散发性戊型肝炎的病原学和血清学研究
作者：阮冰 马亦林 庄辉 李奎 干梦九 马伟杭
单位：阮冰、马亦林、干梦九、马伟杭 310003 浙江医科大学附属第一医院传染病科；庄辉、李奎 北京医科大学微生物学系
关键词：肝炎病毒，戊型；开放读码框架；聚合酶链反应；酶联免疫吸附测定
中华传染病杂志990102 【摘要】 目的 研究散发性戊型肝炎(HE)患者病毒血症、粪便排病毒及抗体消长规律。方法 采用逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-nested-PCR)动态检测血清和粪便HEV RNA，采用HEV ORF2、ORF3合成多肽单独和联合EIA法动态检测血清抗-HEV。结果 血清HEV RNA阳性患者占71%(44/62)，平均持续时间为病后20.6天(全程随访32例)；粪便HEV RNA阳性标本中有96.2%(25/26)出现在病后20天内；血清抗-HEV-IgM和IgG阳性率于发病半月内分别为71.1%(32/45)和97.8%(44/45)，随病程的延长IgM较早阴转。结论 病毒血症和粪便排病毒主要出现在急性早期；联合检测ORF2和ORF3抗体可提高EIA试验的敏感性，抗-HEV-IgM的特异性好而抗-HEV-IgG的灵敏度高。
, 百拇医药
Study on etiology and serology of sporadic hepatitis E
RUAN Bing, MA Yilin, ZHUANG Hui, et al.
Department of Infectious Diseases, The First Hospital of Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003
【Abstract】 Objective To study the viremia, fecal shedding of HEV and dynamics of anti-HEV in the patients with sporadic hepatitis E.Methods HEV RNA was detected in serial samples of sera and feces by reverse transcription-nested-polymerase chain reaction (RT-nested-PCR). Anti-HEV was detected in serial sera by enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) based on two synthetic peptides from ORF2 and ORF3 of HEV genome.Results Viremia of HEV RNA was detected in 71% (44/ 62) of patients, persisted for 20.6 days after the onset of disease on an average. 96.2% (25/ 26) of fecal specimens with HEV RNA were detected within 20 days after the onset of disease. The positive rates of anti-HEV-IgM and IgG with in 15 days after the onset of disease were respectively 71.1% (32/ 45) and 97.8% (44/ 45), which decreased more dramatically in IgM than in IgG with the course of the disease. Conclusion Viremia and fecal shedding are common during early acute phase of the disease. The sensitivity of EIA using both ORF2 and ORF3 peptides is higher than that of either alone. As a diagnostic marker of hepatitis E, Anti-HEV-IgM seems to be more specific and anti-HEV-IgG seems to be more sensitive.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis E virus Open reading frame Polymerase chain reaction Enzyme-linked immunosorbent assay
