抗变形链球菌SAⅠ/Ⅱ单抗重链可变区基因克隆及序列分析
作者：文立亚 闫 岩 尹 文 吴兴安 姜绍淳 马文煜
单位：(文立亚)100091 北京市海淀区黑山沪总后309医院口腔科,(闫 岩,尹 文,吴兴安,姜绍淳,马文煜) 西安市第四军医大学微生物学教研室
关键词：变形链球菌；单克隆抗体 ；可变区基因； 核苷酸序列
华西口腔医学杂志990104 摘要 目的:从抗变形链球菌SAⅠ/Ⅱ单抗杂交瘤细胞系2B12F6中扩增克隆重链可变区基因。方法:采用PCR技术和基因工程技术,扩增杂交瘤细胞系2B12F6的重链可变区基因并克隆入载体pUC18,Sanger双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列。结果:重链可变区基因全长360 bp,编码118个氨基酸,其框架区与发表的小鼠重链可变区基因序列有70%的同源性,符合鼠重链可变区基因的结构特征。结论:抗变形链球菌SAⅠ/Ⅱ单抗杂交瘤细胞系2B12F6重链可变区基因的获得是构建抗变形链球菌SAⅠ/Ⅱ基因工程抗体的基础。
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Cloning and Sequencing of Variable Region Gene of Heavy Chain
of Monoclonal Antibody Against SA Ⅰ/Ⅱ of Streptococcus mutans
Wen Liya
Department of Oral Medicine of 309 Hospital, Beijing
Yan Yan, Ying Wen, Wu Xingan, et al
Department of Microbiology, the Fourth Military Medical University
Abstract Objective:To clone and sequence a immunoglobulin variable region of heavy chain(VH) from a mouse hybridoma 2B12F6, which produce monoclonal antibody against SA Ⅰ/Ⅱ of Streptococcus mutans.Methods: The immunoglobulin variable region gene of heavy chain of 2B12F6 was amplified and cloned into pUC18 by using PCR technique and gene engineering technique, and then the gene sequence was analyzed by Sanger's method.Results: The VH gene segment was 360 base pairs in length and coded 118 amino acids, and the homology of framework of VH gene and mouse VH gene published was 70%, which accorded with the feature of mouse VH gene. Conclusion: The VH gene gained from 2B12F6 could provide the possibility of construction of gene engineering antibody against SA Ⅰ/Ⅱ of Streptococcus mutans.
, 百拇医药
Key words: Streptococcus mutans monoclonal antibody variable region gene DNA sequence
目前对于抗变形链球菌表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ(surface protein antigen Ⅰ/Ⅱ,SAⅠ/Ⅱ)单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)用于防龋的实验研究已证实该McAb可抑制变形链球菌在牙齿表面的粘附[1,2],这说明McAb用于防龋值得探讨。但是鼠McAb在人体应用时产生的人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)导致的过敏反应又限制了McAb的应用[3]。随着DNA重组技术的发展,应用基因工程技术可改建鼠McAb从而克服鼠McAb在人体产生的副作用。有关抗变形链球菌SAⅠ/ⅡMcAb基因工程抗体的构建目前在国内尚未见报道。
1 材料和方法
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1.1 细胞培养[4]
抗变形链球菌MT6R SAⅠ/ⅡMcAb杂交瘤细胞株2B12F6按杂交瘤细胞培养规则调整细胞数至1×105个细胞。
1.2 细胞总RNA提取[5]及cDNA合成
培养细胞离心后悬浮于10mmol/L TE200μl,置冰浴5分钟,加入5%NP-40 5μl,两次间隔5分钟,再加入10mmol/L TE200μl,2×RES-1400μl及等体积酚/氯仿-异戊醇抽提,离心吸上层液相再反复抽提1次,吸上层液相于Eppendorf管中,加1/10μl 3M NaAc和1倍-20℃无水乙醇混匀,置-70℃ 20分钟,离心弃上清后再用-20℃70%乙醇洗涤1次,37℃干燥,沉淀物溶于12μl DEPC处理的灭菌超纯水中,取1 μl经1%琼脂糖凝胶电泳,紫外光灯下观察结果。按照逆转录试剂盒要求合成cDNA第一链。
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1.3 PCR扩增及PCR扩增产物补平、回收
