翼状胬肉IL-6和TNF-α的异常分泌及其意义
作者：张俊华 张国安 金威尔 林颖
单位：张俊华，金威尔，林颖：350004 福州，福建省人民医院眼科；张国安：解放军第476医院临床免疫研究室。
关键词：翼状胬肉；肿瘤坏死因子；白细胞介素6
眼科新进展990105 摘要 目的 研究白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)在翼状胬肉发病机理中的作用。方法 采用细胞生物活性法和放射免疫检测技术检测了30例患者翼状胬肉组织的体外培养上清中和正常组织中IL-6和TNF-α的含量。结果 翼状胬肉组织培养上清中的IL-6和TNF-α含量分别为19.8±12.1kU.g-1蛋白和43.8±22.1μg.g-1，均明显高于正常球结膜组(4.7±1.6kU.g-1蛋白和9.4±3.6μg.g-1蛋白，P<0.01)；进行期组的IL-6和TNF-α含量分别为21.4±11.9kU.g-1蛋白和56.6±23.8μg.g-1蛋白，均明显高于静止期组(16.9±12.3kU.g-1蛋白和29.2±14.3μg.g-1蛋白，P<0.05)，且抗TNF-α抗体对IL-6的产生具有负向的调节作用。结论 翼状胬肉的发生、发展可能与IL-6和TNF-α的异常分泌有关。
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Significance of the abnormal secretion of IL-6 and TNF-α in the pterygium
ZHANG Jun-Hua,ZHANG Guo-An,JIN Wei-Er,LIN Ying
From the Department of Ophthalmology,Fujian Provincial People's Hospital(ZHANG Jun-Hua,JIN Wei-Er,LIN Ying);Clinical Research Unit of Immunology,Chinese PLA 476 Hospital(ZHANG Guo-An)
Abstract Objective To study the roles of interleukin 6(IL-6)and tumor necrosis factor(TNF-α)in the pathogenesis of pterygium.Methods Bioactivity assay and radioimmunoassay were used to measure the levels of IL-6 and TNF-α in tissue cultural supernatant of pterygium specimens in 30 patients.Results The levels of IL-6 and TNF-α in tissue cultural supernatant of pterygium were significantly higher than that of normal conjunctival specimens (P<0.01),and there was a significant difference between cases and the quiescent cases (P<0.05).Conclusion The abnormal secretion of IL-6 and TNF-α may be a positive factor in the pathogenesis of pterygium.
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Key words pterygium;tumor necrosis factor；interleukin 6 翼状胬肉是眼科常见病、多发病，但其确切发病机理尚不清楚。病理学研究表明，翼状胬肉形成的主要原因是大量增生的成纤维细胞和血管的增生与退变[1]。近年来的研究表明，细胞因子在炎症反应、成纤维细胞增生及血管形成方面起着重要的调控作用[2]。我们对翼状胬肉组织在体外分泌产生白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的情况进行了研究，以探讨IL-6和TNF-α在翼状胬肉发病机理中的作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象 所选病例全部为我院眼科门诊的翼状胬肉患者，共30例30只眼，全部为初发型，根据病变局部有无充血、肥厚和浸润，又分为进行期(19例)和静止期(11例)，无其它角膜、结膜疾患。所有患者确诊后均行翼状胬肉单纯切除术，同时剪除患眼角膜上缘上方约3mm处的正常球结膜组织约2mm×5mm作为自身对照。
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1.2 研究方法
1.2.1 翼状胬肉组织培养上清的制备 翼状胬肉及正常球结膜组织取材后迅速放入含100mL.L-1胎牛血清(FCS)的RPMI 1640(Gibco)培养液(1.0mL)中，置37℃孵育24h，研磨匀浆后2500r.min-1离心20min，收集上清，置-30℃冰箱中保存待测TNF-α和IL-6含量，组织蛋白含量采用改良Lowry法测定。
1.2.2 TNF-α含量的测定 采用RIA法，试剂盒为上海长征医学科学有限公司生产。
