角膜干细胞增殖与分化表达实验研究
作者：潘志强 张文华 孙葆忱
单位：100730 北京市眼科研究所
关键词：角膜缘；干细胞
中华眼科杂志990106 【摘要】 目的 了解角膜缘干细胞体外生长的增殖分化特性，检测上皮细胞生长因子对干细胞增殖的促进作用。方法 采用DMEM和F12培养基进行兔角膜上皮细胞培养，用克隆形成率(colony-forming efficiency, CFE)、免疫组化染色和蛋白质免疫印迹等方法检测细胞的增殖力和分化表达状况。结果 角膜缘干细胞(limbal stem cells, LC)在本培养条件下能够正常传代生长5代，CFE为(5.07±2.35)%，而角膜中央上皮细胞(central corneal epithelial cells, CC)仅第1次传代生长，CFE为(1.12±0.86)%；LC冻存后复苏率为(0.43±0.22)%，CC为(0.16±0.07)%，差异有非常显著性(t=-5.54,P<0.01)；上皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF)在质量浓度为5 ng/ml和20 ng/ml时对细胞的促增殖作用最强(t=-6.51,P<0.01)。干细胞在培养初期，细胞角质蛋白K3染色阴性，第2、3代时逐渐表达；而蛋白质免疫印迹检测早期(原代，第2代)为阳性，晚期(第4代)为阴性。结论 角膜缘干细胞在体外培养的初期更有利于进行干细胞移植治疗和药物筛选
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A study on proliferation and differentiation of limbal stem cells
PAN Zhiqiang, ZHANG Wenhua, SUN Baochen.
Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing 100730
【Abstract】 Objective To study the proliferation and differentiation of limbal stem cells (LCs) in vitro and examine the effects of epithelial growth factor (EGF) on cell proliferation. Methods The cells were cultured in DMEM/F12 medium. The proliferation and differentiation of cultured cells were studied by colony-forming efficiency (CFE), immunohistochemistry staining and Western blot examination. Results LCs could be passaged 5 times in this culture condition. The CFE of stem cells was (5.07±2.35)%, while that of the central epithelial cells (CCs) was (1.12±0.86)%. The rates of freezing and recovery were (0.43±0.22)% in LCs and (0.16±0.07)% in CCs. Limbal stem cells could be stimulated to proliferate better by EGF at the concentration of 5 and 20ng/ml. The staining of keratin 3 (K3) to stem cells in the primary culture was negative, but positive in the second and third passages. However, the expression of K3 by Western blot examination was positive in the primary and second passages but negative in the fourth one. Conclusion It is better for limbal stem cells to be used for transplantation and drug screening in the primary culture.
, 百拇医药
【Key words】 Limbus cornea Stem cells