在50μl反应液中含超纯水25μl,10×Taq缓冲液4μl,25 mmol/L MgCl2 3μl,10 mmol/L 4×dNTP2μl,引物各2.5μl,95℃变性5分钟后加Taq DNA聚合酶5μ,然后按94.5℃变性50秒,60℃褪火50秒,72℃延伸60秒,循环35次后72℃继续延伸5分钟,取10μl反应物经2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。经抽提干燥的PCR产物中加入:超纯水16μl,10×Klenow缓冲液2μl,4×dNTP 1 μl,Klenow酶1μl混匀,置37℃3小时后经2%琼脂糖凝胶电泳回收补平后的PCR产物,并行常规抽提,干燥,-20℃保存备用。
1.4 2B12F6VH基因的克隆
用平端连接法将上述PCR产物与pUC18载体连接,转化入感受态大肠杆菌JM109,随机挑选菌落提取质粒用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切,筛选阳性克隆,进一步经三组酶切鉴定。
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1.5 序列分析
用双脱氧末端终止法测定序列。按照测序试剂盒说明进行。
阳性克隆菌种液按1∶100接种于50 ml 2×YT培养液中,37℃摇床培养15小时,抽提及纯化质粒后经变性,褪火及α-P32标记反应,电泳2小时凝胶置-20℃放射自显影24小时后行序列分析。
2 结 果
2.1 提取细胞总RNA
1μl提取物经1%琼脂糖凝胶电泳后,在紫外光灯下显示28 S和18 S条带清晰,无基因组DNA污染,降解的RNA量较少。
2.2 PCR扩增VH基因
10μl扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后显示扩增产物长度为360 bp,非特异性带少(图1)。
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图1 2B12F6VH基因PCR扩增产物
A:2B12F6VH基因PCR扩增产物
B:DNA marker[PGEM-7zf(+)/HaeⅢ]
2.3 阳性克隆的鉴定
筛选出的阳性克隆再次经三组酶切鉴定,表明筛选出的阳性克隆含有插入的外源性DNA片段(图2)。
图2 2B12F6VH/PUC18阳性克隆酶切鉴定
A:DNA marker[PGEM-7zf(+)/HaeⅢ]
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B:EcoRI+BamH I酶切片段
C:PstI酶切片段
D:EcoRI+PstI酶切片段
2.4 序列分析
2B12F6VH基因核苷酸和氨基酸序列经放射自显影后可见VH基因片段和Kabat抗体基因库中的小鼠抗体重链Ⅱ(A)组有较高的同源性,其特点是:①基因长度为360 bp,序列两端含有PCR引物及正确的酶切位点;②第2位和第96位含有维持抗体结构所必需的半胱氨酸,而且位置正确;③其框架区与发表的小鼠VH序列有70%以上的同源性,并符合鼠VH的结构特征;④所克隆的VH基因可编码118个氨基酸(图3、4)。
, 百拇医药 图3 2B12F6VH基因核苷酸序列放射自显影分析
A～B:VH Forward
C～D:VH Reverse
图4 2B12F6VH基因核苷酸序列与相应氨基酸序列
(PCR引物,CDR区用下划线标出)
3 讨 论
基因工程抗体的研究已涉及医学界多个学科,如应用鼠人嵌合抗体对阻断乙肝母婴传播及在意外感染时被动免疫[6]的研究以及抗肾综合征出血热病毒基因工程抗体的研究[7]等。
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本实验应用的PCR引物的5'端引物相应于鼠Ig重链保守的第一框架区(FR1)N末端核苷酸序列,而3'端引物与J区序列互补,引物两端含有限制性内切酶PstⅠ和BsteⅡ,可方便地将克隆的VH基因切下并克隆到含小鼠Ig启动子及前导序列的载体中,以便在真核系统中表达。2B12F6单抗VH基因经序列分析表明该VH基因和Kabat抗体基因库中小鼠抗体重链Ⅱ(A)组有较高的同源性。
综上所述,所获得的2B12F6VH基因是完整的具有功能性的,这为构建各种基因工程抗体和进一步用于免疫防龋途径的探讨奠定了基础。
参考文献
1 Lehner T, Caldwell J, Smith R. Local passive immunization by monoclonal antibodies against Streptococcal antigen Ⅰ/Ⅱ in the prevention of dental caries. Infect Immun. 1985, 50(3):796～799
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2 文立亚,岳松龄.单克隆抗体对变链球菌粘附的影响.牙体牙髓牙周病学杂志,1995,5(10):9～10
3 董志伟,王 琰.基因工程抗体.生物工程进展,1992,增刊:53～58
4 Cowley JVC, Coloma MJ, Vazquez J, et al. Sepecific amplification of rearanged immunoglobulin variable region genes from mouse hybridoma cells. Hybridoma, 1990, 9(5):407～417
5 Burne A, Chen YM, Penders JEC. Analysis of gene expression in Streptococcus mutans in biofilms in vitro. Adv Dent Res, 1997, 11(1):100～109
6 李以莞,Clyde W, Shearman. 抗HBS Ag鼠/人嵌合抗体基因构建、表达及鉴定.中国医学科学院学报,1990,12(5):318～324
7 闫 岩,汪美先,许志凯.单克隆抗体3D8可溶性单链抗体的表达.单克隆抗体通讯,1995,11(1):62～63
