人牙髓细胞Smad2基因MH2结构域的cDNA 克隆和序列测定*
作者：陈 健 牛忠英 药立波 范金水
单位：陈 健 牛忠英 第四军医大学：1.口腔医学院；药立波 范金水 全军分子生物学重点实验室；陕西 西安 710032
关键词：人牙髓细胞；Smad2；MH2结构域；克隆；序列测定
人牙髓细胞Smad2基因MH2结构域 的cDNA 克隆和序列测定 摘要 目的：从人牙髓细胞内克隆转化生长因子-β特异的细胞内信号转导基因Smad2的功能性结构域——MH2结构域。方法：原代培养人牙髓细胞，从培养的细胞中提取总RNA，逆转录合成cDNA第1条链；设计内、外侧两对引物，进行巢式PCR，扩增Smad2基因MH2结构域的基因片段；将所获得的基因片段定向插入pBluscript Ⅱ SK(+)载体；转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆并鉴定；用PE317-A型自动测序仪进行核苷酸序列测定分析。结果：测序结果与国外从人肾cDNA文库中克隆的基因序列完全一致。结论：首次从人牙髓细胞中克隆成功Smad2基因的MH2结构域，证实了Smad2基因在人牙髓细胞中的表达；提示人牙髓细胞内存在Smad2信号转导途径，TGF-β对人牙髓细胞分化的调节可能是通过Smad2信号转导途径实现的。
, 百拇医药
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-00014-04
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999, 9(1)：14]
cDNA cloning and sequencing of MH2 domain of Smad2
from human dental pulp cells
Chen Jian, Niu Zhongying, Yao Libo et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University， Xi'an 710032
Abstract Aim: cDNA cloning and sequencing of MH2 domain of Smad2 from human dental pulp cells. Methods: Total RNA was isolated from primary cultured human dental pulp cells and reversely transcribed into single-stranded cDNA. The desired DNA product was obtained by PCR with four gene specific primers. The segment was inserted into pBluescript Ⅱ SK (+) vector and the result plasmid was transformed into E.coli JM109.The double-stranded cDNA of positive clone was sequenced by PE317-A AUTOMATIC SEQUENCING. Results: The sequence of MH2 domain of Smad2 cloned from dental pulp cells was consistent with that cloned from human kidney cDNA library. Conclusions: The MH2 domain cDNA of Smad2 was obtained from human dental pulp cells for the first time. The result indicates that TGF-β Signaling maybe mediated by Smad2 in human dental pulp cells.
, http://www.100md.com
Key words human dental pulp cell；Smad2；MH2 domain；Cloning；Sequencing
[Chinese Journal of Conervative Dentistry, 1999,9(1):14]
转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)在成牙本质细胞分化和第三期牙本质的形成过程中起着重要的、甚至是关键性的调控作用[1～7]。但其作用的分子机制，即TGF-β在成牙本质细胞和牙髓细胞内的信号转导途径及其对基因表达的调控方式一直未能阐明。1996年，国外从人肾cDNA文库中克隆成功一种特异地转导TGF-β信号的细胞内信号转导基因Smad2[8]。Smad2基因的发现，是TGF-β信号转导研究的一个突破性的进展。
目前，有关人牙髓细胞内是否存在Smad2基因的表达和Smad2基因在第三期牙本质形成中的作用等研究的报道甚少。本文采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法，从培养的人牙髓细胞中克隆Smad2基因的功能性结构域——MH2结构域，并测定其核苷酸序列，旨在从细胞内信号转导的水平探索牙髓细胞分化和第三期牙本质形成的分子机制。
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1 材料和方法