角膜上皮完整性的维持依赖于表浅细胞不断脱落和基底层细胞不断增殖以取代脱落细胞，上皮细胞持续不断的水平向心运动和垂直向上运动源于角膜缘基底层的干细胞增殖和分化[1,2]。由于干细胞对角膜创伤的愈合及透明性维持等方面具有重要作用[3]，通过对体外培养的角膜缘干细胞增殖分化特性的研究，可以加深对干细胞的认识，为将来进行异体干细胞移植准备条件。
材料和方法
1.兔角膜上皮细胞的培养：无菌条件下取新西兰大白兔眼角膜，显微镜下切除残存的结膜和色素组织，将角膜分为中央和角膜缘组织(角膜缘内2mm)，去除角膜内皮细胞后，将组织切成1 mm×2 mm，细胞面向上置于培养瓶中，加入细胞培养基(DMEM和Hams F12培养基的1∶1混合物，20%胎牛血清)，在37℃、体积分数为5% CO2和95%空气条件下进行培养，培养基每2天更换1次，10～12天去除接种组织块。当细胞形成单层达80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶和0.04% EDTA液消化传代(1∶2)。
, 百拇医药
2.干细胞的细胞克隆形成率(colony-forming efficiency，CFE)和影响因素：原代培养的细胞消化成单个细胞，2%台盼蓝染色测定活细胞活力，按每孔1×103细胞数接种于24孔培养板，每6孔为一组，每培养板设对照、5、20、100 ng/ml质量浓度的上皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)共4组；角膜缘干细胞和角膜中央上皮细胞各接种3个培养板，每组18孔，接种后第2天加入EGF，第4天开始在倒置显微镜下观察，以细胞团超过4个细胞为一个克隆形成[4]。
3.培养细胞的冻存和复苏：(1)细胞冻存：细胞消化成单细胞悬液，体积分数为15%甘油培养基常规-80℃保存。(2)细胞复苏：细胞取出后在40～42℃水浴1分钟，将细胞接种于24孔板，按每孔1×103细胞，于培养后1周在倒置显微镜下观察。
, 百拇医药
4.免疫组化染色：(1)兔眼球摘除后置10%中性甲醛固定24～48小时，常规石蜡包埋切片。(2)不同培养时期生长于盖玻片上的角膜中央上皮细胞和角膜缘细胞按Schermer等[5]方法进行染色。一抗为抗角质蛋白K3鼠单抗AE5(美国Tung-Tien Sun教授馈赠)，二抗为辣根过氧化物酶标羊抗鼠IgG，3.3二氨基联苯胺显色，质量浓度为1%甲基绿复染，镜检摄像。
5.Western Blot分析：不同培养阶段的细胞，常规裂解细胞，用超声细胞处理仪对DNA进行剪切，收集上清液进行蛋白电泳，电转移蛋白至硝酸纤维素膜。用AE5进行抗原抗体反应，设PBS为阴性对照[6]。
6.实验数据经SPSS for Windows 6.0统计软件处理，采用t检验和多因素方差分析等统计方法。
结果
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1.细胞培养：组织块接种后细胞很快呈膜状扩展生长，约10天达生长饱和，细胞大小一致，呈多角形，角膜缘和角膜中央上皮细胞的形态相同，仅后者细胞略大(图1,2)。不同的是角膜中央上皮细胞在传第1代后细胞基本停止生长，细胞从多角形变为长梭形，不能形成细胞单层(图3)；而角膜缘上皮细胞能够保持增殖至第3～5代后才逐渐丧失上皮细胞形态，生长停止(图4)。
图1 角膜缘上皮细胞原代培养第10天 ×100
图3 角膜缘上皮细胞传第3代培养第7天 ×200
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图2 角膜中央上皮细胞原代培养第10天 ×100
图4 角膜中央上皮细胞传第1代第10天 ×100
2.干细胞的增殖能力：统计分析显示，EGF和细胞类型对CFE的影响差异有显著性(F=60.55，P<0.01)(表1)。
表1 不同质量浓度EGF对兔角膜上皮细胞
CFE的影响(n=18) EGF
质量浓度
(ng/ml)
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角膜缘
干细胞
(
±s，%)
角膜中央
上皮细胞
(±s，%)
t值
对照
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5.07±2.35
3.12±1.06
-7.83
5
6.03±2.14
3.74±1.18
-9.75
20
6.11±1.83
4.42±1.38
-7.66
100
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4.76±1.36
2.99±1.10
-10.49