1.2.3 IL-6活性测定 采用IL-6依赖性细胞株B9.9增殖反应MTT比色法[3]，B9.9细胞株由荷兰Aarden博士惠赠；IL-6标准品由日本大阪大学工学部提供。
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1.2.4 数据处理 每份标本平行测定3孔，求平均值，各组间均数比较采用t检验。
2 结果
2.1 翼状胬肉与正常球结膜组织IL-6和TNF-α体外分泌水平的比较 翼状胬肉和正常球结膜组织在体外培养后其上清液中均能测到IL-6和TNF-α活性，但翼状胬肉组均明显高于正常球结膜组(P<0.01)，见表1。
表1 翼状胬肉和正常球结膜组织细胞因子的分泌水平
Table 1 Secreting levels of cytokines in pterygium
and normal conjuctiva specimens (
±s) Group
, 百拇医药
n
IL-6(kU.g-1)
TNF-α(μg.g-1)
Pterygium
30
19.8±12.1*
43.8±22.1*
Normal conjuctiva
30
, http://www.100md.com 4.7±1.6
9.4±3.6
*Compared with normal conjuctiva group P<0.01
2.2 不同期翼状胬肉组织IL-6和TNF-α分泌水平的比较 进行期翼状胬肉的IL-6和TNF-α体外分泌量要明显高于静止期翼状胬肉组织(P<0.05)，见表2。
表2 进行期和静止期翼状胬肉的细胞因子分泌水平
Table 2 Secretive levels of cytokines in progressive
cases and quiescent cases (±s) Group
, http://www.100md.com
n
IL-6(kU.g-1)
TNF-α(μg.g-1)
Progessive cases
19
21.4±11.9*
56.6±23.8*
Quiescent cases
11
, 百拇医药
16.9±12.3
29.2±14.3
*Compared with quiescent cases P<0.05
2.3 特异性中和抗体对翼状胬肉IL-6和TNF-α产生的影响 向进行期翼状胬肉组织培养体系中加入2g.L-1的抗TNF-α抗体(Sigma)，孵育24h后，检测IL-6活性，发现IL-6的产生水平明显降低，为15.4±8.6kU.g-1蛋白，与未加抗体组相比较，差异显著(P<0.05 )；而加入抗IL-6抗体(Sigma)对TNF-α的产生却没有明显的影响。
3 讨论
, 百拇医药
翼状胬肉的形成是多因素参与的复杂的病理过程。其直接原因是大量增生的成纤维细胞和血管的增生与退变[1]，是成纤维细胞、内皮细胞、淋巴细胞、血小板及多种细胞因子相互作用的结果[4]。由于该病与紫外线照射、风沙、粉尘、花粉刺激及感染有关，而这些因素均可导致球结膜的蛋白变性及细胞因子的异常分泌[5]，因此，国内外研究者都普遍认为免疫因素在翼状胬肉的发病机理中起重要作用。
IL-6和TNF-α是一组重要的细胞因子，它们不仅一起构成炎性介质，而且还可以促进纤维母细胞的增殖和血管的形成[6]。在本研究中，翼状胬肉组织培养上清中IL-6活性与TNF-α含量均明显高于正常球结膜组，而且进行期组与静止期组之间也存在差异，表明IL-6和TNF-α的表达异常可能与翼状胬肉的发生发展有关。病理学研究表明，翼状胬肉组织中有大量的新生血管、纤维母细胞和弹性纤维及胶原纤维增生，并可见大量的淋巴细胞、浆细胞浸润和肥大细胞反应[7，8]，这不仅表明在翼状胬肉发病机理中免疫因素的存在，而且这些因素也均可造成IL-6和TNF-α的分泌表达增加[9]，IL-6和TNF-α的分泌增强，又进一步促使纤维母细胞、弹性纤维及胶原纤维的增生和变性细胞的浸润，促进翼状胬肉的发展。
, 百拇医药
IL-6和TNF-α同属细胞因子网络中的核心成员[10]。TNF-α为IL-6的强诱导剂，经LPS诱发小鼠内毒素休克中发现，TNF-α含量首先升高，而后才测出IL-6。我们的研究也表明，经抗TNF-α抗体处理可使进行期翼状胬肉组织IL-6的分泌活性降低，而加入抗IL-6抗体对TNF-α的产生却没有明显的影响。最近的研究认为，TNF-α为机体重要的炎症因子；而IL-6可诱生许多抑制蛋白酶作用的物质，故认为是一种抗炎因子[11]。而两者的共同作用又可促使纤维母细胞、弹性纤维及胶原纤维的增生和新生血管的形成，共同参与了翼状胬肉的发生和发展。因此，进一步研究如何对细胞因子的分泌进行有效的调控对翼状胬肉的预防、治疗及防止复发具有重要的意义。
作者简介 张俊华，女，河南人，1965年2月出生。1983年考入河南省新乡医学院医学系，1988年毕业，获学士学位。1985年加入中国共产党。毕业后到河南省鹤壁市第一人民医院眼科从事临床工作。1992年借调入空军476医院，1995年调入福建省人民医院，现任该院眼科主治医师，主要从事青光眼、白内障、眼外伤的临床治疗及近视、弱视的防治工作。主持进行了“白内障与SOD的关系”和“翼状胬肉的细胞因子分泌特性”等课题的研究。参与了“放射状角膜切开术治疗近视眼”和白细胞介素6临床病理学意义”等课题的研究。在全国性杂志上发表论文6篇，获军队科技进步三等奖一项。1997年被福建省妇女联合会授予“福建省三八红旗手”称号。
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参考文献
[1]Hill JC.Pathogenesis of pterygium.Eye 1989;3∶218-226.