1.1 组织块法原代培养人牙髓细胞
选择健康青少年(13岁，男)因正畸拔除的上颌第二前磨牙，取其正常的牙髓组织，组织块法[9]原代培养人牙髓细胞。培养液为含15%胎牛血清(FCS)的DMEM培养液(Gibco,USA)。将第6代细胞用于实验。
1.2 总RNA的提取
收集约1×105个第6代人牙髓细胞，用Total RNA Extraction System(华美公司)提取总RNA,溶于35μl 去离子水中。取5μl RNA，加入500μl 去离子水稀释，分光光度法测定其A260和A280，以确定RNA的纯度和含量。
1.3 cDNA的合成
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取5μl RNA用1st Strand cDNA Synthesis kit for RT-PCR(AMV)(宝灵曼公司，德国)合成cDNA第一条链。
1.4 巢式PCR
通过因特网联网检索GenBank, 获得Smad2 cDNA序列。以Smad2基因的MH2结构域为模板，用Oligo软件辅助设计引物。共设计外侧、内侧两对引物，分别为P1、P2和P3、P4。P1(外侧5'端引物)：5'-CTCCTACTACGCTTTCCCCTGTT-3';P2(外侧3'端引物)：5'-AGAAGAGTTGTTACATTAAGTCTTT-3';P3(内侧5'端引物)： 5'-CCGAATTCATAGCTTGGATTTACAGCCAGT-3'，带EcoRⅠ酶切位点；P4(内侧3'端引物)：5'-GTCTCTCGAGTTCCATTGGACTTGATTGGTGAAG-3'，带XhoⅠ酶切位点。合成引物(赛百盛公司)。用PWO DNA polymerase(宝灵曼公司，德国)进行巢式PCR。第一轮反应：10×PCR buffer(20mmol/L MgSO4)5μl,dNTP 4μl,PWO 酶0.6μl,cDNA模板2μl,引物P1、P2各3μl，加水至50μl。反应条件：94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸50s，30个循环。以第一轮PCR的产物为模板，P3、P4为引物，进行第二轮PCR。反应条件：94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸50s，5个循环；94℃变性30s,63℃退火45s，72℃延伸50s，30个循环。
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1.5 PCR产物的回收、克隆
第二轮PCR产物于10g/L低熔点琼脂糖凝胶上电泳，用AdvantageTM PCR-Pure kit (Clontech Labratories Inc. USA)回收目的基因。EcoRⅠ和XhoⅠ分别对回收的目的基因和载体pBluescript Ⅱ SK(+)进行双酶切消化，连接目的基因和载体，转化大肠杆菌JM109，蓝白筛选阳性克隆pBS/S2MH2，用EcoRⅠ和XhoⅠ进行酶切鉴定。
1.6 cDNA序列测定
扩增已鉴定的阳性克隆pBS/S2MH2,用Wizard Minipreps DNA Purification System(Promega公司)提取质粒，用PE317-A型DNA自动测序仪(PE公司，USA)测定cDNA序列。
2 结果
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2.1 总RNA
共提取获得35μl RNA，取5μlRNA ,加500μl去离子水稀释。分光光度法测定RNA纯度和含量。A260=0.129，A280=0.065, A260/ A280 =1.969。说明提取获得18.235μg纯度较高的总RNA。
2.2 RT-PCR产物
人牙髓细胞总RNA经逆转录合成cDNA，进行巢式PCR。第二轮PCR产物于10g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳，可见大小约 673bp的特异扩增产物(图1)
图1 PCR扩增产物
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(a.扩增的目的基因 b.Marker：λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)
2.3 pBS/S2MH2克隆的核苷酸序列测定
PE317-A型自动测序仪测定pBS/S2MH2重组载体中插入基因的核苷酸序列，结果与已发表的从人肾cDNA文库中克隆的Smad2基因MH2结构域的核苷酸序列完全一致，未发现任何突变(图2，图3)。
图2 第67～664bp是从人牙髓细胞中克隆的Smad2基因MH2结构域的测序结果
(测序载体为pBluescript Ⅱ SK，反向插入)
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图3 人牙髓细胞Smad2基因MH2结构域的cDNA序列全长597bp(含终止码taa)，编码198个氨基酸
3 讨论
