核因子κB在人角膜基质细胞中的表达
作者：赵锦 吴静安
单位：100034 北京医科大学第一医院眼科
关键词：NF-kappaB；角膜；成纤维细胞；脂多糖类
中华眼科杂志990104 【摘要】 目的 探讨核因子κB(nuclear-factor-κB，NF-κB)在人角膜基质成纤维细胞中的基础表达及激活情况。方法 取体外培养的第2或3代人角膜基质细胞，同步化后分为2组：无血清的DMEM液培养的不加药组；含质量浓度为10 μg/ml脂多糖的DMEM液培养6小时的加药组。均采用免疫荧光抗体染色、流式细胞仪计数法和核蛋白提取物凝胶迁移率法检测。结果 流式细胞计数法示，角膜基质细胞内NF-κB的基础表达率为9.4%，脂多糖作用后升高2.2倍(30.0%)。凝胶迁移率法示，刺激后的细胞核内出现了具有DNA结合活性的核转录因子。结论 核转录因子存在于人角膜基质细胞中，能够被脂多糖激活，表达量增加，并且转入细胞核内与相应的DNA结合而发挥调控基因转录的作用。
, 百拇医药
Expression of nuclear transcription factor
NF-κB in human corneal fibroblasts
ZHAO Jin, WU Jing'an.
Department of Ophthalmology, The First Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To explore the constitutive expression and activation of nuclear transcription factor NF-κB in corneal fibroblasts. Methods 2 or 3 passage corneal fibroblasts cultured in vitro were divided into two groups after synchronization. One group was cultured in DEME free of serum; the other in DEME with 10 μg/ml lipopolysaccharides for 6 hours. NF-κB was studied by flow cytometry (FCM) technique using immunofluorescent staining, and by gel shift assay (EMSA) using γ-32P labeled NF-κB oligonucleotide probe. Results According to FCM results, there were constitutively 9.4% NF-κB positive corneal fibroblasts, and 2.2 folds more (30.0%) after stimulated with lipopolysacchrides. Using EMSA method, we demonstrated the existence of NF-κB with DNA binding activity in the stimulated nuclei. Conclusion There is nuclear transcription factor NF-κB in human corneal fibroblasts. When activated, cells express more transcription factor which can enter nuclei, bind itself to the related DNAs and play a regulatory role of gene transcription.
, 百拇医药
【Key words】 NF-κB Cornea Fibroblasts Lipopolysaccharides
核因子κB(nuclear-factor-κB，NF-κB)是众多转录因子中与免疫、炎症关系较密切的一个。它自1986年被发现以来，已证明在免疫细胞激活、抗病毒和抗菌反应、多种应激反应、细胞凋亡的调控、B细胞和T细胞的生成及胚胎发育等许多方面起着重要的作用[1]。已有研究表明，NF-κB参与肺部炎症及类风湿性关节炎的发生，促进炎性因子的产生[2，3]。角膜作为眼部屏障和屈光系统的重要组成部分，其对应激及炎症刺激的反应将直接影响视力。NF-κB是否存在于角膜中，其表达水平在静止和诱导状态下有何变化，目前尚无报道。我们对体外培养的人角膜基质成纤维细胞表达这一核转录因子的情况进行检测分析，现将结果报告如下。
材料与方法
, 百拇医药
1.主要试剂与材料：DMEM培养基、抗生素及胰蛋白酶(美国Gibco公司)；胎牛血清(中国医学科学院血液研究所)；脂多糖来自沙门氏菌，poly(dI-dC)(美国Sigma公司)；兔抗人NF-κB p65多克隆抗体和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记羊抗兔IgG(美国Santa及Jackson公司)，NF-κB寡核苷酸及T4多核苷酸激酶(美国Promega公司)；Sephadex-G 25(瑞士Pharmacia公司)。正常人角膜(北京医科大学第一医院眼库提供)。