[2]Thornton SC.Interaction of immune and connective tissue cells.The effect of lymphokines and monokines on fibroblast growths.J Leuko Biol 1990;47∶312-316.
[3]张国安，刘小朋，施水兰，等.白细胞介素6生物活性方法的建立及应用.福建医学检验杂志1998；3∶10-11.
[4]Pinkerton OD,Hokama Y,Shigemura LA.Immunologic basis for the pathogenesis of pterygium.Am J Ophthalmol 1984;98∶225-228.
, http://www.100md.com
[5]Coroneo MT.Pterygium as an early indictor of ultraviolet insolation:a hypothesis.Br J Ophthalmol 1993;77∶734-739.
[6]Gospodaroicz D,Neufeld G,Schweigerer L.Fibroblast growth factor.Mol Cell Endocrinol 1986;46∶187-204.
[7]Cameron ME.Histology of pterygium:an electron microscopy study.Br J Ophthalmol 1983;67∶604-608.
[8]柳林，杨德旺，牟贤龙，等.翼状胬肉的免疫病理学研究.中华眼科杂志1993；29∶141-143.
, 百拇医药
[9]Sporn MB,Roberts AB.Peptide growth factors and inflammation,tissue repair,and cancer.J Clin Invest 1986;78∶309-332.
[10]McAvoy JW,Chamberlain CG.Growth factor in the eye.Prog Growth Factor Res 1990;2∶29-43.
[11]Aderka D,Le J,Vilcek J.IL-6 inhibits lipopolysaccharide induced tumor necrosis factor production in human monocytes,U937,and in mice.J Immunol 1989;143∶3517-3522.
收稿 1998-05-29 修回 1998-07-13
Accepted for publication May 29,1998, 百拇医药
单位：张俊华，金威尔，林颖：350004 福州，福建省人民医院眼科；张国安：解放军第476医院临床免疫研究室。
关键词：翼状胬肉；肿瘤坏死因子；白细胞介素6
眼科新进展990105 摘要 目的 研究白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)在翼状胬肉发病机理中的作用。方法 采用细胞生物活性法和放射免疫检测技术检测了30例患者翼状胬肉组织的体外培养上清中和正常组织中IL-6和TNF-α的含量。结果 翼状胬肉组织培养上清中的IL-6和TNF-α含量分别为19.8±12.1kU.g-1蛋白和43.8±22.1μg.g-1，均明显高于正常球结膜组(4.7±1.6kU.g-1蛋白和9.4±3.6μg.g-1蛋白，P<0.01)；进行期组的IL-6和TNF-α含量分别为21.4±11.9kU.g-1蛋白和56.6±23.8μg.g-1蛋白，均明显高于静止期组(16.9±12.3kU.g-1蛋白和29.2±14.3μg.g-1蛋白，P<0.05)，且抗TNF-α抗体对IL-6的产生具有负向的调节作用。结论 翼状胬肉的发生、发展可能与IL-6和TNF-α的异常分泌有关。
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Significance of the abnormal secretion of IL-6 and TNF-α in the pterygium
ZHANG Jun-Hua,ZHANG Guo-An,JIN Wei-Er,LIN Ying
From the Department of Ophthalmology,Fujian Provincial People's Hospital(ZHANG Jun-Hua,JIN Wei-Er,LIN Ying);Clinical Research Unit of Immunology,Chinese PLA 476 Hospital(ZHANG Guo-An)
Abstract Objective To study the roles of interleukin 6(IL-6)and tumor necrosis factor(TNF-α)in the pathogenesis of pterygium.Methods Bioactivity assay and radioimmunoassay were used to measure the levels of IL-6 and TNF-α in tissue cultural supernatant of pterygium specimens in 30 patients.Results The levels of IL-6 and TNF-α in tissue cultural supernatant of pterygium were significantly higher than that of normal conjunctival specimens (P<0.01),and there was a significant difference between cases and the quiescent cases (P<0.05).Conclusion The abnormal secretion of IL-6 and TNF-α may be a positive factor in the pathogenesis of pterygium.