TGF-β是一种在细胞的增殖、分化和损伤愈合等多种生理病理过程中起重要调控作用的细胞因子。牙本质基质中存在TGF-β[1]。龋病破坏釉质、牙本质，导致牙本质基质中的TGF-β释放并作用于成牙本质细胞，促进第三期牙本质的形成[2]。正常牙髓中TGF-β染色阴性而牙髓炎早期成牙本质细胞即呈阳性，牙髓细胞周围亦呈阳性染色。而且，染色的强度随炎症的发展而改变[3]。说明TGF-β通过自分泌和旁分泌途径作用于成牙本质细胞和牙髓细胞。研究证实，TGF-β能够促进人牙髓细胞的DNA合成，调节其碱性磷酸酶(alakline phosphatase, ALP)活性，并显著促进人牙髓细胞合成纤维粘连蛋白(fibronectin ,FN)等细胞外基质[4～6]。同时，Toyono等[7]研究证实，牙髓细胞表达TGF-β的Ⅰ型、Ⅱ型受体。这些研究都说明，在牙髓细胞向成牙本质细胞分化和第三期牙本质的形成过程中，TGF-β起着重要的调控作用。但TGF-β作用的分子机制,即TGF-β在牙髓细胞和成牙本质细胞内的信号转导途径一直未能阐明。
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1996年Eppert等学者从人肾cDNA文库中克隆成功一种特异转导TGF-β信号的细胞内信号基因Smad2。Smad2基因全长1605bp，包含一个编码467个氨基酸的完整开放读框。在结构上， Smad2具有两个结构域，MH1结构域(Mad homology 1 domain)和MH2结构域(Mad homology 2 domain)。研究证实，Smad2基因的表达产物是细胞内TGF-β受体下游的信号转导分子，特异地将TGF-β的信号由细胞浆转导入细胞核内，调控基因表达。MH2结构域是其功能性结构域[8,10,11]
本研究采用RT-PCR的方法从人牙髓细胞中克隆成功Smad2基因的功能性结构域——MH2结构域。所得基因序列与Eppert从人肾cDNA文库中获得的Smad2基因的MH2结构域完全一致，无任何突变。这一结果证实，人牙髓细胞内存在Smad2基因表达，提示人牙髓细胞内存在Smad2信号转导途径，TGF-β对人牙髓细胞分化的调控很可能是通过Smad2信号转导途径实现的。所获得的MH2基因克隆将有助于进一步研究Smad2的功能、作用方式和寻找其下游分子并阐明Smad2在第三期牙本质形成中的作用。
, 百拇医药
实验过程中，为确保PCR扩增反应的特异性和精确性，减少碱基的错配，采用了具有3'→5'外切活性的DNA聚合酶Pwo DNA polymerase ,并设计了内、外两对引物，进行巢式PCR，取得了比较理想的实验结果。
当前，在医学领域，对疾病的发病机理和损伤修复的研究已逐步深入到细胞内信号转导水平，即研究从细胞膜到细胞核的信号转导途径及其相互作用，信号转导基因的表达，可逆磷酸化的变化及其与转录因子的相互作用，对目的基因表达的调控直至细胞产生整体应答反应的分子机制。本研究首次证实TGF-β特异的信号转导基因Smad2在人牙髓细胞内的表达，将有助于从细胞内信号转导水平揭示牙髓细胞分化和第三期牙本质形成的分子机制。
(致谢； 本实验是在史俊南教授和肖明振教授的关怀、指导下完成的。赵书芳博士和陈新梅博士在细胞培养过程中给予了具体的指导和帮助。同时，本实验的完成得到了全军分子生物学重点实验室和口腔内科学重点实验室各位老师的关心和帮助，在此表示衷心的感谢。)
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助项目(39870789)
参考文献
1 Cassidy N,Fahey M,Prine SS et al. Comparative analysis of transforming growth factor-β isoform 1-3 in human and rabbit dentine matrices. Archs Oral Biol,1997, 42(3):219
2 Simth AJ,Cassidy N,Perry H et al.Reactionary dentinogenesis.Int J Dev Biol,1995, 39(1):273
3 果树林，文玲英，李玉松. 炎症牙髓中转化生长因子β分布特征的实验研究. 牙体牙髓牙周病学杂志，1997, 7(2)：94
, 百拇医药
4 Shiba H,Fujita T, Doi N et al. Differential effect of various growth factors and cytokines on the synthesis of DNA,type Ⅰcollagen,laminin,fibronectin, osteonectin/secreted protein,acidic and rich in cysteine(SPRC),and alkaline phosphatase by human pulp cells in culture. J Cell Physiol,1998, 174(2):194
5 Tziafas D.Basic mechanisms of cytodifferentiation and dentinogenesis during dental pulp repair.Int J Dev Biol,1995, 39:281
, http://www.100md.com 6 Shirakawa M,Shiba H,Nakamishi K et al. Transforming growth factor-beta-1 reduces alkaline phosphatase mRNA and activity and stimulates cell proliferation in cultures of human pulp cells.J Dent Res,1994,73(9):1509
