。PBMC包含着T、B淋巴细胞、NK细胞等多种免疫细胞，受到抗原刺激后会发生相应变化。本研究表明，HC患者PBMC中CD4+细胞对CP9、C区抗原增殖反应与刺激前相比，有显著变化，而CD8+细胞以及CD4+/CD8+细胞比值在抗原刺激后虽有增加，但变化不显著。这可能与培养板中加入的HCV抗原属外源性抗原，经抗原提呈细胞吞噬、加工处理后，与MHC-Ⅱ类分子结合，将抗原信息主要传递给CD4+细胞，从而引起该类淋巴细胞亚群增殖。
, 百拇医药
本课题受浙江省卫生厅科研基金资助
参考文献
1 徐永耀，闻玉梅，胡德昌，等.慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞对乙型肝炎病毒前S区合成肽的增殖反应.中华传染病杂志，1992，10：68-71.
2 孙永莲，马树骏，温厚津，等.美洲商陆对人胎儿胸腺细胞表型的影响.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15：297-300.
3 Schupper H, Hayashi P, Scheffel J, et al. Peripheral-Blood Mononuclear Cell Responses to Recombinant Hepatitis C Virus Antigens in Patients with Chronic Hepatitis C. Hepatology,1993, 18:1055-1060.
4 Botarelli P, Brunetts MR, Minutello MA, et al. T-lymphocyte Responses to Hepatitis C in Different Clinical Courses of Infection. Gastroenterology, 1993, 104:580-587.
(收稿：1997-09-10 修回：1998-07-08), http://www.100md.com
单位：310003 杭州，浙江医科大学一附院传染病研究所；第一作者窦骏现在南京铁道医学院210009
关键词：
中华传染病杂志990120 丙型肝炎病毒(HCV)的发病机制和机体对HCV的免疫应答目前尚不十分清楚。为此，我们研究了丙型肝炎(HC)患者外周血单个核细胞(PBMC)对HCV特异性抗原的增殖反应，从细胞免疫的角度分析机体抗HCV免疫功能及其与临床预后的相关性。
材料与方法
一、病例来源
1995年7月～1997年1月浙江医科大学附属一院及浙江省人民医院住院和门诊急、慢性HC患者24例，其中急性3例，慢性21例；男18例，女6例，年龄25岁～65岁。诊断依据1995年第五次全国传染病与寄生虫病学术会议修订的标准。
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二、材料
(一) 抗原 HCV CP9、NS4合成肽、C、E1、E2、NS3基因重组抗原分别由本所、北京医科大学、北京中国药品生物制品检定所提供。
(二) 抗体
1. 鼠抗人淋巴细胞单克隆抗体(McAb)抗CD4+、抗CD8+、异硫氰酸(FITC)标记的羊抗鼠IgG，购于武汉生物制品研究所，用于荧光显微镜检测CD4+、CD8+细胞表型。
2. FITC-抗-CD4+、FITC-抗-CD8+鼠抗人McAb，购于北京医科大学McAb研究室，用流式细胞仪(FACS)检验CD4+、CD8+细胞表型。
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三、方法
(一) HCV RNA、抗-HCV检测 按常规逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-nested-PCR)和放射免疫方法进行。
(二) PBMC对HCV抗原的增殖反应 常规分离PBMC，调细胞浓度为2×106/ ml，于96孔细胞培养板每孔加入2×105细胞，每一实验组共设5个复孔，其中4个复孔加入同一HCV抗原。对照组不加抗，阳性对照组加PHA，均设3个复孔(不做CD4+、CD8+细胞表型检测时，实验组仅设3个复孔，其余相同)。温育6天后取加入HCV抗原和未加抗原的细胞各1孔，用荧光显微镜/FACS检测PBMC在抗原刺激前后CD4+、CD8+细胞表型百分率，余3孔加3H-TdR 0.5μCi/孔，继续培养16～18小时收集细胞，在液闪计数仪上测cpm,以刺激指数(SI)表示PBMC对HCV抗原的增殖反应，并以SI≥2.1为阳性[1]。
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(三) 荧光显微镜、FACS检测CD4+、CD8+细胞表型 按武汉生物制品研究所试剂盒说明书和参考文献[2]方法分别操作。
(四) 统计方法 t检验和F检验。
结果
一、HC患者PBMC对不同剂量合成肽增殖反应
不同剂量合成肽刺激HC患者PBMC的增殖反应不同，随着抗原剂量加大，PBMC的增殖反应愈加明显，但每孔加入8μg或12μg时CP9的SI分别为1.72和1.75；NS4的SI分别为1.68和1.73经t检验，两者差异无显著性(P>0.05)。而正常人PBMC对CP9、NS4抗原的刺激后，均未出现明显增殖反应。