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Key words pterygium;tumor necrosis factor；interleukin 6 翼状胬肉是眼科常见病、多发病，但其确切发病机理尚不清楚。病理学研究表明，翼状胬肉形成的主要原因是大量增生的成纤维细胞和血管的增生与退变[1]。近年来的研究表明，细胞因子在炎症反应、成纤维细胞增生及血管形成方面起着重要的调控作用[2]。我们对翼状胬肉组织在体外分泌产生白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的情况进行了研究，以探讨IL-6和TNF-α在翼状胬肉发病机理中的作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象 所选病例全部为我院眼科门诊的翼状胬肉患者，共30例30只眼，全部为初发型，根据病变局部有无充血、肥厚和浸润，又分为进行期(19例)和静止期(11例)，无其它角膜、结膜疾患。所有患者确诊后均行翼状胬肉单纯切除术，同时剪除患眼角膜上缘上方约3mm处的正常球结膜组织约2mm×5mm作为自身对照。
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1.2 研究方法
1.2.1 翼状胬肉组织培养上清的制备 翼状胬肉及正常球结膜组织取材后迅速放入含100mL.L-1胎牛血清(FCS)的RPMI 1640(Gibco)培养液(1.0mL)中，置37℃孵育24h，研磨匀浆后2500r.min-1离心20min，收集上清，置-30℃冰箱中保存待测TNF-α和IL-6含量，组织蛋白含量采用改良Lowry法测定。
1.2.2 TNF-α含量的测定 采用RIA法，试剂盒为上海长征医学科学有限公司生产。
1.2.3 IL-6活性测定 采用IL-6依赖性细胞株B9.9增殖反应MTT比色法[3]，B9.9细胞株由荷兰Aarden博士惠赠；IL-6标准品由日本大阪大学工学部提供。
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1.2.4 数据处理 每份标本平行测定3孔，求平均值，各组间均数比较采用t检验。
2 结果
2.1 翼状胬肉与正常球结膜组织IL-6和TNF-α体外分泌水平的比较 翼状胬肉和正常球结膜组织在体外培养后其上清液中均能测到IL-6和TNF-α活性，但翼状胬肉组均明显高于正常球结膜组(P<0.01)，见表1。
表1 翼状胬肉和正常球结膜组织细胞因子的分泌水平
Table 1 Secreting levels of cytokines in pterygium
and normal conjuctiva specimens (
±s) Group, 百拇医药
n
IL-6(kU.g-1)
TNF-α(μg.g-1)
Pterygium
30
19.8±12.1*
43.8±22.1*
Normal conjuctiva
30
, http://www.100md.com 4.7±1.6
9.4±3.6
*Compared with normal conjuctiva group P<0.01
2.2 不同期翼状胬肉组织IL-6和TNF-α分泌水平的比较 进行期翼状胬肉的IL-6和TNF-α体外分泌量要明显高于静止期翼状胬肉组织(P<0.05)，见表2。
表2 进行期和静止期翼状胬肉的细胞因子分泌水平
Table 2 Secretive levels of cytokines in progressive
cases and quiescent cases (
±s) Group, http://www.100md.com
n
IL-6(kU.g-1)
TNF-α(μg.g-1)
Progessive cases
19
21.4±11.9*
56.6±23.8*
Quiescent cases
11
, 百拇医药
16.9±12.3
29.2±14.3
*Compared with quiescent cases P<0.05
2.3 特异性中和抗体对翼状胬肉IL-6和TNF-α产生的影响 向进行期翼状胬肉组织培养体系中加入2g.L-1的抗TNF-α抗体(Sigma)，孵育24h后，检测IL-6活性，发现IL-6的产生水平明显降低，为15.4±8.6kU.g-1蛋白，与未加抗体组相比较，差异显著(P<0.05 )；而加入抗IL-6抗体(Sigma)对TNF-α的产生却没有明显的影响。
3 讨论
, 百拇医药
翼状胬肉的形成是多因素参与的复杂的病理过程。其直接原因是大量增生的成纤维细胞和血管的增生与退变[1]，是成纤维细胞、内皮细胞、淋巴细胞、血小板及多种细胞因子相互作用的结果[4]。由于该病与紫外线照射、风沙、粉尘、花粉刺激及感染有关，而这些因素均可导致球结膜的蛋白变性及细胞因子的异常分泌[5]，因此，国内外研究者都普遍认为免疫因素在翼状胬肉的发病机理中起重要作用。