7 Toyono T,Nakashima M,Kuhara S et al. Expression of TGF- β superfamily receptors in dental pulp.J Dent Res,1997, 76(9):1555
8 Eppert K,Scherer S,Ozcelik H et al. MADR2 maps to 18q21 and encodes a TGF- β-regulated MAD related protein that is functionally mutated in colorectal carcinoma.Cell,1996, 86:543
, 百拇医药
9 吴军正，司徒镇强，陈建元.体外培养人牙龈牙髓牙周膜纤维细胞生长及形态特点.实用口腔医学杂志，1993, 9(4)：227
10 Massague J.TGF-β signaling: receptors,transducers,and Mad proteins.Cell,1996, 85:947
11 Zhang Y,Feng X,We R et al. Receptor-associated Mad homologues synergize as effectors of TGF- β respose.Nature,1996, 383:168
收稿日期：1998-06-16, 百拇医药
单位：陈 健 牛忠英 第四军医大学：1.口腔医学院；药立波 范金水 全军分子生物学重点实验室；陕西 西安 710032
关键词：人牙髓细胞；Smad2；MH2结构域；克隆；序列测定
人牙髓细胞Smad2基因MH2结构域 的cDNA 克隆和序列测定 摘要 目的：从人牙髓细胞内克隆转化生长因子-β特异的细胞内信号转导基因Smad2的功能性结构域——MH2结构域。方法：原代培养人牙髓细胞，从培养的细胞中提取总RNA，逆转录合成cDNA第1条链；设计内、外侧两对引物，进行巢式PCR，扩增Smad2基因MH2结构域的基因片段；将所获得的基因片段定向插入pBluscript Ⅱ SK(+)载体；转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆并鉴定；用PE317-A型自动测序仪进行核苷酸序列测定分析。结果：测序结果与国外从人肾cDNA文库中克隆的基因序列完全一致。结论：首次从人牙髓细胞中克隆成功Smad2基因的MH2结构域，证实了Smad2基因在人牙髓细胞中的表达；提示人牙髓细胞内存在Smad2信号转导途径，TGF-β对人牙髓细胞分化的调节可能是通过Smad2信号转导途径实现的。
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中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-00014-04
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999, 9(1)：14]
cDNA cloning and sequencing of MH2 domain of Smad2
from human dental pulp cells
Chen Jian, Niu Zhongying, Yao Libo et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University， Xi'an 710032
Abstract Aim: cDNA cloning and sequencing of MH2 domain of Smad2 from human dental pulp cells. Methods: Total RNA was isolated from primary cultured human dental pulp cells and reversely transcribed into single-stranded cDNA. The desired DNA product was obtained by PCR with four gene specific primers. The segment was inserted into pBluescript Ⅱ SK (+) vector and the result plasmid was transformed into E.coli JM109.The double-stranded cDNA of positive clone was sequenced by PE317-A AUTOMATIC SEQUENCING. Results: The sequence of MH2 domain of Smad2 cloned from dental pulp cells was consistent with that cloned from human kidney cDNA library. Conclusions: The MH2 domain cDNA of Smad2 was obtained from human dental pulp cells for the first time. The result indicates that TGF-β Signaling maybe mediated by Smad2 in human dental pulp cells.