注：对照组与不同质量浓度EGF各组间及角膜缘干细胞与角膜中央上皮细胞间比较，P<0.01 本结果为不同时间CFE的平均数。角膜中央上皮细胞在接种后1周内CFE达到高峰(图5)，随后逐渐下降，而角膜缘干细胞的CFE逐渐升高，至接种后10～12天达到高峰，两者比较角膜缘干细胞的增殖潜力明显高于角膜中央上皮细胞；而不同质量浓度的EGF对角膜上皮细胞增殖均有影响，以5和20 ng/ml质量浓度对促进干细胞增殖作用显著(t=4.02,P<0.01)，100 ng/ml质量浓度作用8天后抑制细胞增殖(t=4.14，P<0.01)。
, 百拇医药
图5 兔角膜上皮细胞增殖曲线及EGF的影响
3.细胞冻存复苏率：按常规细胞冻存复苏方法，细胞复苏后CFE分别为角膜中央上皮细胞的(0.16±0.07)%、角膜缘细胞的(0.43±0.22)%，两者比差异有显著性(t=5.54,P<0.01)。
4.角质蛋白K3表达：在正常兔角膜组织切片的免疫组化染色中，角膜缘基底层细胞角质蛋白K3不表达，表现为细胞染色呈绿色，而表浅细胞则为阳性呈棕黑色，并且越向角膜中央上皮细胞层角质蛋白K3表达越多，在中央上皮基底细胞也可见角质蛋白K3表达(图6～9)。盖玻片上生长的角膜缘上皮细胞在原代培养基本不表达角质蛋白K3(图10)，在传2代细胞时大部分表达角质蛋白K3呈棕黑色(图11，12)。而角膜中央上皮细胞在早期即表达K3。
通过蛋白质免疫印迹检测分析发现，角膜缘干细胞在原代和第2代时能够检测到角质蛋白K3的表达，至第4代时角质蛋白K3为阴性，而角膜中央上皮细胞在原代和传第1代均表达K3， 并且传第1代 细胞表达更明显(图13)。
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图6 正常兔角膜上皮表达角质蛋白K3的兔疫组化染色，示角膜缘 ×100
图8 示图6角膜中周区
图7 示图6角膜周边
图9 示图6角膜中央
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图10 角膜缘干细胞原代培养AE5染色阴性 ×100
图11 角膜缘干细胞第2代AE5染色阳性 A×100，B×400
图12 角膜中央上皮细胞AE5染色阳性 A原代×100，B传第1代早期×100
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M示标准蛋白 1示角膜缘干细胞原代培养 2示干细胞传第2代培养
3示干细胞传第4代培养 4示角膜中央上皮细胞原代培养 5示角膜
中央传第1代培养 6示角膜基质细胞传第1代培养 7示正常兔角膜
上皮细胞(阳性对照) 8示PBS(阴性对照)
图13 兔角膜上皮细胞表达角质蛋白K3的蛋白质印迹
讨论 1.干细胞的增殖能力：1986年Schermer等[5]检测确定角膜缘基底细胞中部分细胞是唯一不表达角质蛋白K3的角膜上皮细胞，从而证实角膜干细胞位于角膜缘基底部。我们采用造血干细胞的脾CFE测定细胞增殖率显示，角膜缘干细胞在培养早期CFE较低，随着对培养环境的适应其增殖潜力逐渐发挥出来，明显较中央上皮细胞高，与Ebato等[7]的研究结果类似。细胞冻存复苏后测定的角膜上皮细胞CFE显示，角膜缘干细胞明显高于角膜中央上皮细胞。然而，由于细胞冻存复苏率普遍偏低，因此有待进一步研究新的细胞保存方法以满足实验的需要。
, 百拇医药
在EGF的作用下，角膜缘干细胞的增殖能力提高超过角膜中央上皮细胞，尤其是在质量浓度为5～20 ng/ml时作用明显，而在质量浓度为100 ng/ml时作用则相对下降，说明该EGF在体外对角膜上皮细胞的促增殖作用有量效关系[8]。
2.干细胞的分化特点：正常角膜上皮组织中角膜缘基底细胞不表达角质蛋白K3是角膜缘干细胞的特性之一，与本研究结果一致。并且原代培养的角膜缘干细胞不表达角质蛋白K3，是因为角膜上皮细胞在培养条件下丧失了表达角质蛋白K3的能力，随着对培养环境的适应细胞逐渐分化表达[9]，保持着角膜上皮细胞的特征，而角膜缘基底细胞具有进一步增殖分化的潜力，可以完成向角膜上皮细胞转化的过程[7]，角膜中央上皮细胞已经处于细胞分化的高级阶段，所以在原代培养时可以部分表达K3。然而，蛋白质免疫印迹显示，角膜缘干细胞在培养早期即有角质蛋白K3的表达，可能一方面是该检测方法敏感性高，少量角质蛋白K3即能测出；另一方面因为培养的角膜缘细胞中干细胞仅为其中的一小部分，主要仍然是角膜上皮细胞，加之该方法是对大量细胞混合物的检测，所以细胞表现为阳性结果。
, 百拇医药
本研究表明，离体培养的角膜缘干细胞在培养的初期(第1、2代)与体内角膜干细胞具有相同的特征，即增殖能力高、具有干细胞固有的分化特征，适合于进行角膜干细胞移植治疗角膜缘功能衰竭症，以及作为药物筛选的细胞模型。
参考文献
[1] Cotsarelis G, Cheng SZ, Dong G, et al. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell, 1989, 57:201-209.