IL-6和TNF-α是一组重要的细胞因子，它们不仅一起构成炎性介质，而且还可以促进纤维母细胞的增殖和血管的形成[6]。在本研究中，翼状胬肉组织培养上清中IL-6活性与TNF-α含量均明显高于正常球结膜组，而且进行期组与静止期组之间也存在差异，表明IL-6和TNF-α的表达异常可能与翼状胬肉的发生发展有关。病理学研究表明，翼状胬肉组织中有大量的新生血管、纤维母细胞和弹性纤维及胶原纤维增生，并可见大量的淋巴细胞、浆细胞浸润和肥大细胞反应[7，8]，这不仅表明在翼状胬肉发病机理中免疫因素的存在，而且这些因素也均可造成IL-6和TNF-α的分泌表达增加[9]，IL-6和TNF-α的分泌增强，又进一步促使纤维母细胞、弹性纤维及胶原纤维的增生和变性细胞的浸润，促进翼状胬肉的发展。
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IL-6和TNF-α同属细胞因子网络中的核心成员[10]。TNF-α为IL-6的强诱导剂，经LPS诱发小鼠内毒素休克中发现，TNF-α含量首先升高，而后才测出IL-6。我们的研究也表明，经抗TNF-α抗体处理可使进行期翼状胬肉组织IL-6的分泌活性降低，而加入抗IL-6抗体对TNF-α的产生却没有明显的影响。最近的研究认为，TNF-α为机体重要的炎症因子；而IL-6可诱生许多抑制蛋白酶作用的物质，故认为是一种抗炎因子[11]。而两者的共同作用又可促使纤维母细胞、弹性纤维及胶原纤维的增生和新生血管的形成，共同参与了翼状胬肉的发生和发展。因此，进一步研究如何对细胞因子的分泌进行有效的调控对翼状胬肉的预防、治疗及防止复发具有重要的意义。
作者简介 张俊华，女，河南人，1965年2月出生。1983年考入河南省新乡医学院医学系，1988年毕业，获学士学位。1985年加入中国共产党。毕业后到河南省鹤壁市第一人民医院眼科从事临床工作。1992年借调入空军476医院，1995年调入福建省人民医院，现任该院眼科主治医师，主要从事青光眼、白内障、眼外伤的临床治疗及近视、弱视的防治工作。主持进行了“白内障与SOD的关系”和“翼状胬肉的细胞因子分泌特性”等课题的研究。参与了“放射状角膜切开术治疗近视眼”和白细胞介素6临床病理学意义”等课题的研究。在全国性杂志上发表论文6篇，获军队科技进步三等奖一项。1997年被福建省妇女联合会授予“福建省三八红旗手”称号。
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参考文献
[1]Hill JC.Pathogenesis of pterygium.Eye 1989;3∶218-226.
[2]Thornton SC.Interaction of immune and connective tissue cells.The effect of lymphokines and monokines on fibroblast growths.J Leuko Biol 1990;47∶312-316.
[3]张国安，刘小朋，施水兰，等.白细胞介素6生物活性方法的建立及应用.福建医学检验杂志1998；3∶10-11.
[4]Pinkerton OD,Hokama Y,Shigemura LA.Immunologic basis for the pathogenesis of pterygium.Am J Ophthalmol 1984;98∶225-228.
, http://www.100md.com
[5]Coroneo MT.Pterygium as an early indictor of ultraviolet insolation:a hypothesis.Br J Ophthalmol 1993;77∶734-739.
[6]Gospodaroicz D,Neufeld G,Schweigerer L.Fibroblast growth factor.Mol Cell Endocrinol 1986;46∶187-204.
[7]Cameron ME.Histology of pterygium:an electron microscopy study.Br J Ophthalmol 1983;67∶604-608.
[8]柳林，杨德旺，牟贤龙，等.翼状胬肉的免疫病理学研究.中华眼科杂志1993；29∶141-143.
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[9]Sporn MB,Roberts AB.Peptide growth factors and inflammation,tissue repair,and cancer.J Clin Invest 1986;78∶309-332.
[10]McAvoy JW,Chamberlain CG.Growth factor in the eye.Prog Growth Factor Res 1990;2∶29-43.
[11]Aderka D,Le J,Vilcek J.IL-6 inhibits lipopolysaccharide induced tumor necrosis factor production in human monocytes,U937,and in mice.J Immunol 1989;143∶3517-3522.
收稿 1998-05-29 修回 1998-07-13
Accepted for publication May 29,1998, 百拇医药