戊型肝炎(HE)日常主要表现为散发，开展散发性HE的病原学和血清学研究，对我国HE的防治具有实际意义。我们对散发性HE病程中的病毒消长与血清抗体应答规律进行了观察。
材料与方法
一、病例选择
62例患者为1994年1月～1997年6月我院收治的急性散发性HE患者，其中男48例，女14例，年龄18～76岁，平均43.8±14.9岁，诊断均符合1995年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎防治方案[1]。
, 百拇医药 二、标本收集
以患者入院前出现发热和/ 或消化道症状作为病程的开始日进行标本收集。先是每5天一次，收集62例患者发病2个月内的血清531份，用于病毒血症研究，同时逐次留取其中26例患者发病1个月内的粪便91份，用于粪便排病毒观察；继而按发病半月内、每月(1～6个月)及9、12、24、36个月各取血1次，收集其中52例患者发病3年内的血清375份，用于抗体消长规律研究。
三、PCR引物设计与合成
选择HEV非结构基因区开放读码框架1(ORF1)，由美国Sybersyn公司人工合成两对寡核苷酸引物，序列分别是：1.外引物：正链为5′-CATGGTCGAGAAGGGCCAGG-3′(4089～4108)，负链为5′-GCGGAAGTCATAA-CAGTGGG-3′(4631～4650)；2.内引物：正链为5′-ATGACTTTGCTGAGTTTGACT-3′(4403～4423)，负链为5′-CATATTCCAGACAGTATTCC-3′(4601～4620)。扩增长度第一轮为562bp,第二轮为218bp。
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四、血清和粪便HEV RNA提取及逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-nested-PCR)扩增
见文献[2]。
五、抗-HEV EIA检测
采用Genelabs公司EIA试剂盒，于病毒血症随访期(发病2个月内)对患者血清作抗-HEV检测，其中62份首份血清作抗-HEV-IgM检测，531份连续血清作抗-HEV-IgG检测，将测定结果按其说明书换算成cut off指数(
)。
六、抗-HEV ORF2、ORF3单独及联合EIA检测
采用北京医科大学微生物学系研制的HEV ORF2和ORF3多肽，分别及联合包被微量反应板，建立EIA法，对随访抗体消长规律的52例患者发病3年内的375份血清进行抗-HEV ORF2、ORF3及ORF2、3抗体检测。操作过程及结果判断见文献[3]。抗-ORF2、3联合检测包括IgM和IgG两类抗体，对IgM抗体始终未阳转患者的首份血清加作IgG抗体滴度测定。
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七、统计学方法
采用SPSS统计软件，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验。
结果
一、血清HEV RNA检测
62例患者中血清HEV RNA阳性44例(71%)，其中发病后1～5、6～10、11～15、16～20、21～25、26～30、31～35、36～40、41～45和46～50天的阳性率分别为70.6%(12/17)、75%(33/44)、69.5%(41/59)、59.7%(37/62)、38.6%(22/57)、20.3%(12/59)、14.3%(8/56)、11.8%(6/51)、4.4%(2/45)和3.0%(1/33)，最长1份阳性血清出现在发病第51天。对32例患者作全程随访(自发病后6～10天开始)，显示血清HEV RNA阳性24例(75%)，平均持续时间为发病后(20.6±8.9)天。