(1998-08-04收稿), 百拇医药
单位：(文立亚)100091 北京市海淀区黑山沪总后309医院口腔科,(闫 岩,尹 文,吴兴安,姜绍淳,马文煜) 西安市第四军医大学微生物学教研室
关键词：变形链球菌；单克隆抗体 ；可变区基因； 核苷酸序列
华西口腔医学杂志990104 摘要 目的:从抗变形链球菌SAⅠ/Ⅱ单抗杂交瘤细胞系2B12F6中扩增克隆重链可变区基因。方法:采用PCR技术和基因工程技术,扩增杂交瘤细胞系2B12F6的重链可变区基因并克隆入载体pUC18,Sanger双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列。结果:重链可变区基因全长360 bp,编码118个氨基酸,其框架区与发表的小鼠重链可变区基因序列有70%的同源性,符合鼠重链可变区基因的结构特征。结论:抗变形链球菌SAⅠ/Ⅱ单抗杂交瘤细胞系2B12F6重链可变区基因的获得是构建抗变形链球菌SAⅠ/Ⅱ基因工程抗体的基础。
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Cloning and Sequencing of Variable Region Gene of Heavy Chain
of Monoclonal Antibody Against SA Ⅰ/Ⅱ of Streptococcus mutans
Wen Liya
Department of Oral Medicine of 309 Hospital, Beijing
Yan Yan, Ying Wen, Wu Xingan, et al
Department of Microbiology, the Fourth Military Medical University
Abstract Objective:To clone and sequence a immunoglobulin variable region of heavy chain(VH) from a mouse hybridoma 2B12F6, which produce monoclonal antibody against SA Ⅰ/Ⅱ of Streptococcus mutans.Methods: The immunoglobulin variable region gene of heavy chain of 2B12F6 was amplified and cloned into pUC18 by using PCR technique and gene engineering technique, and then the gene sequence was analyzed by Sanger's method.Results: The VH gene segment was 360 base pairs in length and coded 118 amino acids, and the homology of framework of VH gene and mouse VH gene published was 70%, which accorded with the feature of mouse VH gene. Conclusion: The VH gene gained from 2B12F6 could provide the possibility of construction of gene engineering antibody against SA Ⅰ/Ⅱ of Streptococcus mutans.
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Key words: Streptococcus mutans monoclonal antibody variable region gene DNA sequence
目前对于抗变形链球菌表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ(surface protein antigen Ⅰ/Ⅱ,SAⅠ/Ⅱ)单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)用于防龋的实验研究已证实该McAb可抑制变形链球菌在牙齿表面的粘附[1,2],这说明McAb用于防龋值得探讨。但是鼠McAb在人体应用时产生的人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)导致的过敏反应又限制了McAb的应用[3]。随着DNA重组技术的发展,应用基因工程技术可改建鼠McAb从而克服鼠McAb在人体产生的副作用。有关抗变形链球菌SAⅠ/ⅡMcAb基因工程抗体的构建目前在国内尚未见报道。
1 材料和方法
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1.1 细胞培养[4]
抗变形链球菌MT6R SAⅠ/ⅡMcAb杂交瘤细胞株2B12F6按杂交瘤细胞培养规则调整细胞数至1×105个细胞。
1.2 细胞总RNA提取[5]及cDNA合成
培养细胞离心后悬浮于10mmol/L TE200μl,置冰浴5分钟,加入5%NP-40 5μl,两次间隔5分钟,再加入10mmol/L TE200μl,2×RES-1400μl及等体积酚/氯仿-异戊醇抽提,离心吸上层液相再反复抽提1次,吸上层液相于Eppendorf管中,加1/10μl 3M NaAc和1倍-20℃无水乙醇混匀,置-70℃ 20分钟,离心弃上清后再用-20℃70%乙醇洗涤1次,37℃干燥,沉淀物溶于12μl DEPC处理的灭菌超纯水中,取1 μl经1%琼脂糖凝胶电泳,紫外光灯下观察结果。按照逆转录试剂盒要求合成cDNA第一链。
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1.3 PCR扩增及PCR扩增产物补平、回收