2.角膜基质细胞的体外培养及同步化：无菌条件下取无任何眼疾的人角膜片(年龄生后5天至10个月)，先置于0.25%胰蛋白酶中消化20分钟后，在解剖显微镜下刮除角膜上皮及内皮层，将角膜基质层剪切成1 mm×1 mm×1 mm，接种于15 cm×15 cm玻璃培养瓶中，置37℃、体积分数为5% CO2孵箱内贴壁1～2小时后，加入1.5 ml含100 U/ml青霉素、50 U/ml庆大霉素和质量浓度为100 mg/L链霉素的20%胎牛血清DMEM液，相同条件培养至汇合后，0.25%胰蛋白酶消化传代于35 cm×35 cm培养瓶中，用10%胎牛血清DMEM液继续培养，如此至第2或3代细胞。实验所用细胞一般为第2或3代角膜基质细胞。实验前，将角膜基质细胞用无血清的DMEM培养基培养24～36小时，使细胞达到同步化。
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3.免疫荧光抗体染色、流式细胞计数法(flow cytometry，FCM)检测：取第2或3代60%～70%汇合的角膜基质细胞，分为2组：未加药组继续用无血清的DMEM液培养；加药组用质量浓度为含10 mg/L脂多糖的DMEM液培养。6小时后，0.01 mol/L PBS反复洗涤，并用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA(1∶1)将细胞消化成单细胞悬液，依次加入体积分数为2%兔抗人NF-κB p65多克隆抗体，置4℃ 45分钟；体积分数为1% FITC标记的羊抗兔IgG，置4℃ 45分钟。另设2组阴性对照：一组不加Ⅰ抗和Ⅱ抗，用于荧光强度的基线校正；另一组单加Ⅱ抗，作为非特异性结合对照。所有样品分别加400 μl FACS保存液，4℃避光保存，1周内用FACSTAR流式细胞仪检测，并将实验重复2次，结果取均值。
4.核蛋白提取及浓度测定：参照Dignam等[4]的方法作适当改动。取2组细胞，每瓶约106个细胞，以刮刀刮下，0.01 mol/L PBS洗涤后，加缓冲液A(buffer A)和核蛋白抽取液(NP-40)裂解离心，提取细胞核，再加缓冲液C(buffer C)作用，收集上清液中的核蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后，置于-70℃保存。提取过程温度始终保持4℃以下。
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5.凝胶迁移率法检测核蛋白NF-κB与DNA的结合活性[5]：在T4激酶作用下，将[γ-32P]ATP标记于NF-κB寡核苷酸上，放置37℃ 1小时；经Sephadex-G25离心柱层析纯化后，液闪计数仪检测探针的放射比活度。取约105 cpm探针与8 mg核蛋白提取物杂交，置室温下30分钟，于4%非变性的聚丙烯酰胺胶中电泳，70℃真空抽干2小时，置于暗盒内，-20℃放射自显影24～72小时。
结果
1.免疫细胞化学染色、流式细胞仪检测结果：NF-κB在角膜基质细胞的基础表达率为9.4%，经质量浓度为10 mg/L脂多糖作用6小时后升高2.2倍，达30.0%。非特异结合对照组的基础表达率为1.8%。
2.凝胶迁移率结果：如图1所示，不加药组中未检测到有DNA结合活性的NF-κB，加药组则出现明显的阳性条带。在竞争抑制实验中，加入100倍未标记同位素的冷探针，阳性带消失，证明了核蛋白与探针结合的特异性。
, 百拇医药
1示阴性对照组 2示加药组
3示不加药组 4示加入100倍
冷探针组
图1 凝胶迁移率结果
讨论 1.NF-κB存在于人角膜基质细胞：本研究结果表明，NF-κB存在于人角膜基质细胞中，能够被脂多糖激活，转移入细胞核内，成为能够与特定序列DNA结合的活性形式。基质层占角膜厚度的9/10，其中含有多种细胞因子的受体，可表达IL-6等多种炎性因子，病原体侵入后，免疫反应主要发生在此层[6，7]。因此，经致炎因素脂多糖刺激后，NF-κB在基质细胞中的表达变化对于整个角膜而言，具有一定的代表性。已有学者发现，角膜上皮内的花生四烯酸代谢物诱发炎症及角膜新生血管的作用与NF-κB有关[8]。Yoshida等[9]报道，缺氧可激活视网膜色素上皮细胞内的NF-κB，诱导包括IL-8在内的多种炎性因子基因表达，促进视网膜色素上皮细胞增殖和新生血管形成，导致视力丧失。NF-κB在人角膜基质中的表达情况是本研究所要解决的问题。
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脂多糖是细菌降解的产物之一，是重要的致炎因子。经免疫细胞化学、流式细胞计数检测发现：体外培养处于G0期的人角膜基质细胞表达较低量的NF-κB(阳性率9.4%)经脂多糖刺激后，表达水平明显增高(阳性率30.0%)。这证明细胞在应激状态下表达NF-κB增多，间接说明此过程中NF-κB有可能被活化。只有转移到细胞核内的NF-κB才可能发挥基因转录调节作用。我们应用凝胶迁移率试验对提取的核蛋白进行检测，进一步证明了在脂多糖作用后，角膜基质细胞内出现了具有DNA结合活性的NF-κB。