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Key words human dental pulp cell；Smad2；MH2 domain；Cloning；Sequencing
[Chinese Journal of Conervative Dentistry, 1999,9(1):14]
转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)在成牙本质细胞分化和第三期牙本质的形成过程中起着重要的、甚至是关键性的调控作用[1～7]。但其作用的分子机制，即TGF-β在成牙本质细胞和牙髓细胞内的信号转导途径及其对基因表达的调控方式一直未能阐明。1996年，国外从人肾cDNA文库中克隆成功一种特异地转导TGF-β信号的细胞内信号转导基因Smad2[8]。Smad2基因的发现，是TGF-β信号转导研究的一个突破性的进展。
目前，有关人牙髓细胞内是否存在Smad2基因的表达和Smad2基因在第三期牙本质形成中的作用等研究的报道甚少。本文采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法，从培养的人牙髓细胞中克隆Smad2基因的功能性结构域——MH2结构域，并测定其核苷酸序列，旨在从细胞内信号转导的水平探索牙髓细胞分化和第三期牙本质形成的分子机制。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 组织块法原代培养人牙髓细胞
选择健康青少年(13岁，男)因正畸拔除的上颌第二前磨牙，取其正常的牙髓组织，组织块法[9]原代培养人牙髓细胞。培养液为含15%胎牛血清(FCS)的DMEM培养液(Gibco,USA)。将第6代细胞用于实验。
1.2 总RNA的提取
收集约1×105个第6代人牙髓细胞，用Total RNA Extraction System(华美公司)提取总RNA,溶于35μl 去离子水中。取5μl RNA，加入500μl 去离子水稀释，分光光度法测定其A260和A280，以确定RNA的纯度和含量。
1.3 cDNA的合成
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取5μl RNA用1st Strand cDNA Synthesis kit for RT-PCR(AMV)(宝灵曼公司，德国)合成cDNA第一条链。
1.4 巢式PCR
通过因特网联网检索GenBank, 获得Smad2 cDNA序列。以Smad2基因的MH2结构域为模板，用Oligo软件辅助设计引物。共设计外侧、内侧两对引物，分别为P1、P2和P3、P4。P1(外侧5'端引物)：5'-CTCCTACTACGCTTTCCCCTGTT-3';P2(外侧3'端引物)：5'-AGAAGAGTTGTTACATTAAGTCTTT-3';P3(内侧5'端引物)： 5'-CCGAATTCATAGCTTGGATTTACAGCCAGT-3'，带EcoRⅠ酶切位点；P4(内侧3'端引物)：5'-GTCTCTCGAGTTCCATTGGACTTGATTGGTGAAG-3'，带XhoⅠ酶切位点。合成引物(赛百盛公司)。用PWO DNA polymerase(宝灵曼公司，德国)进行巢式PCR。第一轮反应：10×PCR buffer(20mmol/L MgSO4)5μl,dNTP 4μl,PWO 酶0.6μl,cDNA模板2μl,引物P1、P2各3μl，加水至50μl。反应条件：94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸50s，30个循环。以第一轮PCR的产物为模板，P3、P4为引物，进行第二轮PCR。反应条件：94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸50s，5个循环；94℃变性30s,63℃退火45s，72℃延伸50s，30个循环。
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1.5 PCR产物的回收、克隆
第二轮PCR产物于10g/L低熔点琼脂糖凝胶上电泳，用AdvantageTM PCR-Pure kit (Clontech Labratories Inc. USA)回收目的基因。EcoRⅠ和XhoⅠ分别对回收的目的基因和载体pBluescript Ⅱ SK(+)进行双酶切消化，连接目的基因和载体，转化大肠杆菌JM109，蓝白筛选阳性克隆pBS/S2MH2，用EcoRⅠ和XhoⅠ进行酶切鉴定。
1.6 cDNA序列测定