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以丙氨酸转氨酶(ALT)及总胆红素(TB)均恢复正常水平为病愈标准，按病程长短将患者分为两组。病程短于6周者为Ⅰ组(38例)，超过6周者为Ⅱ组(24例)，两组TB最高均值分别为61.8μmol/L和152.8μmol/L，差异有非常显著性(t=8.386,P<0.05)，提示Ⅱ组肝损害较重。两组血清HEV RNA阳性率分别为73.7%(28例)和66.7%(16例)，差异无显著性(χ2=0.352,P>0.05)，HEV RNA阳性持续时间分别为(22.4±9.9)天和(21.0±8.9)天，差异无显著性(t=0.455,P>0.05)。44例HEV血症患者中，36例(81.8%)在ALT和TB水平开始回落时仍检测到HEV RNA(其中6例持续阳性至肝功能完全复常)，其余8例(18.2%)在TB水平到达峰值前阴转。根据抗-HEV峰值水平的不同，再将患者分成两组，cut off指数始终低于4.0者为Ⅰ组(35例)，曾达到4.0或以上者为Ⅱ组(27例)。两组血清HEV RNA阳性率分别为71.4%(25例)和70.4%(19例)，差异无显著性(χ2=0.008,P>0.05),HEV RNA阳性持续时间分别为(21.7±9.4)天和(22.1±9.8)天，差异无显著性(t=0.114,P>0.05)。44例HEV血症患者中，39例(88.6%)抗-HEV同时阳性，其余5例(11.4%)未见抗-HEV阳转。
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二、粪便HEV RNA检测
26例患者粪便HEV RNA检测结果，病例阳性率为42.3%(11/26)，标本阳性率为28.6%(26/91)，其中发病后1～5、6～10、11～15、16～20、21～25和26～30天的标本阳性率分别为75.0%(3/4)、53.8%(7/13)、34.5%(10/29)、19.2%(5/26)、8.3%(1/12)和0%(0/7)。26份HEV RNA阳性粪便中，25份(96.2%)出现在发病20天内，另1份出现在发病第23天。
三、血清抗-HEV检测
由表1可见，52例患者375份血清抗-HEV ORF2抗体总阳性率显著高于ORF3抗体(χ2=18.070,P<0.05)，主要是在发病3个月后，ORF2抗体检出率持续高于ORF3抗体。联合检测ORF2、3抗体的总阳性率高于单一ORF2或ORF3抗体(χ2=4.396、39.677，P<0.05)，且A值也明显提高。发病半月内，抗-ORF2、3 IgG阳性率为97.8%，抗-ORF2、3 IgM为71.1%，两者相比差异有显著性(χ2=12.180,P<0.05)。随后，IgG阳性率逐渐下降，IgM阳性率快速下降。
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表1 52例HE患者不同病期375份血清各种抗-HEV检测结果 病后月数
血清份数
抗-HEV-IgG阳性数(%)
抗-HEV-IgM阳性数(%)
(ORF2+ORF3抗体)
ORF2抗体
ORF3抗体
ORF2+ORF3抗体
<0.5
45
44(97.8)
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44(97.8)
44(97.8)
32(71.1)
1
52
50(96.2)
47(90.4)
51(98.1)
24(46.2)
2
45
40(88.9)
, http://www.100md.com 38(84.4)
44(97.8)
7(15.6)
3
45
38(84.4)
30(66.7)
40(88.9)
3(6.7)
4
35
26(74.3)
16(45.7)
, http://www.100md.com
30(85.7)
2(5.7)
5
33
21(63.6)
10(30.3)
25(75.8)
1(3.0)
6
35
16(45.7)
6(17.1)
20(57.1)
, 百拇医药
1(2.9)
9
34
11(32.4)
4(11.8)
14(41.2)
1(2.9)
12
32
7(21.9)
2(6.3)
9(28.1)
0(0)
, 百拇医药
24
13
1(7.7)
0(0)
2(15.4)
0(0)
36
6
0(0)
0(0)
1(16.7)
0(0)
合计
, 百拇医药
375
254(67.7)
197(52.5)
280(74.7)
71(18.9)
选择30例发病1年内取样完整的患者进行全程观察，结果见图1。发病半月内，ORF2抗体和ORF3抗体均处峰值水平，其后均随时间下降，其中ORF3抗体水平的下降快于ORF2抗体，病后6个月两者阳性率分别为16.7%(5/30)和56.7%(17/30)，12个月时分别为0和30%(9/30)。抗-ORF2、3 IgG水平高，持续阳性时间也较长；抗-ORF2、3 IgM的阳性率下降很快，从发病半个月内的76.7%(23/30)降至病后3个月的6.7%(2/30)，仅1例持续阳性9个月。对抗-ORF2、3 IgM始终阴性的7例(23.3%)患者的首份血清作抗-ORF2、3 IgG抗体滴度测定，结果均高于1∶80。比较上述30例患者血清抗-ORF2、3 IgG水平的消长曲线，可见3种类型。第一类为持续阳性，共2例，其首份血清的抗体滴度均为1∶160，后续系列血清的抗体水平无明显升降；第二类为短暂升高后下降，共6例；第三类为一开始即处峰值，然后随时间下降，共22例。未见血清抗体持续高水平或在发病3个月后继续升高者。
