小鼠牙本质涎蛋白成熟肽编码区cDNA克隆和部分序列分析*
作者：郝建军 麻孙恺 费 俭 江卫民 汪 平 刘 正 史俊南 郭礼和
单位：郝建军 刘 正 第二医科大学第九人民医院，上海 200011；郭礼和 麻孙恺 费 俭 中科院上海细胞所基因工程组，上海 200031；江卫民 汪 平 史俊南 第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：牙本质基质蛋白；涎蛋白；聚合酶链反应；小鼠
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的：克隆小鼠牙本质涎蛋白(DSP)成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙胚cDNA，然后利用PCR方法，从cDNA中扩增出小鼠DSP成熟区的基因片段(约1.4 kbp)，将所得基因片段插入pBS质粒载体，转化到大肠杆菌XL1-Blue后挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA，通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pBS-DSP的酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠DSP成熟肽编码区基因，正在进行该基因的表达和活性鉴定。
, 百拇医药
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0039-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999；9(1)：39]
Cloning and partially sequencing of mouse dentin
sialoprotein encoding mature protein
Hao Jianjun, Ma Sunkai, Fei Jian et al
School of Stomatology, The Shanghai Secondary Medical University, Shanghai 200011
Abstract Aim: Cloning and partially sequencing of mouse dentin sialoprotein (DSP) encoding mature protein. Methods: In the study, total RNA was extracted from the tooth germs of newborn mouse by acid guanidinium thiocyanata-phenol-chloroform method, the desired DNA product was obtained from the total RNA by RT-PCR with the primers including Oligo(dt) and two gene specific primers. The segment (about 1.4 kbp) was inserted into pBluescript vector and the interesting plasmid was transformed into E. Coli host strain XL1-Blue. The double -stranded DNA of the positive clone was analyzed by restriction endonuclease mapping and DNA sequencing. Results: the restriction endonuclease map and sequence of mouse DSP encoding mature protein were consistent with those of the references appeared. Conclusion: the mouse DSP cDNA encoding mature protein was obtained for further study.
, 百拇医药
Key Words dentin matrix proteins；sialoprotein；PCR ；mice
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999;9(1):39]
牙本质涎蛋白(Dentin Sialoprotein, DSP)是牙本质基质蛋白中的特异性蛋白之一，在牙本质形成和生物矿化方面发挥着重要的调节作用。因与骨涎蛋白的氨基酸组成相似而得名[1]。DSP是Butler等[2]于1981年首次分离纯化的一种牙本质非胶原蛋白(Dentin Non-Collageous Proteins, DNCPs)，1994年Ritchie等[3]克隆了大鼠DSP cDNA片段。本组采用逆转录PCR方法(RT-PCR)，从新生昆明小鼠磨牙牙胚组织中克隆到DSP成熟区基因片段，并测定了其部分核苷酸序列，为表达有活性的DSP蛋白奠定基础。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 小鼠磨牙牙胚的来源和获取
本实验所用5～10d龄的新生昆明小鼠(B6D2F1)来源于中科院上海细胞生物学研究所动物房。将新生小鼠拉颈处死，断头，暴露磨牙部位，挑开牙龈组织，挖取处于牙本质形成期的小鼠第一、二磨牙[4，5]，立即置液氮中冻存，-70℃下长期保存。
1.2 总RNA的提取
磨碎冻存的小鼠磨牙牙胚组织，在盛有预冷的变性缓冲液(德国宝灵曼公司)的匀浆器中充分破碎组织细胞，组织与缓冲液的比例为1:10。用异硫氰酸胍一步法从牙胚组织中提取总RNA，并进行电泳鉴定。
1.3 cDNA的合成和PCR扩增