2.人角膜基质细胞内NF-κB活化的意义：NF-κB活化的意义在于，它是一种重要的基因转录调节蛋白，能快速接受外界信息，活化后进入细胞核，与靶基因结合，调控细胞粘附分子、白介素等多种细胞因子的转录，是炎症、免疫和急性期反应的核心调控因素[1]。近年来，人们发现了许多种与角膜疾患有关的细胞因子，它们相互影响，难于辨别何者作用更重要。核转录因子作为细胞粘附分子、免疫受体、一氧化氮合成酶等多种基因转录的调控因素，其作用不能不引起人们的重视。本研究初步探讨了人角膜基质细胞内NF-κB的表达情况，为进一步明确其在角膜疾患中的作用，从而为利用其建立一种筛选新药的有效手段奠定基础。
, http://www.100md.com
参考文献
[1] Siebenlist U, Franzoso G, Brown K. Structure, regulation and function of NF-kappa B. Annu Rev Cell Biol, 1994,10：405-455.
[2] Blackwell TS, Holden EP, Blackwell TR, et al. Cytokine-induced neutrophil chemoaattractant mediates neutrophilic alveolitis in rats: association with nuclear factor kappa B activation. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994,11：464-472.
[3] Asakara H, Asanuma M, Ogawa N, et al. High DNA-binding activity of transcription factor NF-κB in synovial memberances of patients with rheumatoid arthritis. Biochem Mol Bio Int, 1995,37：827-832.
, 百拇医药
[4] Dignam JD, Lebovitz RM, Roeder RG. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res, 1983,11：1475-1489.
[5] Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocols in molecular biology 2nd ed. New York: Wiley, 1992.12-5.
[6] Li DQ, Tseng SCG. Differential regulation of cytokine and receptor transcript expression in human corneal and limbal fibroblasts by epidermal growth factor B, transforming growth factor-a, platelet-derived growth factor B and interleukine-1b. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1996,37：2068-2080.
, http://www.100md.com
[7] Cubitt CL, Lausch RN, Oakes JE. Differences in interleukine-6 gene expression between cultured human corneal epithelial cells and keratocytes. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1995,36：330-336.
[8] Schwartzman ML, Stoltz RA, Rapcon MM, et al. Rapid and sterospecific activation of NF-κB by a corneal angiogenic eicosanoid in microvessel endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994,35：1466-1469.
[9] Yoshida A, Yoshida S, Hata Y. Expression of NF-κB in retinal neovascularization possible involvement of IL-8. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1997,38(Suppl)：S611.
