人牙龈成纤维细胞系的建立及其生物学特性
作者：刘 斌 吴军正 司徒镇强 陈建元
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：牙龈成纤维细胞；细胞系；细胞培养
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的: 建立人牙龈成纤维细胞系并观察其生物学特性。方法: 用组织块法培养细胞, 用形态学、免疫组化染色、染色体分析等方法鉴定细胞, 通过活细胞观察、生长曲线测定及MTT比色实验研究细胞体外生长特性。结果: 20 例原代培养, 成活率90%。培养细胞呈梭形, 胞浆波形丝蛋白阳性, 能合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原及纤维粘连蛋白, 具有正常二倍体核型, 体外贴壁快, 生长迅速, 细胞寿命为(250.7±113.3)d。结论:本实验建立的细胞系符合人牙龈正常二倍体成纤维细胞系。
, 百拇医药
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0034-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：34]
Establishment and biological features of human
gingival fibroblast cell lines
Liu Bin, Wu Junzheng, Situ Zhenqiang et al
Schoool of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an, 710032
Abstract Aim: To establish the human gingival fibroblast( HGF) cell lines and to investigate their biological features. Methods:Cells were cultured using a routine method of tissue culture; cells were identifyed by the methods of morphology, immunohistochemistry, chromasome analysis, and so on; the in vitro growth features of cells were examined with microscope observation, MTT colorimetric assay and analysis of cell growth curve. Results: The HGF were successfully cultured from 18 out of the 20 biopsies of gingiva. Cultured cells were spindle-shaped, a positive reaction to antibodies against vimentin, fibronectin,type Ⅰ/Ⅲ collagen, and normal diploid karyotype. The attachment and the proliferation of HGF in vitro were rapid, and the in vitro lifespan was (250.7±113.3) days. Conclusions: The cell lines estblished in our lab are proved to be human gingival fibroblasts.
, 百拇医药
Key words gingival fibroblasts；cell line；cell culture
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999;9(1):34]
牙龈成纤维细胞是牙龈结缔组织中主要的间质细胞, 担负着合成细胞外基质的功能, 如Ⅰ型和Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白(Fn)等, 在许多生理和病理过程中起着重要作用。近年来, 许多学者利用牙龈成纤维细胞体外培养模型, 在牙周组织疾病的发病机制及治疗方面进行了有益的探索[1～3]，但对人牙龈成纤维细胞的生物学特性的报道尚不多。本文报道人牙龈成纤维细胞(huam gingival fibroblast, HGF)系的建立及其生物学特性。
1 材料和方法
1.1 取材及细胞培养
, http://www.100md.com
无菌收集20例因正畸或阻生拔除的正常牙齿, 切取少量牙龈组织, 按组织块贴壁法,用含100ml/L胎牛血清的RPMI1640培养液, 在37℃、50ml/L CO2和饱和湿度条件下培养。
1.2 形态观察
用倒置显微镜观察。
1.3 免疫组织化学染色
应用9种抗体染色：①鼠抗人波形丝蛋白抗体43βE; ②鼠抗人角蛋白抗体34βE12; ③鼠抗人胶质蛋白抗体GFA8; ④鼠抗人神经原蛋白抗体31γA11; ⑤鼠抗人结蛋白抗体; ⑥兔抗人第Ⅷ凝血因子抗体; ⑦兔抗人Ⅰ型胶原抗体; ⑧兔抗人Ⅲ型胶原抗体; ⑨兔抗人Fn抗体。①～⑥由美国华盛顿大学医院病理科提供; ⑦和⑧由第四军医大学病理教研室提供; ⑨为上海生物制品研究所产品。小鼠抗体用美国Vector公司ABC试剂盒染色,兔抗体用军事医学科学院PAP试剂盒染色。
