反义寡核苷酸设计策略与学习记忆研究
作者：熊 鹰 蔡文琴 李希成 隋建峰
单位：熊鹰 蔡文琴 李希成 隋建峰(40038 四川省重庆第三军医大学)
关键词：
中国行为医学科学990144 反义核酸是指与体内某RNA或DNA序列具有互补顺序，并能通过碱基配对与互补链杂交，从而影响其转录或翻译过程的RNA或DNA片段。反义RNA和DNA的特异性源自反义序列和靶序列之间的碱基配对。反义核酸的长度可长可短，长的反义核酸一般都借助表达载体导入细胞，通过在细胞中进行转录而实现功能。反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides ，ODN)是短序列的单链DNA，在体外通过化学合成，与细胞内特异的靶序列互补。ODN比通过表达载体导入的方式应用广泛，而且由于它可以作为反义药物应用于临床，因此，ODN 的研究已引起了广泛的重视[1，2]。
, http://www.100md.com
一、反义ODN的作用机理及设计策略
反义ODN主要通过以下途径发挥作用：(1)抑制翻译[3、4]. 反义ODN通过与目标mRNA 发生碱基特异性互补结合，形成杂交双链体，阻止核糖体与重要起始因子结合，使其不能启动翻译；一般以针对翻译起始区的ODN效果最佳，在此区域内可直接抑制翻译起始复合物与 mRNA起始位点结合。(2)抑制转录后加工. 真核生物mRNA的核内加工包括5'端加帽结构、 内部甲基化、3'端加polyA及剪接等 ，最后转运到胞质成为成熟的mRNA，反义ODN 可影响其中的任一环节。(3)抑制DNA复制和转录. 反义ODN通过在DNA结合蛋白的识别位点处与DNA双螺旋结合形成三螺旋，阻止基因的转录和复制，又称为反基因ODN。理论上， 反基因策略具有明显优点，因为DNA序列一般是单拷贝，较之mRNA的多拷贝，只需少量的ODN与DNA 靶序列结合，即可达到较强的抑制效果。但这种策略有一定的局限性，在三聚体中其靶序列不易寻找，而且，ODN进入核内需要通过更多的屏障，并且可能造成非特异性杂交，甚至基因突变[5]。
, 百拇医药
反义ODN的设计策略主要考虑以下几方面[1、2、6、7、8]: (1)特异性 反义ODN 与靶核酸之间的特异性一方面与其长度和顺序有关，另一方面与活细胞中基因组和mRNA的复杂性有关。此外，针对某些序列的ODN本身也可能发生内部碱基互补形成发夹样结构，设计时应予考虑。(2)ODN长度 从杂交链的稳定性来看，ODN越长越好，但过长时，不易通过细胞膜，而且与非靶序列结合机率增加，会引起非特异抑制作用。一般认为ODN的长度以15～25个碱基较为合适。(3)化学修饰 未修饰的ODN易被核酸酶降解，而且不易被细胞摄取。化学修饰包括主链修饰和末端修饰，其中主链修饰包括对磷酸、糖环和碱基的修饰及寡核苷酸构型的改变。末端修饰主要是对末端疏水基团的修饰，从而有助于寡核苷酸进入靶细胞。S-ODN 均有较强的抗核酸酶的能力，能在较低的浓度下诱导RNase H的活性，合成和纯化容易，水溶性较高， 因而应用最广泛。(4)亲和性 ODN对靶序列的亲和力来自相互杂交作用。结合的自由能来自两个主要方面：形成双螺旋的氢键和碱基堆积。由于GC之间的亲和力比AU之间的亲和力大，因此，增加针对GC的靶序列的碱基在ODN的比例，可增加其杂交亲和性，而适当减少ODN的长度。(5)合理对照 ODN实验需要严格的对照才能明确其是否具有特异抑制效应及是否存在副作用。以往的实验常用正义链(sense)作对照，现在一般采用无义( missense) 或反向(reverse)作对照。
, http://www.100md.com
二、反义ODN在学习记忆研究中的应用
现代分子生物学技术使研究者发现越来越多的基因在中枢神经系统表达。然而，我们对于这些基因的功能了解很少或者根本不了解。反义寡核苷酸技术能够有效的探讨这些基因的作用。Rickman同时使用了转基因Knockout和反义knockdown技术研究trkb配基在视网膜神经元发育中的作用，反义knockdown技术避免了trkb转基因操作的一些缺点，尤其是转基因小鼠出生后极低的存活率。Robertson认为反义途径比转基因技术有很多优越性，如应用范围广、具有可逆性和解剖特异性、没有复杂的发育问题以及花费较低等[2]。