根据Ritchie等[3]和MacDougall等[6]报道的大鼠DSP和小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)的cDNA序列，采用PC Gene 设计PCR扩增的两条引物。为了获得完整的小鼠DSP成熟区基因，将5'和3'端引物向两侧延伸100多碱基，5'引物碱基序列为：5'AAGAATTCTCAGCCTGGAAAGGGAGATAAGG3'带有EcoRI酶切位点；3'端的引物序列为5'AAGGATCCGTCATCGAACTCGTAACTGTCATGC3'，带有BamHI酶切识别序列。用Gibco BRL公司的Super Script TM试剂盒，按其说明进行逆转录(RT)，合成cDNA第一链，以其为模板，PCR扩增出小鼠DSP成熟区基因片段(美国MJ Research公司 PTC-150型PCR仪)。Taq Plus Ⅱ DNA聚合酶购于中科院上海生理研究所生工公司。
, 百拇医药
1.4 PCR产物的克隆及酶谱分析
PCR产物于10g/L低熔点琼脂糖凝胶上电泳回收，用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段(Promega公司)对PCR产物进行部分补平，对载体质粒pBluescript KS(pBS)用 SmaI酶切消化，平端连接目的基因片段和酶切质粒载体，转化大肠杆菌XL1-Blue，蓝白斑筛选阳性克隆pBS/DSP。碱裂解法快速提取pBS-DSP质粒DNA，用EcoRI、BamHI双酶切和PCR鉴定目的基因是否插入载体质粒中。
1.5 核苷酸序列分析
将挑取的pBS-DSP克隆培养扩增，用碱裂解沉淀法抽提质粒DNA，用T7 promotor引物，采用Sanger双脱氧终止法，用α-35S-dATP标记进行部分序列测定。
2 结果
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2.1 总RNA
提取的新生小鼠牙胚总RNA电泳(图1)，可见28S、18S和5S三条带，其中28S的带最亮，28S带亮度约为18S带的2倍，表明所获得的总RNA无明显的降解。
1.小鼠牙乳头组织总RNA
2.小鼠纹状体总RNA
图1 小鼠牙胚组织总RNA琼脂糖凝胶电泳
2.2 RT-PCR
牙胚组织总RNA经RT-PCR扩增后，可见大小约1.4kbp的特异扩增产物(图2)。
, 百拇医药
图2 PCR扩增产物DSP和重组质粒pBS-DSP
酶切图谱琼脂糖凝胶电泳
1.λDNA-HindⅢ
2.阴性对照(未加重组质粒模板)
3.以重组质粒为模板的DSP PCR产物
4.pBS-DSP经EcoRⅠ 和BamHⅠ双酶切
5.载体质粒pBS6.重组质粒pBS-DSP 7.λDNA-PstⅠ8.目的产物DSP 9.阴性产物(未加模板)
2.3 pBS-DSP克隆的酶谱分析(图2)
重组质粒pBS-DSP经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后为两条带(图2，第4道)，1.4 kbp的DSP和2.96kbp的载体pBS。1.4 kbp的DSP与 PCR的目的产物电泳条带(3道)平齐，2.96kbp的pBS与空载体pBS(5道)平齐。重组质粒pBS-DSP的酶切图谱与预期的完全一致。
, 百拇医药
2.4 pBS-DSP克隆的序列分析
DSP成熟肽编码区基因重组质粒pBS-DSP部分核苷酸的测序结果，可读出的200个碱基序列，与MacDougall等[6]报道的结果完全相同。
3 讨论
80年代初，Butler等[2]在研究牙本质非胶原蛋白时发现一种特殊的糖蛋白，该蛋白占DNCPs重量的5%～8%，含较高的碳水化合物(30%)和涎酸(10%)。与骨亲和素(OPN)和骨酸性糖蛋白-75(BAG-75)类似，DSP富含谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和甘氨酸，有13个潜在的酪蛋白激酶I和II的磷酸化位点。沉降平衡法和氨基酸分析发现，它由350个氨基酸组成，Mr约为53×103，Edman降解法测定其氨基末端序列为IPVPNLPL[7]。
, 百拇医药 Ritchie等[3]用单克隆抗体筛选大鼠成牙本质细胞/牙髓cDNA文库时克隆到DSP基因，序列分析表明大鼠DSP基因编码了366个氨基酸，主要为天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸和甘氨酸，与以往报道的纯化DSP的氨基酸组成大致相同，其中有6个N-相关的糖基化位点和13个潜在的磷酸化位点。但始终未能确定DSP是否属于牙本质磷蛋白家族。最近，MacDougall等[6]克隆了小鼠牙本质涎磷蛋白(Dentin Sialophosphoprotein, DSPP)，通过对其基因结构的分析，认为DSP和作为DNCPs主要成分的牙本质磷蛋白(DPP)来自于同一编码基因，是一个转录本表达产物的不同切割片段。
MacDougall等[6]用全长DSPP cDNA筛选大鼠切牙cDNA文库，发现Ritchie等[3]在阅读DSP 3'端碱基顺序时出现移码，并导致终止码。若将大鼠的DSP第363位氨基酸残基密码的第一个碱基由G改成C，则Ritchie等报道的大鼠DSP与小鼠DSPP的DSP同源性明显提高，进一步证实DSP是DSPP转录本的一个切割片段。
, http://www.100md.com
本组根据MacDougall等[6]和Ritchie等[3]报道的DSP序列设计引物，采用RT-PCR法克隆到了小鼠DSP成熟肽编码区cDNA基因片段，酶切图谱和部分核苷酸序列分析结果与MacDougall等[6]报道一致，DSP基因的克隆将为进一步表达DSP和克隆DSPP基因打下基础。
(在实验过程中得到第四军医大学口腔医学院肖明振和吴补领教授的指导，特此致谢)。
国家自然科学基金资助项目(39700160)；上海市博士后科研资助计划项目和中科院上海细胞所开放实验室资助课题
参考文献
1 郝建军.牙本质特异性蛋白的分子生物学研究进展.牙体牙髓牙周病学杂志，1998,8(4):286