, 百拇医药
1.4 核型检测
常规空气干燥法。
1.5 支原体检查
常规地依红染色法。
1.6 细胞冻存与复苏
按常规方法进行。
1.7 细胞贴壁观察
倒置显微镜下观察活细胞的贴壁过程, 并用计数法测定细胞贴壁率。
1.8 细胞生长测定
光镜下计数HE染色细胞核分裂指数; 用计数法测定不同接种密度时的细胞生长曲线; 用MTT比色法测定不同血清浓度对细胞生长的影响。
, 百拇医药
2 结果
2.1 HGF原代培养的特点
20例原代培养成活率为90%。培养第4～7天, 少数梭形细胞从组织块边缘长出并逐渐形成细胞晕。原代细胞生长平均18.4d后即可汇合成致密单层细胞。
2.2 形态特征
HGF呈梭形或星形, 胞浆突2～4个, 胞浆丰满; 细胞核为1个, 呈椭园或园形。细胞密度较低时细胞交织成网状, 密度较高时细胞排列成束状或旋涡状(图1)。
图1 体外培养的HGF (40×)
2.3 免疫组化染色结果
, http://www.100md.com
HGF对波形丝蛋白抗体、Ⅰ型、Ⅲ型胶原抗体及Fn 抗体呈阳性反应, 对其它6种抗体呈阴性反应, 说明HGF含有间质细胞特有的波形丝蛋白并具备成纤维细胞合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原及Fn的功能，其结果与标准参照细胞系2BS的染色结果一致。
2.4 细胞核型特点
HGF染色体众数为46, 频数大于75%, 未见染色体结构异常, 符合人正常二倍体细胞系的特征。
2.5 支原体染色结果
HGF中支原体荧光染色阴性。
2.6 冻存与复苏后的细胞活力
HGF冻存1年以上再复苏, 活细胞数>85%。
2.7 细胞贴壁特性
, http://www.100md.com
HGF在传代后15～30min, 大约有半数细胞贴壁, 少数细胞开始铺展, 呈煎鸡蛋样; 1h后, 细胞贴壁率达87.5%, 部分细胞呈短梭形; 4h后, 细胞贴壁率为97.1%, 细胞完全铺展, 呈梭形或星形; 24h时, 细胞交织成网状。
2.8 细胞生长特点
细胞在传代后第1天生长较缓慢; 从第2天开始细胞分裂增殖活跃, 呈对数生长, 一般在第2～3天细胞分裂指数达高峰, 平均峰值为24.8‰, 细胞群体倍增时间为(50.9±5.1)h; 当细胞达到饱和密度时, 细胞生长趋于停滞状态, 细胞生长曲线呈“滞缓-对数生长-平台”模式(图2)。细胞平均传代时间为3.94d。培养液中的血清浓度对HGF生长有一定的影响, 当血清浓度低于10%时, 细胞生长缓慢(图3)
图2 不同接种密度下HGF的体外生长曲线
, http://www.100md.com
● 1×107/L; ○ 5×107/L; ▲ 10×107/
图3 不同血清浓度对HGF体外生长的影响
● 20ml/L FCS；○ 100ml/L FCS；▲ 150ml/L FCS；△200ml/L FCS
2.9 细胞寿命特征
6例HGF体外长期培养过程的基本特性见附表。HGF 体外生命过程呈现3个时期: ①适应期，是从原代培养开始到稳定传代培养的时期, 平均为19.0d, 这一时期是细胞适应体外培养条件的过程,生长不稳定。 ②活跃增殖期，是细胞能持续稳定分裂繁殖的时期, 平均活跃期代数范围是2.7～33.3代, 这一时期细胞形态好, 生长迅速, 传代周期规律。③衰老期，是细胞走向衰亡的过程, 细胞逐渐呈现衰老征象, 细胞表面粗糙, 胞浆突变细, 胞浆内颗粒物和空泡增多, 核分裂相明显减少, 细胞增殖缓慢, 传代时间显著延长至8～21d, 细胞最终不再长成致密单层而发生凋亡。细胞最高可传代数平均为(40.2±13.6)代, 平均寿命为(250.7±113.3)d。
, http://www.100md.com
附表 6例HGF体外长期培养特性的观察 细胞系
适应期(d)
活跃增殖期(代数)
最大倍增代数
寿命(d)
HGF1
10
3～24
30
236
HGF2
19
, 百拇医药 2～24
28
149
HGF3
20
3～38
44
296
HGF4
16
2～40
51
198
, 百拇医药 HGF5
20
3～25
28
169
HGF6
29
3～49
60
456
3 讨论
本实验采用体外组织块培养技术成功地建立了人牙龈成纤维细胞系, 通过形态学、免疫组织化学染色和染色体分析等方法鉴定, HGF 符合人正常二倍体成纤维细胞的特征, 并且没有支原体的污染, 在液氮中长期保存仍能复苏成活。HGF 的体外培养及其生物学行为有以下几个特点:
, http://www.100md.com
(1) 原代培养成活率高。
(2) 细胞呈梭形, 排列有方向性。
(3) 细胞贴壁快, 一般接种4h后, 97.1%的细胞完成贴壁和铺展。
(4) 细胞呈单层生长, 增殖迅速, 按1:2传代, 一般4d可传一代。
(5) 细胞生长具有接种密度依赖性和血清浓度依赖性。进行实验时, 细胞接种密度以5×107/L为宜, 培养液血清浓度以10%为宜。
(6) 细胞活跃增殖期长, 稳定传代范围一般为3～33代, 并保持正常二倍体染色体核型。
(7) 具有体外合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原及Fn的功能。
(8) 细胞具有有限生命期, 最高可传代数平均为40.2代, 平均寿命为250.7d。