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图1 30例HE患者血清抗-HEV水平的动态变化
讨论
RT-nested-PCR的建立，为研究HEV的感染过程提供了可靠手段,已有学者应用这一方法动态检测实验动物猕猴血清和粪便中的HEV RNA[2]。本研究显示，散发性HE患者急性期存在病毒血症，血清HEV RNA的阳性率及阳性持续时间与肝损害程度及抗-HEV应答水平无明显相关，其原因可能是HEV通过芽生方式从肝细胞释放，而不是肝细胞溶解释放；另一方面说明，抗-HEV的中和活性不强。观察HE患者的粪便排病毒规律以往采用免疫电镜技术，不仅需要特殊的设备和技术，而且在血清ALT到达峰值水平之后很难再能检测到病毒颗粒[4]。我们采用RT-nested-PCR作粪便HEV RNA检测，显示多数阳性标本(96.2%)出现在发病20天内，只有1份出现在发病第23天，表明HE患者的粪便排病毒主要发生在疾病的急性期早期，将HE的隔离期暂定为病后3周是合理的。
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有关散发性HE患者不同病期血清抗-HEV的阳性率以往的报道存在较大的差异[5-7]，除了试剂盒及发病地区各不相同外，还缺少系列血清的全程随访资料。本研究选择代表HEV ORF2和ORF3主要抗原决定簇的两段多肽作抗原，建立EIA法，对52例急性散发性HE患者的血清抗-HEV进行了3年随访(其中30例全程随访12个月)，研究结果表明，发病初期血清抗-HEV ORF2和ORF3抗体水平均较高，随着病程的延长，两者均下降，ORF3抗体尤为明显，与庄辉等[3]用本法检测实验感染HEV猕猴系列血清的结果一致，提示HEV结构基因ORF2和ORF3区编码的蛋白含有不同的抗原表位，可引起宿主不同的免疫应答。实验结果还显示，同时用该两种抗原作EIA，抗-HEV的检出率高于用单一抗原，其抗体水平也明显提高。因此，在制备抗-HEV EIA试剂盒时，应联合应用ORF2和ORF3多肽，以提高其灵敏度和特异性。
比较血清抗-HEV-IgM和抗-HEV-IgG的检测结果，发现两者的出现均较早，发病半月内的阳性率分别为71.1%和97.8%，其中抗-HEV-IgM的阳性率下降快，对诊断急性HE的特异性较好；而抗-HEV-IgG的阳性率高，是诊断急性HE更为灵敏的指标。因此，对疑诊为HE的急性肝炎患者，最好是在排除其他肝炎病毒急性感染的基础上，平行检测血清抗-HEV-IgM和抗-HEV-IgG，动态观察其消长情况，如出现IgM或IgG抗体阳转，或其效价从高值进行性下降或由低值上升(如本研究观察到的消长曲线)，均有助于HE的诊断。单项IgG抗体阳性更有必要进行动态观察并作滴度测定，特别是在HE地方性流行区，早期患者还可通过血清HEV RNA的检测明确诊断。
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本课题为浙江省自然科学基金(394185)、浙江省教委(94301)及浙江省卫生厅资助项目
参考文献
1 病毒性肝炎防治方案(试行).中华传染病杂志，1995，13：241-247.
2 李凡，庄辉，朱万孚，等.实验感染的猕猴血清和粪便中HEV RNA动态变化研究.北京医科大学学报，1995，27：243-244.
3 庄辉，李凡，朱永红，等.戊型肝炎病人和实验感染戊型肝炎病毒的猕猴血清抗-HEV ORF2和ORF3的动态变化.中华实验和临床病毒学杂志，1995，9：299-302.
4 曹学义，孙士英，刘占娥,等.肠道传播的非甲非乙型肝炎病人粪便排病毒规律的检测.病毒学报，1989，5：188-190.
, 百拇医药
5 Goldsmith R, Yarbough PO, Reye GR, et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of acute sporadic hepatitis E in Egyptian children. Lancet, 1992,339:328-331.
6 韩砚义，李玉萍，沙地克，等.戊型肝炎患者血清抗戊型肝炎病毒IgG的动态改变.中华实验和临床病毒学杂志，1993，7：427.