, http://www.100md.com 2 Butler WT, Bhown M, Dimuzio MT et al.Noncollagenons proteins of dentin, Isolation and partial characterization of rat dentin proteins and proteoglycans using a three-step preparative method. Coll Relat Res, 1981,1:187
3 Ritchie HH, Hou H, Veis A et al. Cloning and sequence determination of rat dentin sialoprotein, a novel dentin protein. J Biol Chem, 1994,269:3698
4 郝建军, 汪平, 史俊南 等.碱性成纤维细胞生长因子对体外大鼠牙胚分化的影响.牙体牙髓牙周病学杂志,1997,7(3):180
, 百拇医药
5 郝建军.体外牙胚培养在造牙本质细胞分化研究中的应用.国外医学口腔医学分册,1996;23(1):14
6 MacDougall M, Simmons D, Luan X et al. Dentin phosphoprotein and dentin sialoprotein are cleavage products expressed from a single transcript coded by a gene on human chromosome 4. J Biol Chem, 1997,272:835
7 Butler WT，Bhown M, D'Souza RN et al. Isolation, characterization and immunolocalization of a 53-KDa dentin sialoprotein. Matrix, 1992，12:343
收稿日期：1998-09-09
修回日期：1998-12-20, 百拇医药
单位：郝建军 刘 正 第二医科大学第九人民医院，上海 200011；郭礼和 麻孙恺 费 俭 中科院上海细胞所基因工程组，上海 200031；江卫民 汪 平 史俊南 第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：牙本质基质蛋白；涎蛋白；聚合酶链反应；小鼠
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的：克隆小鼠牙本质涎蛋白(DSP)成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙胚cDNA，然后利用PCR方法，从cDNA中扩增出小鼠DSP成熟区的基因片段(约1.4 kbp)，将所得基因片段插入pBS质粒载体，转化到大肠杆菌XL1-Blue后挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA，通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pBS-DSP的酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠DSP成熟肽编码区基因，正在进行该基因的表达和活性鉴定。
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中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0039-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999；9(1)：39]
Cloning and partially sequencing of mouse dentin
sialoprotein encoding mature protein
Hao Jianjun, Ma Sunkai, Fei Jian et al
School of Stomatology, The Shanghai Secondary Medical University, Shanghai 200011
Abstract Aim: Cloning and partially sequencing of mouse dentin sialoprotein (DSP) encoding mature protein. Methods: In the study, total RNA was extracted from the tooth germs of newborn mouse by acid guanidinium thiocyanata-phenol-chloroform method, the desired DNA product was obtained from the total RNA by RT-PCR with the primers including Oligo(dt) and two gene specific primers. The segment (about 1.4 kbp) was inserted into pBluescript vector and the interesting plasmid was transformed into E. Coli host strain XL1-Blue. The double -stranded DNA of the positive clone was analyzed by restriction endonuclease mapping and DNA sequencing. Results: the restriction endonuclease map and sequence of mouse DSP encoding mature protein were consistent with those of the references appeared. Conclusion: the mouse DSP cDNA encoding mature protein was obtained for further study.