[2] Kruse FE. Stem cells and corneal epithelial regeneration. Eye, 1994, 8:170-183.
, 百拇医药
[3] Pfister RR. Corneal stem cell disease: concepts, categorization and treatment by auto-and homg-transplantation of limbal stem cells. CLAO J, 1994, 20:64-72.
[4] Kruse FE, Tseng SC. A serum-free clonal growth assay for limbal, peripheral, and central corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1991, 32:2086-2095.
[5] Schermer A, Galvin S, Sun TT. Differentiation-related expression of a major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal epithelial stem cells. J Cell Biol, 1986, 103:49-62.
, 百拇医药
[6] 卢圣栋, 主编. 现代分子生物学实验技术. 北京: 高等教育出版社，1993. 403-406.
[7] Ebato B, Friend J, Thoft RA. Comparison of limbal and peripheral human corneal epithelium in tissue culture. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1988, 29: 1533-1537.
[8] Kruse FE, Tseng SC. Growth factors modulate clonal growth and differentiation of cultured rabbit limbal and corneal epitheliun. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1993, 34: 1963-1976.
[9] Kiritoshi A, SundarRaj N, Thoft RA. Differentiation in cultured limbal epithelium as defined by keratin expression. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1991, 32:3073-3077.
(收稿：1998-04-13 修回：1998-09-10), http://www.100md.com
单位：100730 北京市眼科研究所
关键词：角膜缘；干细胞
中华眼科杂志990106 【摘要】 目的 了解角膜缘干细胞体外生长的增殖分化特性，检测上皮细胞生长因子对干细胞增殖的促进作用。方法 采用DMEM和F12培养基进行兔角膜上皮细胞培养，用克隆形成率(colony-forming efficiency, CFE)、免疫组化染色和蛋白质免疫印迹等方法检测细胞的增殖力和分化表达状况。结果 角膜缘干细胞(limbal stem cells, LC)在本培养条件下能够正常传代生长5代，CFE为(5.07±2.35)%，而角膜中央上皮细胞(central corneal epithelial cells, CC)仅第1次传代生长，CFE为(1.12±0.86)%；LC冻存后复苏率为(0.43±0.22)%，CC为(0.16±0.07)%，差异有非常显著性(t=-5.54,P<0.01)；上皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF)在质量浓度为5 ng/ml和20 ng/ml时对细胞的促增殖作用最强(t=-6.51,P<0.01)。干细胞在培养初期，细胞角质蛋白K3染色阴性，第2、3代时逐渐表达；而蛋白质免疫印迹检测早期(原代，第2代)为阳性，晚期(第4代)为阴性。结论 角膜缘干细胞在体外培养的初期更有利于进行干细胞移植治疗和药物筛选
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A study on proliferation and differentiation of limbal stem cells
PAN Zhiqiang, ZHANG Wenhua, SUN Baochen.
Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing 100730
【Abstract】 Objective To study the proliferation and differentiation of limbal stem cells (LCs) in vitro and examine the effects of epithelial growth factor (EGF) on cell proliferation. Methods The cells were cultured in DMEM/F12 medium. The proliferation and differentiation of cultured cells were studied by colony-forming efficiency (CFE), immunohistochemistry staining and Western blot examination. Results LCs could be passaged 5 times in this culture condition. The CFE of stem cells was (5.07±2.35)%, while that of the central epithelial cells (CCs) was (1.12±0.86)%. The rates of freezing and recovery were (0.43±0.22)% in LCs and (0.16±0.07)% in CCs. Limbal stem cells could be stimulated to proliferate better by EGF at the concentration of 5 and 20ng/ml. The staining of keratin 3 (K3) to stem cells in the primary culture was negative, but positive in the second and third passages. However, the expression of K3 by Western blot examination was positive in the primary and second passages but negative in the fourth one. Conclusion It is better for limbal stem cells to be used for transplantation and drug screening in the primary culture.
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【Key words】 Limbus cornea Stem cells
角膜上皮完整性的维持依赖于表浅细胞不断脱落和基底层细胞不断增殖以取代脱落细胞，上皮细胞持续不断的水平向心运动和垂直向上运动源于角膜缘基底层的干细胞增殖和分化[1,2]。由于干细胞对角膜创伤的愈合及透明性维持等方面具有重要作用[3]，通过对体外培养的角膜缘干细胞增殖分化特性的研究，可以加深对干细胞的认识，为将来进行异体干细胞移植准备条件。
材料和方法
1.兔角膜上皮细胞的培养：无菌条件下取新西兰大白兔眼角膜，显微镜下切除残存的结膜和色素组织，将角膜分为中央和角膜缘组织(角膜缘内2mm)，去除角膜内皮细胞后，将组织切成1 mm×2 mm，细胞面向上置于培养瓶中，加入细胞培养基(DMEM和Hams F12培养基的1∶1混合物，20%胎牛血清)，在37℃、体积分数为5% CO2和95%空气条件下进行培养，培养基每2天更换1次，10～12天去除接种组织块。当细胞形成单层达80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶和0.04% EDTA液消化传代(1∶2)。
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2.干细胞的细胞克隆形成率(colony-forming efficiency，CFE)和影响因素：原代培养的细胞消化成单个细胞，2%台盼蓝染色测定活细胞活力，按每孔1×103细胞数接种于24孔培养板，每6孔为一组，每培养板设对照、5、20、100 ng/ml质量浓度的上皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)共4组；角膜缘干细胞和角膜中央上皮细胞各接种3个培养板，每组18孔，接种后第2天加入EGF，第4天开始在倒置显微镜下观察，以细胞团超过4个细胞为一个克隆形成[4]。