7 Khuroo MS, Kamili S, Dar MY, et al. Hepatitis E and long term antibody status. Lancet, 1993,341:1355.
(收稿：1997-07-29 修回：1997-11-22), 百拇医药
单位：阮冰、马亦林、干梦九、马伟杭 310003 浙江医科大学附属第一医院传染病科；庄辉、李奎 北京医科大学微生物学系
关键词：肝炎病毒，戊型；开放读码框架；聚合酶链反应；酶联免疫吸附测定
中华传染病杂志990102 【摘要】 目的 研究散发性戊型肝炎(HE)患者病毒血症、粪便排病毒及抗体消长规律。方法 采用逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-nested-PCR)动态检测血清和粪便HEV RNA，采用HEV ORF2、ORF3合成多肽单独和联合EIA法动态检测血清抗-HEV。结果 血清HEV RNA阳性患者占71%(44/62)，平均持续时间为病后20.6天(全程随访32例)；粪便HEV RNA阳性标本中有96.2%(25/26)出现在病后20天内；血清抗-HEV-IgM和IgG阳性率于发病半月内分别为71.1%(32/45)和97.8%(44/45)，随病程的延长IgM较早阴转。结论 病毒血症和粪便排病毒主要出现在急性早期；联合检测ORF2和ORF3抗体可提高EIA试验的敏感性，抗-HEV-IgM的特异性好而抗-HEV-IgG的灵敏度高。
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Study on etiology and serology of sporadic hepatitis E
RUAN Bing, MA Yilin, ZHUANG Hui, et al.
Department of Infectious Diseases, The First Hospital of Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003
【Abstract】 Objective To study the viremia, fecal shedding of HEV and dynamics of anti-HEV in the patients with sporadic hepatitis E.Methods HEV RNA was detected in serial samples of sera and feces by reverse transcription-nested-polymerase chain reaction (RT-nested-PCR). Anti-HEV was detected in serial sera by enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) based on two synthetic peptides from ORF2 and ORF3 of HEV genome.Results Viremia of HEV RNA was detected in 71% (44/ 62) of patients, persisted for 20.6 days after the onset of disease on an average. 96.2% (25/ 26) of fecal specimens with HEV RNA were detected within 20 days after the onset of disease. The positive rates of anti-HEV-IgM and IgG with in 15 days after the onset of disease were respectively 71.1% (32/ 45) and 97.8% (44/ 45), which decreased more dramatically in IgM than in IgG with the course of the disease. Conclusion Viremia and fecal shedding are common during early acute phase of the disease. The sensitivity of EIA using both ORF2 and ORF3 peptides is higher than that of either alone. As a diagnostic marker of hepatitis E, Anti-HEV-IgM seems to be more specific and anti-HEV-IgG seems to be more sensitive.