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Key Words dentin matrix proteins；sialoprotein；PCR ；mice
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999;9(1):39]
牙本质涎蛋白(Dentin Sialoprotein, DSP)是牙本质基质蛋白中的特异性蛋白之一，在牙本质形成和生物矿化方面发挥着重要的调节作用。因与骨涎蛋白的氨基酸组成相似而得名[1]。DSP是Butler等[2]于1981年首次分离纯化的一种牙本质非胶原蛋白(Dentin Non-Collageous Proteins, DNCPs)，1994年Ritchie等[3]克隆了大鼠DSP cDNA片段。本组采用逆转录PCR方法(RT-PCR)，从新生昆明小鼠磨牙牙胚组织中克隆到DSP成熟区基因片段，并测定了其部分核苷酸序列，为表达有活性的DSP蛋白奠定基础。
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1 材料和方法
1.1 小鼠磨牙牙胚的来源和获取
本实验所用5～10d龄的新生昆明小鼠(B6D2F1)来源于中科院上海细胞生物学研究所动物房。将新生小鼠拉颈处死，断头，暴露磨牙部位，挑开牙龈组织，挖取处于牙本质形成期的小鼠第一、二磨牙[4，5]，立即置液氮中冻存，-70℃下长期保存。
1.2 总RNA的提取
磨碎冻存的小鼠磨牙牙胚组织，在盛有预冷的变性缓冲液(德国宝灵曼公司)的匀浆器中充分破碎组织细胞，组织与缓冲液的比例为1:10。用异硫氰酸胍一步法从牙胚组织中提取总RNA，并进行电泳鉴定。
1.3 cDNA的合成和PCR扩增
根据Ritchie等[3]和MacDougall等[6]报道的大鼠DSP和小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)的cDNA序列，采用PC Gene 设计PCR扩增的两条引物。为了获得完整的小鼠DSP成熟区基因，将5'和3'端引物向两侧延伸100多碱基，5'引物碱基序列为：5'AAGAATTCTCAGCCTGGAAAGGGAGATAAGG3'带有EcoRI酶切位点；3'端的引物序列为5'AAGGATCCGTCATCGAACTCGTAACTGTCATGC3'，带有BamHI酶切识别序列。用Gibco BRL公司的Super Script TM试剂盒，按其说明进行逆转录(RT)，合成cDNA第一链，以其为模板，PCR扩增出小鼠DSP成熟区基因片段(美国MJ Research公司 PTC-150型PCR仪)。Taq Plus Ⅱ DNA聚合酶购于中科院上海生理研究所生工公司。
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1.4 PCR产物的克隆及酶谱分析
PCR产物于10g/L低熔点琼脂糖凝胶上电泳回收，用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段(Promega公司)对PCR产物进行部分补平，对载体质粒pBluescript KS(pBS)用 SmaI酶切消化，平端连接目的基因片段和酶切质粒载体，转化大肠杆菌XL1-Blue，蓝白斑筛选阳性克隆pBS/DSP。碱裂解法快速提取pBS-DSP质粒DNA，用EcoRI、BamHI双酶切和PCR鉴定目的基因是否插入载体质粒中。
1.5 核苷酸序列分析
将挑取的pBS-DSP克隆培养扩增，用碱裂解沉淀法抽提质粒DNA，用T7 promotor引物，采用Sanger双脱氧终止法，用α-35S-dATP标记进行部分序列测定。
2 结果
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2.1 总RNA
提取的新生小鼠牙胚总RNA电泳(图1)，可见28S、18S和5S三条带，其中28S的带最亮，28S带亮度约为18S带的2倍，表明所获得的总RNA无明显的降解。
1.小鼠牙乳头组织总RNA
2.小鼠纹状体总RNA
图1 小鼠牙胚组织总RNA琼脂糖凝胶电泳
2.2 RT-PCR
牙胚组织总RNA经RT-PCR扩增后，可见大小约1.4kbp的特异扩增产物(图2)。
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图2 PCR扩增产物DSP和重组质粒pBS-DSP
酶切图谱琼脂糖凝胶电泳
1.λDNA-HindⅢ
2.阴性对照(未加重组质粒模板)
3.以重组质粒为模板的DSP PCR产物
4.pBS-DSP经EcoRⅠ 和BamHⅠ双酶切
5.载体质粒pBS6.重组质粒pBS-DSP 7.λDNA-PstⅠ8.目的产物DSP 9.阴性产物(未加模板)
2.3 pBS-DSP克隆的酶谱分析(图2)
重组质粒pBS-DSP经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后为两条带(图2，第4道)，1.4 kbp的DSP和2.96kbp的载体pBS。1.4 kbp的DSP与 PCR的目的产物电泳条带(3道)平齐，2.96kbp的pBS与空载体pBS(5道)平齐。重组质粒pBS-DSP的酶切图谱与预期的完全一致。