3.培养细胞的冻存和复苏：(1)细胞冻存：细胞消化成单细胞悬液，体积分数为15%甘油培养基常规-80℃保存。(2)细胞复苏：细胞取出后在40～42℃水浴1分钟，将细胞接种于24孔板，按每孔1×103细胞，于培养后1周在倒置显微镜下观察。
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4.免疫组化染色：(1)兔眼球摘除后置10%中性甲醛固定24～48小时，常规石蜡包埋切片。(2)不同培养时期生长于盖玻片上的角膜中央上皮细胞和角膜缘细胞按Schermer等[5]方法进行染色。一抗为抗角质蛋白K3鼠单抗AE5(美国Tung-Tien Sun教授馈赠)，二抗为辣根过氧化物酶标羊抗鼠IgG，3.3二氨基联苯胺显色，质量浓度为1%甲基绿复染，镜检摄像。
5.Western Blot分析：不同培养阶段的细胞，常规裂解细胞，用超声细胞处理仪对DNA进行剪切，收集上清液进行蛋白电泳，电转移蛋白至硝酸纤维素膜。用AE5进行抗原抗体反应，设PBS为阴性对照[6]。
6.实验数据经SPSS for Windows 6.0统计软件处理，采用t检验和多因素方差分析等统计方法。
结果
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1.细胞培养：组织块接种后细胞很快呈膜状扩展生长，约10天达生长饱和，细胞大小一致，呈多角形，角膜缘和角膜中央上皮细胞的形态相同，仅后者细胞略大(图1,2)。不同的是角膜中央上皮细胞在传第1代后细胞基本停止生长，细胞从多角形变为长梭形，不能形成细胞单层(图3)；而角膜缘上皮细胞能够保持增殖至第3～5代后才逐渐丧失上皮细胞形态，生长停止(图4)。
图1 角膜缘上皮细胞原代培养第10天 ×100
图3 角膜缘上皮细胞传第3代培养第7天 ×200
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图2 角膜中央上皮细胞原代培养第10天 ×100
图4 角膜中央上皮细胞传第1代第10天 ×100
2.干细胞的增殖能力：统计分析显示，EGF和细胞类型对CFE的影响差异有显著性(F=60.55，P<0.01)(表1)。
表1 不同质量浓度EGF对兔角膜上皮细胞
CFE的影响(n=18) EGF
质量浓度
(ng/ml)
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角膜缘
干细胞
(
±s，%)角膜中央
上皮细胞
(
±s，%)t值
对照
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5.07±2.35
3.12±1.06
-7.83
5
6.03±2.14
3.74±1.18
-9.75
20
6.11±1.83
4.42±1.38
-7.66
100
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4.76±1.36
2.99±1.10
-10.49
注：对照组与不同质量浓度EGF各组间及角膜缘干细胞与角膜中央上皮细胞间比较，P<0.01 本结果为不同时间CFE的平均数。角膜中央上皮细胞在接种后1周内CFE达到高峰(图5)，随后逐渐下降，而角膜缘干细胞的CFE逐渐升高，至接种后10～12天达到高峰，两者比较角膜缘干细胞的增殖潜力明显高于角膜中央上皮细胞；而不同质量浓度的EGF对角膜上皮细胞增殖均有影响，以5和20 ng/ml质量浓度对促进干细胞增殖作用显著(t=4.02,P<0.01)，100 ng/ml质量浓度作用8天后抑制细胞增殖(t=4.14，P<0.01)。
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图5 兔角膜上皮细胞增殖曲线及EGF的影响
3.细胞冻存复苏率：按常规细胞冻存复苏方法，细胞复苏后CFE分别为角膜中央上皮细胞的(0.16±0.07)%、角膜缘细胞的(0.43±0.22)%，两者比差异有显著性(t=5.54,P<0.01)。
4.角质蛋白K3表达：在正常兔角膜组织切片的免疫组化染色中，角膜缘基底层细胞角质蛋白K3不表达，表现为细胞染色呈绿色，而表浅细胞则为阳性呈棕黑色，并且越向角膜中央上皮细胞层角质蛋白K3表达越多，在中央上皮基底细胞也可见角质蛋白K3表达(图6～9)。盖玻片上生长的角膜缘上皮细胞在原代培养基本不表达角质蛋白K3(图10)，在传2代细胞时大部分表达角质蛋白K3呈棕黑色(图11，12)。而角膜中央上皮细胞在早期即表达K3。
通过蛋白质免疫印迹检测分析发现，角膜缘干细胞在原代和第2代时能够检测到角质蛋白K3的表达，至第4代时角质蛋白K3为阴性，而角膜中央上皮细胞在原代和传第1代均表达K3， 并且传第1代 细胞表达更明显(图13)。