, 百拇医药
本实验建立的HGF具有广泛的用途,不仅可作为牙周组织疾病研究的体外细胞模型,而且可为临床治疗牙周病提供复合细胞型材料, 此外, 还可用于齿科材料的细胞毒性检测实验, 抗衰老药物研究, 环境致癌因子检测实验等。 参考文献
1 Ohazama A, Isatsu K, Hatayama J et al. Periodontal tissueregeneration using fibrin tissue adhesion material in vitro and in vivo. Periodont Clin Investig, 1996, 18(1):26
2 Kasasa SC, Soory M. The synthesis of 5- alpha- dihydrotestosteronefrom androgens by human gingival tissue and fibroblasts in culture inresponse to TGF-beta and PDGF. J Periodont Res, 1996, 31(5):313
3 Feng F, Liu CM, Hsu WC et al. Long- term effects of gingivalfibroblast-coated hydroxylapitite graf on periodontal osseous defects. J Formos Med Assoc, 1995, 94(8):494
收稿日期：1998-02-09
修回日期：1998-08-31, 百拇医药
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：牙龈成纤维细胞；细胞系；细胞培养
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的: 建立人牙龈成纤维细胞系并观察其生物学特性。方法: 用组织块法培养细胞, 用形态学、免疫组化染色、染色体分析等方法鉴定细胞, 通过活细胞观察、生长曲线测定及MTT比色实验研究细胞体外生长特性。结果: 20 例原代培养, 成活率90%。培养细胞呈梭形, 胞浆波形丝蛋白阳性, 能合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原及纤维粘连蛋白, 具有正常二倍体核型, 体外贴壁快, 生长迅速, 细胞寿命为(250.7±113.3)d。结论:本实验建立的细胞系符合人牙龈正常二倍体成纤维细胞系。
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中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0034-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：34]
Establishment and biological features of human
gingival fibroblast cell lines
Liu Bin, Wu Junzheng, Situ Zhenqiang et al
Schoool of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an, 710032
Abstract Aim: To establish the human gingival fibroblast( HGF) cell lines and to investigate their biological features. Methods:Cells were cultured using a routine method of tissue culture; cells were identifyed by the methods of morphology, immunohistochemistry, chromasome analysis, and so on; the in vitro growth features of cells were examined with microscope observation, MTT colorimetric assay and analysis of cell growth curve. Results: The HGF were successfully cultured from 18 out of the 20 biopsies of gingiva. Cultured cells were spindle-shaped, a positive reaction to antibodies against vimentin, fibronectin,type Ⅰ/Ⅲ collagen, and normal diploid karyotype. The attachment and the proliferation of HGF in vitro were rapid, and the in vitro lifespan was (250.7±113.3) days. Conclusions: The cell lines estblished in our lab are proved to be human gingival fibroblasts.