(收稿：1998-03-06 修回：1998-09-20), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一医院眼科
关键词：NF-kappaB；角膜；成纤维细胞；脂多糖类
中华眼科杂志990104 【摘要】 目的 探讨核因子κB(nuclear-factor-κB，NF-κB)在人角膜基质成纤维细胞中的基础表达及激活情况。方法 取体外培养的第2或3代人角膜基质细胞，同步化后分为2组：无血清的DMEM液培养的不加药组；含质量浓度为10 μg/ml脂多糖的DMEM液培养6小时的加药组。均采用免疫荧光抗体染色、流式细胞仪计数法和核蛋白提取物凝胶迁移率法检测。结果 流式细胞计数法示，角膜基质细胞内NF-κB的基础表达率为9.4%，脂多糖作用后升高2.2倍(30.0%)。凝胶迁移率法示，刺激后的细胞核内出现了具有DNA结合活性的核转录因子。结论 核转录因子存在于人角膜基质细胞中，能够被脂多糖激活，表达量增加，并且转入细胞核内与相应的DNA结合而发挥调控基因转录的作用。
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Expression of nuclear transcription factor
NF-κB in human corneal fibroblasts
ZHAO Jin, WU Jing'an.
Department of Ophthalmology, The First Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To explore the constitutive expression and activation of nuclear transcription factor NF-κB in corneal fibroblasts. Methods 2 or 3 passage corneal fibroblasts cultured in vitro were divided into two groups after synchronization. One group was cultured in DEME free of serum; the other in DEME with 10 μg/ml lipopolysaccharides for 6 hours. NF-κB was studied by flow cytometry (FCM) technique using immunofluorescent staining, and by gel shift assay (EMSA) using γ-32P labeled NF-κB oligonucleotide probe. Results According to FCM results, there were constitutively 9.4% NF-κB positive corneal fibroblasts, and 2.2 folds more (30.0%) after stimulated with lipopolysacchrides. Using EMSA method, we demonstrated the existence of NF-κB with DNA binding activity in the stimulated nuclei. Conclusion There is nuclear transcription factor NF-κB in human corneal fibroblasts. When activated, cells express more transcription factor which can enter nuclei, bind itself to the related DNAs and play a regulatory role of gene transcription.
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【Key words】 NF-κB Cornea Fibroblasts Lipopolysaccharides
核因子κB(nuclear-factor-κB，NF-κB)是众多转录因子中与免疫、炎症关系较密切的一个。它自1986年被发现以来，已证明在免疫细胞激活、抗病毒和抗菌反应、多种应激反应、细胞凋亡的调控、B细胞和T细胞的生成及胚胎发育等许多方面起着重要的作用[1]。已有研究表明，NF-κB参与肺部炎症及类风湿性关节炎的发生，促进炎性因子的产生[2，3]。角膜作为眼部屏障和屈光系统的重要组成部分，其对应激及炎症刺激的反应将直接影响视力。NF-κB是否存在于角膜中，其表达水平在静止和诱导状态下有何变化，目前尚无报道。我们对体外培养的人角膜基质成纤维细胞表达这一核转录因子的情况进行检测分析，现将结果报告如下。
材料与方法