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【Key words】 Hepatitis E virus Open reading frame Polymerase chain reaction Enzyme-linked immunosorbent assay
戊型肝炎(HE)日常主要表现为散发，开展散发性HE的病原学和血清学研究，对我国HE的防治具有实际意义。我们对散发性HE病程中的病毒消长与血清抗体应答规律进行了观察。
材料与方法
一、病例选择
62例患者为1994年1月～1997年6月我院收治的急性散发性HE患者，其中男48例，女14例，年龄18～76岁，平均43.8±14.9岁，诊断均符合1995年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎防治方案[1]。
, 百拇医药 二、标本收集
以患者入院前出现发热和/ 或消化道症状作为病程的开始日进行标本收集。先是每5天一次，收集62例患者发病2个月内的血清531份，用于病毒血症研究，同时逐次留取其中26例患者发病1个月内的粪便91份，用于粪便排病毒观察；继而按发病半月内、每月(1～6个月)及9、12、24、36个月各取血1次，收集其中52例患者发病3年内的血清375份，用于抗体消长规律研究。
三、PCR引物设计与合成
选择HEV非结构基因区开放读码框架1(ORF1)，由美国Sybersyn公司人工合成两对寡核苷酸引物，序列分别是：1.外引物：正链为5′-CATGGTCGAGAAGGGCCAGG-3′(4089～4108)，负链为5′-GCGGAAGTCATAA-CAGTGGG-3′(4631～4650)；2.内引物：正链为5′-ATGACTTTGCTGAGTTTGACT-3′(4403～4423)，负链为5′-CATATTCCAGACAGTATTCC-3′(4601～4620)。扩增长度第一轮为562bp,第二轮为218bp。
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四、血清和粪便HEV RNA提取及逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-nested-PCR)扩增
见文献[2]。
五、抗-HEV EIA检测
采用Genelabs公司EIA试剂盒，于病毒血症随访期(发病2个月内)对患者血清作抗-HEV检测，其中62份首份血清作抗-HEV-IgM检测，531份连续血清作抗-HEV-IgG检测，将测定结果按其说明书换算成cut off指数(
)。六、抗-HEV ORF2、ORF3单独及联合EIA检测
采用北京医科大学微生物学系研制的HEV ORF2和ORF3多肽，分别及联合包被微量反应板，建立EIA法，对随访抗体消长规律的52例患者发病3年内的375份血清进行抗-HEV ORF2、ORF3及ORF2、3抗体检测。操作过程及结果判断见文献[3]。抗-ORF2、3联合检测包括IgM和IgG两类抗体，对IgM抗体始终未阳转患者的首份血清加作IgG抗体滴度测定。
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七、统计学方法
采用SPSS统计软件，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验。
结果
一、血清HEV RNA检测
62例患者中血清HEV RNA阳性44例(71%)，其中发病后1～5、6～10、11～15、16～20、21～25、26～30、31～35、36～40、41～45和46～50天的阳性率分别为70.6%(12/17)、75%(33/44)、69.5%(41/59)、59.7%(37/62)、38.6%(22/57)、20.3%(12/59)、14.3%(8/56)、11.8%(6/51)、4.4%(2/45)和3.0%(1/33)，最长1份阳性血清出现在发病第51天。对32例患者作全程随访(自发病后6～10天开始)，显示血清HEV RNA阳性24例(75%)，平均持续时间为发病后(20.6±8.9)天。