扩增已鉴定的阳性克隆pBS/S2MH2,用Wizard Minipreps DNA Purification System(Promega公司)提取质粒，用PE317-A型DNA自动测序仪(PE公司，USA)测定cDNA序列。
2 结果
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2.1 总RNA
共提取获得35μl RNA，取5μlRNA ,加500μl去离子水稀释。分光光度法测定RNA纯度和含量。A260=0.129，A280=0.065, A260/ A280 =1.969。说明提取获得18.235μg纯度较高的总RNA。
2.2 RT-PCR产物
人牙髓细胞总RNA经逆转录合成cDNA，进行巢式PCR。第二轮PCR产物于10g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳，可见大小约 673bp的特异扩增产物(图1)
图1 PCR扩增产物
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(a.扩增的目的基因 b.Marker：λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)
2.3 pBS/S2MH2克隆的核苷酸序列测定
PE317-A型自动测序仪测定pBS/S2MH2重组载体中插入基因的核苷酸序列，结果与已发表的从人肾cDNA文库中克隆的Smad2基因MH2结构域的核苷酸序列完全一致，未发现任何突变(图2，图3)。
图2 第67～664bp是从人牙髓细胞中克隆的Smad2基因MH2结构域的测序结果
(测序载体为pBluescript Ⅱ SK，反向插入)
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图3 人牙髓细胞Smad2基因MH2结构域的cDNA序列全长597bp(含终止码taa)，编码198个氨基酸
3 讨论
TGF-β是一种在细胞的增殖、分化和损伤愈合等多种生理病理过程中起重要调控作用的细胞因子。牙本质基质中存在TGF-β[1]。龋病破坏釉质、牙本质，导致牙本质基质中的TGF-β释放并作用于成牙本质细胞，促进第三期牙本质的形成[2]。正常牙髓中TGF-β染色阴性而牙髓炎早期成牙本质细胞即呈阳性，牙髓细胞周围亦呈阳性染色。而且，染色的强度随炎症的发展而改变[3]。说明TGF-β通过自分泌和旁分泌途径作用于成牙本质细胞和牙髓细胞。研究证实，TGF-β能够促进人牙髓细胞的DNA合成，调节其碱性磷酸酶(alakline phosphatase, ALP)活性，并显著促进人牙髓细胞合成纤维粘连蛋白(fibronectin ,FN)等细胞外基质[4～6]。同时，Toyono等[7]研究证实，牙髓细胞表达TGF-β的Ⅰ型、Ⅱ型受体。这些研究都说明，在牙髓细胞向成牙本质细胞分化和第三期牙本质的形成过程中，TGF-β起着重要的调控作用。但TGF-β作用的分子机制,即TGF-β在牙髓细胞和成牙本质细胞内的信号转导途径一直未能阐明。
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1996年Eppert等学者从人肾cDNA文库中克隆成功一种特异转导TGF-β信号的细胞内信号基因Smad2。Smad2基因全长1605bp，包含一个编码467个氨基酸的完整开放读框。在结构上， Smad2具有两个结构域，MH1结构域(Mad homology 1 domain)和MH2结构域(Mad homology 2 domain)。研究证实，Smad2基因的表达产物是细胞内TGF-β受体下游的信号转导分子，特异地将TGF-β的信号由细胞浆转导入细胞核内，调控基因表达。MH2结构域是其功能性结构域[8,10,11]
本研究采用RT-PCR的方法从人牙髓细胞中克隆成功Smad2基因的功能性结构域——MH2结构域。所得基因序列与Eppert从人肾cDNA文库中获得的Smad2基因的MH2结构域完全一致，无任何突变。这一结果证实，人牙髓细胞内存在Smad2基因表达，提示人牙髓细胞内存在Smad2信号转导途径，TGF-β对人牙髓细胞分化的调控很可能是通过Smad2信号转导途径实现的。所获得的MH2基因克隆将有助于进一步研究Smad2的功能、作用方式和寻找其下游分子并阐明Smad2在第三期牙本质形成中的作用。
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实验过程中，为确保PCR扩增反应的特异性和精确性，减少碱基的错配，采用了具有3'→5'外切活性的DNA聚合酶Pwo DNA polymerase ,并设计了内、外两对引物，进行巢式PCR，取得了比较理想的实验结果。