, 百拇医药
Key words gingival fibroblasts；cell line；cell culture
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999;9(1):34]
牙龈成纤维细胞是牙龈结缔组织中主要的间质细胞, 担负着合成细胞外基质的功能, 如Ⅰ型和Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白(Fn)等, 在许多生理和病理过程中起着重要作用。近年来, 许多学者利用牙龈成纤维细胞体外培养模型, 在牙周组织疾病的发病机制及治疗方面进行了有益的探索[1～3]，但对人牙龈成纤维细胞的生物学特性的报道尚不多。本文报道人牙龈成纤维细胞(huam gingival fibroblast, HGF)系的建立及其生物学特性。
1 材料和方法
1.1 取材及细胞培养
, http://www.100md.com
无菌收集20例因正畸或阻生拔除的正常牙齿, 切取少量牙龈组织, 按组织块贴壁法,用含100ml/L胎牛血清的RPMI1640培养液, 在37℃、50ml/L CO2和饱和湿度条件下培养。
1.2 形态观察
用倒置显微镜观察。
1.3 免疫组织化学染色
应用9种抗体染色：①鼠抗人波形丝蛋白抗体43βE; ②鼠抗人角蛋白抗体34βE12; ③鼠抗人胶质蛋白抗体GFA8; ④鼠抗人神经原蛋白抗体31γA11; ⑤鼠抗人结蛋白抗体; ⑥兔抗人第Ⅷ凝血因子抗体; ⑦兔抗人Ⅰ型胶原抗体; ⑧兔抗人Ⅲ型胶原抗体; ⑨兔抗人Fn抗体。①～⑥由美国华盛顿大学医院病理科提供; ⑦和⑧由第四军医大学病理教研室提供; ⑨为上海生物制品研究所产品。小鼠抗体用美国Vector公司ABC试剂盒染色,兔抗体用军事医学科学院PAP试剂盒染色。
, 百拇医药
1.4 核型检测
常规空气干燥法。
1.5 支原体检查
常规地依红染色法。
1.6 细胞冻存与复苏
按常规方法进行。
1.7 细胞贴壁观察
倒置显微镜下观察活细胞的贴壁过程, 并用计数法测定细胞贴壁率。
1.8 细胞生长测定
光镜下计数HE染色细胞核分裂指数; 用计数法测定不同接种密度时的细胞生长曲线; 用MTT比色法测定不同血清浓度对细胞生长的影响。
, 百拇医药
2 结果
2.1 HGF原代培养的特点
20例原代培养成活率为90%。培养第4～7天, 少数梭形细胞从组织块边缘长出并逐渐形成细胞晕。原代细胞生长平均18.4d后即可汇合成致密单层细胞。
2.2 形态特征
HGF呈梭形或星形, 胞浆突2～4个, 胞浆丰满; 细胞核为1个, 呈椭园或园形。细胞密度较低时细胞交织成网状, 密度较高时细胞排列成束状或旋涡状(图1)。
图1 体外培养的HGF (40×)
2.3 免疫组化染色结果
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HGF对波形丝蛋白抗体、Ⅰ型、Ⅲ型胶原抗体及Fn 抗体呈阳性反应, 对其它6种抗体呈阴性反应, 说明HGF含有间质细胞特有的波形丝蛋白并具备成纤维细胞合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原及Fn的功能，其结果与标准参照细胞系2BS的染色结果一致。
2.4 细胞核型特点
HGF染色体众数为46, 频数大于75%, 未见染色体结构异常, 符合人正常二倍体细胞系的特征。
2.5 支原体染色结果
HGF中支原体荧光染色阴性。
2.6 冻存与复苏后的细胞活力
HGF冻存1年以上再复苏, 活细胞数>85%。
2.7 细胞贴壁特性
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HGF在传代后15～30min, 大约有半数细胞贴壁, 少数细胞开始铺展, 呈煎鸡蛋样; 1h后, 细胞贴壁率达87.5%, 部分细胞呈短梭形; 4h后, 细胞贴壁率为97.1%, 细胞完全铺展, 呈梭形或星形; 24h时, 细胞交织成网状。
2.8 细胞生长特点
细胞在传代后第1天生长较缓慢; 从第2天开始细胞分裂增殖活跃, 呈对数生长, 一般在第2～3天细胞分裂指数达高峰, 平均峰值为24.8‰, 细胞群体倍增时间为(50.9±5.1)h; 当细胞达到饱和密度时, 细胞生长趋于停滞状态, 细胞生长曲线呈“滞缓-对数生长-平台”模式(图2)。细胞平均传代时间为3.94d。培养液中的血清浓度对HGF生长有一定的影响, 当血清浓度低于10%时, 细胞生长缓慢(图3)
图2 不同接种密度下HGF的体外生长曲线