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图6 正常兔角膜上皮表达角质蛋白K3的兔疫组化染色，示角膜缘 ×100
图8 示图6角膜中周区
图7 示图6角膜周边
图9 示图6角膜中央
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图10 角膜缘干细胞原代培养AE5染色阴性 ×100
图11 角膜缘干细胞第2代AE5染色阳性 A×100，B×400
图12 角膜中央上皮细胞AE5染色阳性 A原代×100，B传第1代早期×100
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M示标准蛋白 1示角膜缘干细胞原代培养 2示干细胞传第2代培养
3示干细胞传第4代培养 4示角膜中央上皮细胞原代培养 5示角膜
中央传第1代培养 6示角膜基质细胞传第1代培养 7示正常兔角膜
上皮细胞(阳性对照) 8示PBS(阴性对照)
图13 兔角膜上皮细胞表达角质蛋白K3的蛋白质印迹
讨论 1.干细胞的增殖能力：1986年Schermer等[5]检测确定角膜缘基底细胞中部分细胞是唯一不表达角质蛋白K3的角膜上皮细胞，从而证实角膜干细胞位于角膜缘基底部。我们采用造血干细胞的脾CFE测定细胞增殖率显示，角膜缘干细胞在培养早期CFE较低，随着对培养环境的适应其增殖潜力逐渐发挥出来，明显较中央上皮细胞高，与Ebato等[7]的研究结果类似。细胞冻存复苏后测定的角膜上皮细胞CFE显示，角膜缘干细胞明显高于角膜中央上皮细胞。然而，由于细胞冻存复苏率普遍偏低，因此有待进一步研究新的细胞保存方法以满足实验的需要。
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在EGF的作用下，角膜缘干细胞的增殖能力提高超过角膜中央上皮细胞，尤其是在质量浓度为5～20 ng/ml时作用明显，而在质量浓度为100 ng/ml时作用则相对下降，说明该EGF在体外对角膜上皮细胞的促增殖作用有量效关系[8]。
2.干细胞的分化特点：正常角膜上皮组织中角膜缘基底细胞不表达角质蛋白K3是角膜缘干细胞的特性之一，与本研究结果一致。并且原代培养的角膜缘干细胞不表达角质蛋白K3，是因为角膜上皮细胞在培养条件下丧失了表达角质蛋白K3的能力，随着对培养环境的适应细胞逐渐分化表达[9]，保持着角膜上皮细胞的特征，而角膜缘基底细胞具有进一步增殖分化的潜力，可以完成向角膜上皮细胞转化的过程[7]，角膜中央上皮细胞已经处于细胞分化的高级阶段，所以在原代培养时可以部分表达K3。然而，蛋白质免疫印迹显示，角膜缘干细胞在培养早期即有角质蛋白K3的表达，可能一方面是该检测方法敏感性高，少量角质蛋白K3即能测出；另一方面因为培养的角膜缘细胞中干细胞仅为其中的一小部分，主要仍然是角膜上皮细胞，加之该方法是对大量细胞混合物的检测，所以细胞表现为阳性结果。
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本研究表明，离体培养的角膜缘干细胞在培养的初期(第1、2代)与体内角膜干细胞具有相同的特征，即增殖能力高、具有干细胞固有的分化特征，适合于进行角膜干细胞移植治疗角膜缘功能衰竭症，以及作为药物筛选的细胞模型。
参考文献
[1] Cotsarelis G, Cheng SZ, Dong G, et al. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell, 1989, 57:201-209.
[2] Kruse FE. Stem cells and corneal epithelial regeneration. Eye, 1994, 8:170-183.
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[3] Pfister RR. Corneal stem cell disease: concepts, categorization and treatment by auto-and homg-transplantation of limbal stem cells. CLAO J, 1994, 20:64-72.
[4] Kruse FE, Tseng SC. A serum-free clonal growth assay for limbal, peripheral, and central corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1991, 32:2086-2095.
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(收稿：1998-04-13 修回：1998-09-10), http://www.100md.com