当前，在医学领域，对疾病的发病机理和损伤修复的研究已逐步深入到细胞内信号转导水平，即研究从细胞膜到细胞核的信号转导途径及其相互作用，信号转导基因的表达，可逆磷酸化的变化及其与转录因子的相互作用，对目的基因表达的调控直至细胞产生整体应答反应的分子机制。本研究首次证实TGF-β特异的信号转导基因Smad2在人牙髓细胞内的表达，将有助于从细胞内信号转导水平揭示牙髓细胞分化和第三期牙本质形成的分子机制。
(致谢； 本实验是在史俊南教授和肖明振教授的关怀、指导下完成的。赵书芳博士和陈新梅博士在细胞培养过程中给予了具体的指导和帮助。同时，本实验的完成得到了全军分子生物学重点实验室和口腔内科学重点实验室各位老师的关心和帮助，在此表示衷心的感谢。)
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* 国家自然科学基金资助项目(39870789)
参考文献
1 Cassidy N,Fahey M,Prine SS et al. Comparative analysis of transforming growth factor-β isoform 1-3 in human and rabbit dentine matrices. Archs Oral Biol,1997, 42(3):219
2 Simth AJ,Cassidy N,Perry H et al.Reactionary dentinogenesis.Int J Dev Biol,1995, 39(1):273
3 果树林，文玲英，李玉松. 炎症牙髓中转化生长因子β分布特征的实验研究. 牙体牙髓牙周病学杂志，1997, 7(2)：94
, 百拇医药
4 Shiba H,Fujita T, Doi N et al. Differential effect of various growth factors and cytokines on the synthesis of DNA,type Ⅰcollagen,laminin,fibronectin, osteonectin/secreted protein,acidic and rich in cysteine(SPRC),and alkaline phosphatase by human pulp cells in culture. J Cell Physiol,1998, 174(2):194
5 Tziafas D.Basic mechanisms of cytodifferentiation and dentinogenesis during dental pulp repair.Int J Dev Biol,1995, 39:281
, http://www.100md.com 6 Shirakawa M,Shiba H,Nakamishi K et al. Transforming growth factor-beta-1 reduces alkaline phosphatase mRNA and activity and stimulates cell proliferation in cultures of human pulp cells.J Dent Res,1994,73(9):1509
7 Toyono T,Nakashima M,Kuhara S et al. Expression of TGF- β superfamily receptors in dental pulp.J Dent Res,1997, 76(9):1555
8 Eppert K,Scherer S,Ozcelik H et al. MADR2 maps to 18q21 and encodes a TGF- β-regulated MAD related protein that is functionally mutated in colorectal carcinoma.Cell,1996, 86:543
, 百拇医药
9 吴军正，司徒镇强，陈建元.体外培养人牙龈牙髓牙周膜纤维细胞生长及形态特点.实用口腔医学杂志，1993, 9(4)：227
10 Massague J.TGF-β signaling: receptors,transducers,and Mad proteins.Cell,1996, 85:947
11 Zhang Y,Feng X,We R et al. Receptor-associated Mad homologues synergize as effectors of TGF- β respose.Nature,1996, 383:168
收稿日期：1998-06-16, 百拇医药