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● 1×107/L; ○ 5×107/L; ▲ 10×107/
图3 不同血清浓度对HGF体外生长的影响
● 20ml/L FCS；○ 100ml/L FCS；▲ 150ml/L FCS；△200ml/L FCS
2.9 细胞寿命特征
6例HGF体外长期培养过程的基本特性见附表。HGF 体外生命过程呈现3个时期: ①适应期，是从原代培养开始到稳定传代培养的时期, 平均为19.0d, 这一时期是细胞适应体外培养条件的过程,生长不稳定。 ②活跃增殖期，是细胞能持续稳定分裂繁殖的时期, 平均活跃期代数范围是2.7～33.3代, 这一时期细胞形态好, 生长迅速, 传代周期规律。③衰老期，是细胞走向衰亡的过程, 细胞逐渐呈现衰老征象, 细胞表面粗糙, 胞浆突变细, 胞浆内颗粒物和空泡增多, 核分裂相明显减少, 细胞增殖缓慢, 传代时间显著延长至8～21d, 细胞最终不再长成致密单层而发生凋亡。细胞最高可传代数平均为(40.2±13.6)代, 平均寿命为(250.7±113.3)d。
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附表 6例HGF体外长期培养特性的观察 细胞系
适应期(d)
活跃增殖期(代数)
最大倍增代数
寿命(d)
HGF1
10
3～24
30
236
HGF2
19
, 百拇医药 2～24
28
149
HGF3
20
3～38
44
296
HGF4
16
2～40
51
198
, 百拇医药 HGF5
20
3～25
28
169
HGF6
29
3～49
60
456
3 讨论
本实验采用体外组织块培养技术成功地建立了人牙龈成纤维细胞系, 通过形态学、免疫组织化学染色和染色体分析等方法鉴定, HGF 符合人正常二倍体成纤维细胞的特征, 并且没有支原体的污染, 在液氮中长期保存仍能复苏成活。HGF 的体外培养及其生物学行为有以下几个特点:
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(1) 原代培养成活率高。
(2) 细胞呈梭形, 排列有方向性。
(3) 细胞贴壁快, 一般接种4h后, 97.1%的细胞完成贴壁和铺展。
(4) 细胞呈单层生长, 增殖迅速, 按1:2传代, 一般4d可传一代。
(5) 细胞生长具有接种密度依赖性和血清浓度依赖性。进行实验时, 细胞接种密度以5×107/L为宜, 培养液血清浓度以10%为宜。
(6) 细胞活跃增殖期长, 稳定传代范围一般为3～33代, 并保持正常二倍体染色体核型。
(7) 具有体外合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原及Fn的功能。
(8) 细胞具有有限生命期, 最高可传代数平均为40.2代, 平均寿命为250.7d。
, 百拇医药
本实验建立的HGF具有广泛的用途,不仅可作为牙周组织疾病研究的体外细胞模型,而且可为临床治疗牙周病提供复合细胞型材料, 此外, 还可用于齿科材料的细胞毒性检测实验, 抗衰老药物研究, 环境致癌因子检测实验等。 参考文献
1 Ohazama A, Isatsu K, Hatayama J et al. Periodontal tissueregeneration using fibrin tissue adhesion material in vitro and in vivo. Periodont Clin Investig, 1996, 18(1):26
2 Kasasa SC, Soory M. The synthesis of 5- alpha- dihydrotestosteronefrom androgens by human gingival tissue and fibroblasts in culture inresponse to TGF-beta and PDGF. J Periodont Res, 1996, 31(5):313
3 Feng F, Liu CM, Hsu WC et al. Long- term effects of gingivalfibroblast-coated hydroxylapitite graf on periodontal osseous defects. J Formos Med Assoc, 1995, 94(8):494
收稿日期：1998-02-09
修回日期：1998-08-31, 百拇医药