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以丙氨酸转氨酶(ALT)及总胆红素(TB)均恢复正常水平为病愈标准，按病程长短将患者分为两组。病程短于6周者为Ⅰ组(38例)，超过6周者为Ⅱ组(24例)，两组TB最高均值分别为61.8μmol/L和152.8μmol/L，差异有非常显著性(t=8.386,P<0.05)，提示Ⅱ组肝损害较重。两组血清HEV RNA阳性率分别为73.7%(28例)和66.7%(16例)，差异无显著性(χ2=0.352,P>0.05)，HEV RNA阳性持续时间分别为(22.4±9.9)天和(21.0±8.9)天，差异无显著性(t=0.455,P>0.05)。44例HEV血症患者中，36例(81.8%)在ALT和TB水平开始回落时仍检测到HEV RNA(其中6例持续阳性至肝功能完全复常)，其余8例(18.2%)在TB水平到达峰值前阴转。根据抗-HEV峰值水平的不同，再将患者分成两组，cut off指数始终低于4.0者为Ⅰ组(35例)，曾达到4.0或以上者为Ⅱ组(27例)。两组血清HEV RNA阳性率分别为71.4%(25例)和70.4%(19例)，差异无显著性(χ2=0.008,P>0.05),HEV RNA阳性持续时间分别为(21.7±9.4)天和(22.1±9.8)天，差异无显著性(t=0.114,P>0.05)。44例HEV血症患者中，39例(88.6%)抗-HEV同时阳性，其余5例(11.4%)未见抗-HEV阳转。
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二、粪便HEV RNA检测
26例患者粪便HEV RNA检测结果，病例阳性率为42.3%(11/26)，标本阳性率为28.6%(26/91)，其中发病后1～5、6～10、11～15、16～20、21～25和26～30天的标本阳性率分别为75.0%(3/4)、53.8%(7/13)、34.5%(10/29)、19.2%(5/26)、8.3%(1/12)和0%(0/7)。26份HEV RNA阳性粪便中，25份(96.2%)出现在发病20天内，另1份出现在发病第23天。
三、血清抗-HEV检测
由表1可见，52例患者375份血清抗-HEV ORF2抗体总阳性率显著高于ORF3抗体(χ2=18.070,P<0.05)，主要是在发病3个月后，ORF2抗体检出率持续高于ORF3抗体。联合检测ORF2、3抗体的总阳性率高于单一ORF2或ORF3抗体(χ2=4.396、39.677，P<0.05)，且A值也明显提高。发病半月内，抗-ORF2、3 IgG阳性率为97.8%，抗-ORF2、3 IgM为71.1%，两者相比差异有显著性(χ2=12.180,P<0.05)。随后，IgG阳性率逐渐下降，IgM阳性率快速下降。
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表1 52例HE患者不同病期375份血清各种抗-HEV检测结果 病后月数
血清份数
抗-HEV-IgG阳性数(%)
抗-HEV-IgM阳性数(%)
(ORF2+ORF3抗体)
ORF2抗体
ORF3抗体
ORF2+ORF3抗体
<0.5
45
44(97.8)
, http://www.100md.com
44(97.8)
44(97.8)
32(71.1)
1
52
50(96.2)
47(90.4)
51(98.1)
24(46.2)
2
45
40(88.9)
, http://www.100md.com 38(84.4)
44(97.8)
7(15.6)
3
45
38(84.4)
30(66.7)
40(88.9)
3(6.7)
4
35
26(74.3)
16(45.7)
, http://www.100md.com
30(85.7)
2(5.7)
5
33
21(63.6)
10(30.3)
25(75.8)
1(3.0)
6
35
16(45.7)
6(17.1)
20(57.1)
, 百拇医药
1(2.9)
9
34
11(32.4)
4(11.8)
14(41.2)
1(2.9)
12
32
7(21.9)
2(6.3)
9(28.1)
0(0)
, 百拇医药
24
13
1(7.7)
0(0)
2(15.4)
0(0)
36
6
0(0)
0(0)
1(16.7)
0(0)
合计
, 百拇医药
375
254(67.7)
197(52.5)
280(74.7)
71(18.9)
选择30例发病1年内取样完整的患者进行全程观察，结果见图1。发病半月内，ORF2抗体和ORF3抗体均处峰值水平，其后均随时间下降，其中ORF3抗体水平的下降快于ORF2抗体，病后6个月两者阳性率分别为16.7%(5/30)和56.7%(17/30)，12个月时分别为0和30%(9/30)。抗-ORF2、3 IgG水平高，持续阳性时间也较长；抗-ORF2、3 IgM的阳性率下降很快，从发病半个月内的76.7%(23/30)降至病后3个月的6.7%(2/30)，仅1例持续阳性9个月。对抗-ORF2、3 IgM始终阴性的7例(23.3%)患者的首份血清作抗-ORF2、3 IgG抗体滴度测定，结果均高于1∶80。比较上述30例患者血清抗-ORF2、3 IgG水平的消长曲线，可见3种类型。第一类为持续阳性，共2例，其首份血清的抗体滴度均为1∶160，后续系列血清的抗体水平无明显升降；第二类为短暂升高后下降，共6例；第三类为一开始即处峰值，然后随时间下降，共22例。未见血清抗体持续高水平或在发病3个月后继续升高者。