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2.4 pBS-DSP克隆的序列分析
DSP成熟肽编码区基因重组质粒pBS-DSP部分核苷酸的测序结果，可读出的200个碱基序列，与MacDougall等[6]报道的结果完全相同。
3 讨论
80年代初，Butler等[2]在研究牙本质非胶原蛋白时发现一种特殊的糖蛋白，该蛋白占DNCPs重量的5%～8%，含较高的碳水化合物(30%)和涎酸(10%)。与骨亲和素(OPN)和骨酸性糖蛋白-75(BAG-75)类似，DSP富含谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和甘氨酸，有13个潜在的酪蛋白激酶I和II的磷酸化位点。沉降平衡法和氨基酸分析发现，它由350个氨基酸组成，Mr约为53×103，Edman降解法测定其氨基末端序列为IPVPNLPL[7]。
, 百拇医药 Ritchie等[3]用单克隆抗体筛选大鼠成牙本质细胞/牙髓cDNA文库时克隆到DSP基因，序列分析表明大鼠DSP基因编码了366个氨基酸，主要为天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸和甘氨酸，与以往报道的纯化DSP的氨基酸组成大致相同，其中有6个N-相关的糖基化位点和13个潜在的磷酸化位点。但始终未能确定DSP是否属于牙本质磷蛋白家族。最近，MacDougall等[6]克隆了小鼠牙本质涎磷蛋白(Dentin Sialophosphoprotein, DSPP)，通过对其基因结构的分析，认为DSP和作为DNCPs主要成分的牙本质磷蛋白(DPP)来自于同一编码基因，是一个转录本表达产物的不同切割片段。
MacDougall等[6]用全长DSPP cDNA筛选大鼠切牙cDNA文库，发现Ritchie等[3]在阅读DSP 3'端碱基顺序时出现移码，并导致终止码。若将大鼠的DSP第363位氨基酸残基密码的第一个碱基由G改成C，则Ritchie等报道的大鼠DSP与小鼠DSPP的DSP同源性明显提高，进一步证实DSP是DSPP转录本的一个切割片段。
, http://www.100md.com
本组根据MacDougall等[6]和Ritchie等[3]报道的DSP序列设计引物，采用RT-PCR法克隆到了小鼠DSP成熟肽编码区cDNA基因片段，酶切图谱和部分核苷酸序列分析结果与MacDougall等[6]报道一致，DSP基因的克隆将为进一步表达DSP和克隆DSPP基因打下基础。
(在实验过程中得到第四军医大学口腔医学院肖明振和吴补领教授的指导，特此致谢)。
国家自然科学基金资助项目(39700160)；上海市博士后科研资助计划项目和中科院上海细胞所开放实验室资助课题
参考文献
1 郝建军.牙本质特异性蛋白的分子生物学研究进展.牙体牙髓牙周病学杂志，1998,8(4):286
, http://www.100md.com 2 Butler WT, Bhown M, Dimuzio MT et al.Noncollagenons proteins of dentin, Isolation and partial characterization of rat dentin proteins and proteoglycans using a three-step preparative method. Coll Relat Res, 1981,1:187
3 Ritchie HH, Hou H, Veis A et al. Cloning and sequence determination of rat dentin sialoprotein, a novel dentin protein. J Biol Chem, 1994,269:3698
4 郝建军, 汪平, 史俊南 等.碱性成纤维细胞生长因子对体外大鼠牙胚分化的影响.牙体牙髓牙周病学杂志,1997,7(3):180
, 百拇医药
5 郝建军.体外牙胚培养在造牙本质细胞分化研究中的应用.国外医学口腔医学分册,1996;23(1):14
6 MacDougall M, Simmons D, Luan X et al. Dentin phosphoprotein and dentin sialoprotein are cleavage products expressed from a single transcript coded by a gene on human chromosome 4. J Biol Chem, 1997,272:835
7 Butler WT，Bhown M, D'Souza RN et al. Isolation, characterization and immunolocalization of a 53-KDa dentin sialoprotein. Matrix, 1992，12:343
收稿日期：1998-09-09
修回日期：1998-12-20, 百拇医药