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1.主要试剂与材料：DMEM培养基、抗生素及胰蛋白酶(美国Gibco公司)；胎牛血清(中国医学科学院血液研究所)；脂多糖来自沙门氏菌，poly(dI-dC)(美国Sigma公司)；兔抗人NF-κB p65多克隆抗体和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记羊抗兔IgG(美国Santa及Jackson公司)，NF-κB寡核苷酸及T4多核苷酸激酶(美国Promega公司)；Sephadex-G 25(瑞士Pharmacia公司)。正常人角膜(北京医科大学第一医院眼库提供)。
2.角膜基质细胞的体外培养及同步化：无菌条件下取无任何眼疾的人角膜片(年龄生后5天至10个月)，先置于0.25%胰蛋白酶中消化20分钟后，在解剖显微镜下刮除角膜上皮及内皮层，将角膜基质层剪切成1 mm×1 mm×1 mm，接种于15 cm×15 cm玻璃培养瓶中，置37℃、体积分数为5% CO2孵箱内贴壁1～2小时后，加入1.5 ml含100 U/ml青霉素、50 U/ml庆大霉素和质量浓度为100 mg/L链霉素的20%胎牛血清DMEM液，相同条件培养至汇合后，0.25%胰蛋白酶消化传代于35 cm×35 cm培养瓶中，用10%胎牛血清DMEM液继续培养，如此至第2或3代细胞。实验所用细胞一般为第2或3代角膜基质细胞。实验前，将角膜基质细胞用无血清的DMEM培养基培养24～36小时，使细胞达到同步化。
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3.免疫荧光抗体染色、流式细胞计数法(flow cytometry，FCM)检测：取第2或3代60%～70%汇合的角膜基质细胞，分为2组：未加药组继续用无血清的DMEM液培养；加药组用质量浓度为含10 mg/L脂多糖的DMEM液培养。6小时后，0.01 mol/L PBS反复洗涤，并用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA(1∶1)将细胞消化成单细胞悬液，依次加入体积分数为2%兔抗人NF-κB p65多克隆抗体，置4℃ 45分钟；体积分数为1% FITC标记的羊抗兔IgG，置4℃ 45分钟。另设2组阴性对照：一组不加Ⅰ抗和Ⅱ抗，用于荧光强度的基线校正；另一组单加Ⅱ抗，作为非特异性结合对照。所有样品分别加400 μl FACS保存液，4℃避光保存，1周内用FACSTAR流式细胞仪检测，并将实验重复2次，结果取均值。
4.核蛋白提取及浓度测定：参照Dignam等[4]的方法作适当改动。取2组细胞，每瓶约106个细胞，以刮刀刮下，0.01 mol/L PBS洗涤后，加缓冲液A(buffer A)和核蛋白抽取液(NP-40)裂解离心，提取细胞核，再加缓冲液C(buffer C)作用，收集上清液中的核蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后，置于-70℃保存。提取过程温度始终保持4℃以下。
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5.凝胶迁移率法检测核蛋白NF-κB与DNA的结合活性[5]：在T4激酶作用下，将[γ-32P]ATP标记于NF-κB寡核苷酸上，放置37℃ 1小时；经Sephadex-G25离心柱层析纯化后，液闪计数仪检测探针的放射比活度。取约105 cpm探针与8 mg核蛋白提取物杂交，置室温下30分钟，于4%非变性的聚丙烯酰胺胶中电泳，70℃真空抽干2小时，置于暗盒内，-20℃放射自显影24～72小时。
结果
1.免疫细胞化学染色、流式细胞仪检测结果：NF-κB在角膜基质细胞的基础表达率为9.4%，经质量浓度为10 mg/L脂多糖作用6小时后升高2.2倍，达30.0%。非特异结合对照组的基础表达率为1.8%。
2.凝胶迁移率结果：如图1所示，不加药组中未检测到有DNA结合活性的NF-κB，加药组则出现明显的阳性条带。在竞争抑制实验中，加入100倍未标记同位素的冷探针，阳性带消失，证明了核蛋白与探针结合的特异性。
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1示阴性对照组 2示加药组
3示不加药组 4示加入100倍
冷探针组
图1 凝胶迁移率结果
讨论 1.NF-κB存在于人角膜基质细胞：本研究结果表明，NF-κB存在于人角膜基质细胞中，能够被脂多糖激活，转移入细胞核内，成为能够与特定序列DNA结合的活性形式。基质层占角膜厚度的9/10，其中含有多种细胞因子的受体，可表达IL-6等多种炎性因子，病原体侵入后，免疫反应主要发生在此层[6，7]。因此，经致炎因素脂多糖刺激后，NF-κB在基质细胞中的表达变化对于整个角膜而言，具有一定的代表性。已有学者发现，角膜上皮内的花生四烯酸代谢物诱发炎症及角膜新生血管的作用与NF-κB有关[8]。Yoshida等[9]报道，缺氧可激活视网膜色素上皮细胞内的NF-κB，诱导包括IL-8在内的多种炎性因子基因表达，促进视网膜色素上皮细胞增殖和新生血管形成，导致视力丧失。NF-κB在人角膜基质中的表达情况是本研究所要解决的问题。
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脂多糖是细菌降解的产物之一，是重要的致炎因子。经免疫细胞化学、流式细胞计数检测发现：体外培养处于G0期的人角膜基质细胞表达较低量的NF-κB(阳性率9.4%)经脂多糖刺激后，表达水平明显增高(阳性率30.0%)。这证明细胞在应激状态下表达NF-κB增多，间接说明此过程中NF-κB有可能被活化。只有转移到细胞核内的NF-κB才可能发挥基因转录调节作用。我们应用凝胶迁移率试验对提取的核蛋白进行检测，进一步证明了在脂多糖作用后，角膜基质细胞内出现了具有DNA结合活性的NF-κB。