在50μl反应液中含超纯水25μl,10×Taq缓冲液4μl,25 mmol/L MgCl2 3μl,10 mmol/L 4×dNTP2μl,引物各2.5μl,95℃变性5分钟后加Taq DNA聚合酶5μ,然后按94.5℃变性50秒,60℃褪火50秒,72℃延伸60秒,循环35次后72℃继续延伸5分钟,取10μl反应物经2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。经抽提干燥的PCR产物中加入:超纯水16μl,10×Klenow缓冲液2μl,4×dNTP 1 μl,Klenow酶1μl混匀,置37℃3小时后经2%琼脂糖凝胶电泳回收补平后的PCR产物,并行常规抽提,干燥,-20℃保存备用。
1.4 2B12F6VH基因的克隆
用平端连接法将上述PCR产物与pUC18载体连接,转化入感受态大肠杆菌JM109,随机挑选菌落提取质粒用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切,筛选阳性克隆,进一步经三组酶切鉴定。
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1.5 序列分析
用双脱氧末端终止法测定序列。按照测序试剂盒说明进行。
阳性克隆菌种液按1∶100接种于50 ml 2×YT培养液中,37℃摇床培养15小时,抽提及纯化质粒后经变性,褪火及α-P32标记反应,电泳2小时凝胶置-20℃放射自显影24小时后行序列分析。
2 结 果
2.1 提取细胞总RNA
1μl提取物经1%琼脂糖凝胶电泳后,在紫外光灯下显示28 S和18 S条带清晰,无基因组DNA污染,降解的RNA量较少。
2.2 PCR扩增VH基因
10μl扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后显示扩增产物长度为360 bp,非特异性带少(图1)。
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图1 2B12F6VH基因PCR扩增产物
A:2B12F6VH基因PCR扩增产物
B:DNA marker[PGEM-7zf(+)/HaeⅢ]
2.3 阳性克隆的鉴定
筛选出的阳性克隆再次经三组酶切鉴定,表明筛选出的阳性克隆含有插入的外源性DNA片段(图2)。
图2 2B12F6VH/PUC18阳性克隆酶切鉴定
A:DNA marker[PGEM-7zf(+)/HaeⅢ]
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B:EcoRI+BamH I酶切片段
C:PstI酶切片段
D:EcoRI+PstI酶切片段
2.4 序列分析
2B12F6VH基因核苷酸和氨基酸序列经放射自显影后可见VH基因片段和Kabat抗体基因库中的小鼠抗体重链Ⅱ(A)组有较高的同源性,其特点是:①基因长度为360 bp,序列两端含有PCR引物及正确的酶切位点;②第2位和第96位含有维持抗体结构所必需的半胱氨酸,而且位置正确;③其框架区与发表的小鼠VH序列有70%以上的同源性,并符合鼠VH的结构特征;④所克隆的VH基因可编码118个氨基酸(图3、4)。
, 百拇医药 图3 2B12F6VH基因核苷酸序列放射自显影分析
A～B:VH Forward
C～D:VH Reverse
图4 2B12F6VH基因核苷酸序列与相应氨基酸序列
(PCR引物,CDR区用下划线标出)
3 讨 论
基因工程抗体的研究已涉及医学界多个学科,如应用鼠人嵌合抗体对阻断乙肝母婴传播及在意外感染时被动免疫[6]的研究以及抗肾综合征出血热病毒基因工程抗体的研究[7]等。
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本实验应用的PCR引物的5'端引物相应于鼠Ig重链保守的第一框架区(FR1)N末端核苷酸序列,而3'端引物与J区序列互补,引物两端含有限制性内切酶PstⅠ和BsteⅡ,可方便地将克隆的VH基因切下并克隆到含小鼠Ig启动子及前导序列的载体中,以便在真核系统中表达。2B12F6单抗VH基因经序列分析表明该VH基因和Kabat抗体基因库中小鼠抗体重链Ⅱ(A)组有较高的同源性。
综上所述,所获得的2B12F6VH基因是完整的具有功能性的,这为构建各种基因工程抗体和进一步用于免疫防龋途径的探讨奠定了基础。
参考文献
1 Lehner T, Caldwell J, Smith R. Local passive immunization by monoclonal antibodies against Streptococcal antigen Ⅰ/Ⅱ in the prevention of dental caries. Infect Immun. 1985, 50(3):796～799
, http://www.100md.com
2 文立亚,岳松龄.单克隆抗体对变链球菌粘附的影响.牙体牙髓牙周病学杂志,1995,5(10):9～10
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4 Cowley JVC, Coloma MJ, Vazquez J, et al. Sepecific amplification of rearanged immunoglobulin variable region genes from mouse hybridoma cells. Hybridoma, 1990, 9(5):407～417
5 Burne A, Chen YM, Penders JEC. Analysis of gene expression in Streptococcus mutans in biofilms in vitro. Adv Dent Res, 1997, 11(1):100～109
6 李以莞,Clyde W, Shearman. 抗HBS Ag鼠/人嵌合抗体基因构建、表达及鉴定.中国医学科学院学报,1990,12(5):318～324
7 闫 岩,汪美先,许志凯.单克隆抗体3D8可溶性单链抗体的表达.单克隆抗体通讯,1995,11(1):62～63
(1998-08-04收稿), 百拇医药