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图1 30例HE患者血清抗-HEV水平的动态变化
讨论
RT-nested-PCR的建立，为研究HEV的感染过程提供了可靠手段,已有学者应用这一方法动态检测实验动物猕猴血清和粪便中的HEV RNA[2]。本研究显示，散发性HE患者急性期存在病毒血症，血清HEV RNA的阳性率及阳性持续时间与肝损害程度及抗-HEV应答水平无明显相关，其原因可能是HEV通过芽生方式从肝细胞释放，而不是肝细胞溶解释放；另一方面说明，抗-HEV的中和活性不强。观察HE患者的粪便排病毒规律以往采用免疫电镜技术，不仅需要特殊的设备和技术，而且在血清ALT到达峰值水平之后很难再能检测到病毒颗粒[4]。我们采用RT-nested-PCR作粪便HEV RNA检测，显示多数阳性标本(96.2%)出现在发病20天内，只有1份出现在发病第23天，表明HE患者的粪便排病毒主要发生在疾病的急性期早期，将HE的隔离期暂定为病后3周是合理的。
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有关散发性HE患者不同病期血清抗-HEV的阳性率以往的报道存在较大的差异[5-7]，除了试剂盒及发病地区各不相同外，还缺少系列血清的全程随访资料。本研究选择代表HEV ORF2和ORF3主要抗原决定簇的两段多肽作抗原，建立EIA法，对52例急性散发性HE患者的血清抗-HEV进行了3年随访(其中30例全程随访12个月)，研究结果表明，发病初期血清抗-HEV ORF2和ORF3抗体水平均较高，随着病程的延长，两者均下降，ORF3抗体尤为明显，与庄辉等[3]用本法检测实验感染HEV猕猴系列血清的结果一致，提示HEV结构基因ORF2和ORF3区编码的蛋白含有不同的抗原表位，可引起宿主不同的免疫应答。实验结果还显示，同时用该两种抗原作EIA，抗-HEV的检出率高于用单一抗原，其抗体水平也明显提高。因此，在制备抗-HEV EIA试剂盒时，应联合应用ORF2和ORF3多肽，以提高其灵敏度和特异性。
比较血清抗-HEV-IgM和抗-HEV-IgG的检测结果，发现两者的出现均较早，发病半月内的阳性率分别为71.1%和97.8%，其中抗-HEV-IgM的阳性率下降快，对诊断急性HE的特异性较好；而抗-HEV-IgG的阳性率高，是诊断急性HE更为灵敏的指标。因此，对疑诊为HE的急性肝炎患者，最好是在排除其他肝炎病毒急性感染的基础上，平行检测血清抗-HEV-IgM和抗-HEV-IgG，动态观察其消长情况，如出现IgM或IgG抗体阳转，或其效价从高值进行性下降或由低值上升(如本研究观察到的消长曲线)，均有助于HE的诊断。单项IgG抗体阳性更有必要进行动态观察并作滴度测定，特别是在HE地方性流行区，早期患者还可通过血清HEV RNA的检测明确诊断。
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本课题为浙江省自然科学基金(394185)、浙江省教委(94301)及浙江省卫生厅资助项目
参考文献
1 病毒性肝炎防治方案(试行).中华传染病杂志，1995，13：241-247.
2 李凡，庄辉，朱万孚，等.实验感染的猕猴血清和粪便中HEV RNA动态变化研究.北京医科大学学报，1995，27：243-244.
3 庄辉，李凡，朱永红，等.戊型肝炎病人和实验感染戊型肝炎病毒的猕猴血清抗-HEV ORF2和ORF3的动态变化.中华实验和临床病毒学杂志，1995，9：299-302.
4 曹学义，孙士英，刘占娥,等.肠道传播的非甲非乙型肝炎病人粪便排病毒规律的检测.病毒学报，1989，5：188-190.
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5 Goldsmith R, Yarbough PO, Reye GR, et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of acute sporadic hepatitis E in Egyptian children. Lancet, 1992,339:328-331.
6 韩砚义，李玉萍，沙地克，等.戊型肝炎患者血清抗戊型肝炎病毒IgG的动态改变.中华实验和临床病毒学杂志，1993，7：427.
7 Khuroo MS, Kamili S, Dar MY, et al. Hepatitis E and long term antibody status. Lancet, 1993,341:1355.
(收稿：1997-07-29 修回：1997-11-22), 百拇医药