2.人角膜基质细胞内NF-κB活化的意义：NF-κB活化的意义在于，它是一种重要的基因转录调节蛋白，能快速接受外界信息，活化后进入细胞核，与靶基因结合，调控细胞粘附分子、白介素等多种细胞因子的转录，是炎症、免疫和急性期反应的核心调控因素[1]。近年来，人们发现了许多种与角膜疾患有关的细胞因子，它们相互影响，难于辨别何者作用更重要。核转录因子作为细胞粘附分子、免疫受体、一氧化氮合成酶等多种基因转录的调控因素，其作用不能不引起人们的重视。本研究初步探讨了人角膜基质细胞内NF-κB的表达情况，为进一步明确其在角膜疾患中的作用，从而为利用其建立一种筛选新药的有效手段奠定基础。
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参考文献
[1] Siebenlist U, Franzoso G, Brown K. Structure, regulation and function of NF-kappa B. Annu Rev Cell Biol, 1994,10：405-455.
[2] Blackwell TS, Holden EP, Blackwell TR, et al. Cytokine-induced neutrophil chemoaattractant mediates neutrophilic alveolitis in rats: association with nuclear factor kappa B activation. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994,11：464-472.
[3] Asakara H, Asanuma M, Ogawa N, et al. High DNA-binding activity of transcription factor NF-κB in synovial memberances of patients with rheumatoid arthritis. Biochem Mol Bio Int, 1995,37：827-832.
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[4] Dignam JD, Lebovitz RM, Roeder RG. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res, 1983,11：1475-1489.
[5] Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocols in molecular biology 2nd ed. New York: Wiley, 1992.12-5.
[6] Li DQ, Tseng SCG. Differential regulation of cytokine and receptor transcript expression in human corneal and limbal fibroblasts by epidermal growth factor B, transforming growth factor-a, platelet-derived growth factor B and interleukine-1b. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1996,37：2068-2080.
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[7] Cubitt CL, Lausch RN, Oakes JE. Differences in interleukine-6 gene expression between cultured human corneal epithelial cells and keratocytes. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1995,36：330-336.
[8] Schwartzman ML, Stoltz RA, Rapcon MM, et al. Rapid and sterospecific activation of NF-κB by a corneal angiogenic eicosanoid in microvessel endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994,35：1466-1469.
[9] Yoshida A, Yoshida S, Hata Y. Expression of NF-κB in retinal neovascularization possible involvement of IL-8. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1997,38(Suppl)：S611.
(收稿：1998-03-06 修回：1998-09-20), 百拇医药