, http://www.100md.com 二、HC患者PBMC对不同HCV抗原的增殖反应
见表1。按PBMC出现增殖反应SI≥2.1的比例，在各抗原间依次为26.7%(C)、25%(CP9)、18.2%(E1)、18.2%(E2)、16.7%(NS4)和9.1%(NS3)，其中C区抗原引起PBMC的增殖反应最为明显。2例急性HC患者的PBMC对HCV不同区抗原均出现阳性增殖反应，且血清HCV RNA阴转伴ALT正常。
表1 HC患者PBMC对不同HCV抗原刺激的增殖反应 患者
年龄
性别
ALT
抗-
, 百拇医药
HCV
HCV
RNA
基因
型
PBMC增殖反应(SI)
合成肽
重组抗原
PHA
CP9
NS4
C
E1
, 百拇医药
E2
NS3
1
65
M
A
+
+
Ⅱ
1.10
1.05
5.96
2*
, 百拇医药
37
F
N
+
-
Ⅱ
2.27
2.13
7.20
3
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M
A
+
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+
Ⅱ
1.46
1.55
6.29
4
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M
N
+
+
Ⅲ
1.81
1.85
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12.68
5
54
F
A
+
+
Ⅱ
2.79
1.13
12.15
6
28
M
, 百拇医药
A
+
+
Ⅰ/Ⅱ
1.80
2.03
14.00
7
61
M
NT
+
-
Ⅱ
, 百拇医药
1.08
2.14
12.07
8
29
M
A
+
+
Ⅱ/Ⅲ
1.96
1.77
7.03
, 百拇医药 9
27
F
A
-
+
Ⅱ
1.26
1.98
11.8
10
28
M
A
, 百拇医药
+
+
Ⅱ/Ⅲ
1.91
1.74
2.68
8.74
11
34
M
N
+
-
Ⅱ
, http://www.100md.com
2.16
3.50
1.96
8.23
12
48
M
N
+
+
NT
1.80
1.47
, http://www.100md.com 1.48
12.46
13*
27
F
A
+
+
NT
1.60
1.32
1.67
9.19
, http://www.100md.com
14*
25
M
N
+
-
Ⅱ
3.46
1.58
2.34
2.16
2.21
1.65
, 百拇医药
14.78
15
27
F
N
+
+
Ⅱ
1.01
1.32
1.01
1.45
1.40
, http://www.100md.com 0.97
7.51
16
41
F
NT
+
+
Ⅱ
1.2
1.15
1
0.99
1.04
, 百拇医药
1.12
6.61
17
40
M
N
+
+
Ⅱ
2.21
1.65
2.40
1.57
, http://www.100md.com 1.65
2.47
11.39
18
37
M
A
NT
+
Ⅱ
1.10
1.03
1.05
1.32
, 百拇医药
1.15
1.02
8.26
19
58
M
A
+
+
Ⅲ
2.18
2.1
2.40
, 百拇医药 1.62
1.59
1.50
9.63
20
49
M
A
NT
+
Ⅲ
1.28
1.16
1.09
, http://www.100md.com
1.28
1.10
1.03
6.63
21
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M
A
+
+
Ⅰ/Ⅱ
1.24
1.38
, 百拇医药 2.08
2.34
2.23
1.17
9.50
22
32
M
NT
+
+
Ⅱ
1.18
1.07
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1.61
1.55
1.14
1.25
8.30
23
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M
NT
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Ⅱ
1.45
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1.03
1.05
1.23
7.49
24
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M
A
+
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Ⅲ
1.18
, http://www.100md.com
1.04
1.02
1.03
1.24
1.17
6.20
1.69
±0.63
1.61
±0.55
1.68
±0.58
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1.49
±0.44
1.44
±0.44
1.33
±0.43
9.34
±2.67
阳性反应比较
6/24
4/24
4/15
2/11
, 百拇医药
2/11
1/11
*：急性肝炎 A：异常 N：正常 NT：未测
三、HC患者PBMC对HCV抗原刺激后CD4+、CD8+细胞增殖反应
见表2，HC患者PBMC在HCV抗原刺激后，经荧光显微镜、FACS检测，CD4+、CD8+淋巴细胞均发生增殖，CD4+淋巴细胞对CP9、C区抗原的增殖反应明显。数据经反正弦函数转换后，用t检验显示，与抗原刺激前相比，细胞增殖百分率变化显著。
表2 两种方法检测HC患者PBMC中CD4+、CD8+细胞增殖反应(
) 细胞表型, http://www.100md.com
刺激前(%)
刺激后(%)
荧光显微镜
FACS
荧光显微镜
FACS
n=8
n=5
CP9
NS4
C区
CP9
, 百拇医药
NS4
C区
CD4+
43.26
±4.18
40.05
±3.48
48.73*
±3.49
47.07
±3.73
49.08**
, 百拇医药
±3.12
44.34*
±1.69
43.48
±1.92
44.78
±4.46*
CD8+
24.54
±3.02
20.27
±1.27
, http://www.100md.com
26.13
±1.31
25.99
±1.69
26.40
±2.34
21.19
±3.23
21.56
±2.33
22.5
±2.59
CD4+/CD8+
, http://www.100md.com
1.78
±0.26
1.97
±0.19
1.87
±0.20
1.82
±0.17
1.87
±0.26
2.09
±0.24
2.02
, http://www.100md.com
±0.18
1.99
±0.21
与刺激前相比：*P<0.05;**P<0.01
讨论
从8例HC患者PBMC对合成肽抗原增殖反应表明，抗原量加大引起PBMC增殖反应亦越强，但12μg/孔与8μg/孔抗原引起PBMC增殖反应的差异无显著性。为真实反映PBMC对抗原刺激后的增殖反应，又能节约昂贵的HCV抗原，故用8μg/孔抗原量为实验用刺激剂量。从表1、2结果可见，HCV感染患者PBMC确实存在细胞免疫反应，其中C区抗原的免疫原性最强。这一结果与Schupper等[3]的报道一致，但PBMC真正出现阳性增殖反应(SI≥2.1)的百分率平均只有19.7%，比对PHA引起的增殖反应要弱，总体免疫反应水平较低。这可能与患者体内病毒滴度低、免疫原性弱、机体对HCV反应低下及所选用HCV抗原的纯度不够等因素有关。
, 百拇医药
24例患者中，4例住院前HCV RNA阳性，本次检测已阴转，有3例伴ALT正常，其中2例为急性HC。虽然观察的病例数较少，但仍可发现HCV RNA阴转的病例主要集中在PBMC对HCV抗原有明显增殖反应的患者中，3例急性肝炎有2例PBMC对HCV抗原刺激出现阳性增殖反应。正如Botarelli等[4]认为，外周血T淋巴细胞虽不能清除HCV感染，但对HCV抗原刺激后增殖反应强弱，可能与HCV感染患者的临床预后有关。本研究结果提示，急性HC患者PBMC对HCV抗原刺激后的阳性增殖反应与其良好的预后有一定的相关性。当然这种相关性还需要用多种不同抗原对更多患者进行全面研究后方可能有更明确的答案。PBMC包含着T、B淋巴细胞、NK细胞等多种免疫细胞，受到抗原刺激后会发生相应变化。本研究表明，HC患者PBMC中CD4+细胞对CP9、C区抗原增殖反应与刺激前相比，有显著变化，而CD8+细胞以及CD4+/CD8+细胞比值在抗原刺激后虽有增加，但变化不显著。这可能与培养板中加入的HCV抗原属外源性抗原，经抗原提呈细胞吞噬、加工处理后，与MHC-Ⅱ类分子结合，将抗原信息主要传递给CD4+细胞，从而引起该类淋巴细胞亚群增殖。
, 百拇医药
本课题受浙江省卫生厅科研基金资助
参考文献
1 徐永耀，闻玉梅，胡德昌，等.慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞对乙型肝炎病毒前S区合成肽的增殖反应.中华传染病杂志，1992，10：68-71.
2 孙永莲，马树骏，温厚津，等.美洲商陆对人胎儿胸腺细胞表型的影响.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15：297-300.
3 Schupper H, Hayashi P, Scheffel J, et al. Peripheral-Blood Mononuclear Cell Responses to Recombinant Hepatitis C Virus Antigens in Patients with Chronic Hepatitis C. Hepatology,1993, 18:1055-1060.
4 Botarelli P, Brunetts MR, Minutello MA, et al. T-lymphocyte Responses to Hepatitis C in Different Clinical Courses of Infection. Gastroenterology, 1993, 104:580-587.
(收稿：1997-09-10 修回：1998-07-08), http://www.100md.com