学习记忆的研究需要弄清特异脑区的分子机制和由学习产生的行为修饰的因果关系，采用传统的神经电生理和生化的方法，搞清这一关系较为困难。现在通过转基因小鼠和反义核酸两个途径使我们能够研究特异的基因在学习记忆过程中的作用。本文综述反义ODN 在学习记忆研究中的应用。
, 百拇医药
1. 研究快反应基因在记忆中的作用
快反应基因(immediately early genes，IEGs) 具有把短时程作用的细胞外信号和细胞功能的长时程改变耦联起来的作用。长时记忆的形成依赖脑内RNA和蛋白质的合成， 而这些与记忆相关的蛋白是由IEGs启动细胞内特异的目的基因(迟反应基因)表达的产物，有假说认为，细胞外信号激活胞浆第二信使(Ca2+，cAMP，IP3等)，后者再激活IEGs的表达，进而启动目的基因的表达而形成长期记忆[9、10]。
快反应基因fos和jun家族的表达产物是转录调节蛋白。它们通过形成二聚体复合物调节靶基因的表达。在哺乳动物中枢神经系统，c-fos，c-jun以及其它IEGs的表达可被各种刺激包括长时程增强(LTP)、长时程抑制(LTD)以及行为训练等诱导[9]。在分辨训练以后大鼠边缘系统的c-fos表达增多；Y迷宫训练后，大脑皮层c-jun mRNA表达明显增多；Anokhin等的实验表明小鸡c-fos和c-jun的表达在辨别学习和被动回避学习以后增多；Heurteaux则证实小鼠海马c-jun mRNA 在食物压杆操作学习后表达增强[10～14]。理论上可用Fos、Jun蛋白抗体来阻断其作用来研究Fos、Jun的生理功能，但Fos，Jun抗体不易进入细胞，特异性也不高，而IEGs反义ODN较易进入细胞且具有高选择性，对于c-fos、c-jun等确切功能的研究是一种理想的手段。
, 百拇医药
Tischmeyer(1994)[15]研究了反义c-jun和jun-B ODN对大鼠明暗分辨学习的影响。反义c-jun S-ODN的序列：TGCAGTCATAGAAC，反义jun-B：TTTCGTGCACATCC。 反义 c-jun 对照:TGCACTGATACAAC。双侧海马埋管，2mM/μl的S-ODN间隔8h在两侧海马注射，在最后一次注射后2h，首先观察大鼠的开场行为(open field)，然后进行分辨训练。大鼠在24h、48h、72h进行重复训练。结果，反义c-jun S-ODN海马内注射显著损害大鼠明暗分辨学习的完成， 而反义jun B S-ODN无明显影响。Northern杂交分析表明，训练后jun-B mRNA 在海马和大脑皮层的表达增加2～3倍，而c-jun mRNA的表达只在大脑皮层增加。35S标记的硫代ODN(S-ODN)在海马锥体细胞的大部分以及齿状回颗粒细胞有分布。靠近注射位点的胼胝体纤维和皮质区也有强烈标记。在FITC标记的S-ODN注射后26h，在海马锥体细胞以及注射位点周围仍然可观察到强烈的信号。海马内注射反义c-jun S-ODN的行为效果是由于降低了c-jun的稳定表达，而不是抑制其诱导，因为海马c-jun mRNA水平在明暗分辨学习以后没有增加。抑制c-jun表达主要影响分辨学习的习得，学习的损害似乎并不是由于反义c-jun注射后机体的简单神经反射造成的，因为在分辨学习前的开场行为测试中，实验组和对照组没有差异。反义jun-B 对分辨学习没有影响，说明两个问题:残留的jun-B的表达足够应付学习记忆的需要；jun-B的表达不是分辨学习习得和巩固必需的。本文作者观察到反义c-jun S-ODN对早期发育大鼠学习记忆行为以及LTP的损害更显著[16]。
, http://www.100md.com
小鸡进行一次性被动回避反应训练后，特定脑区发生一系列的生化反应过程，突触受到各种信使和调制物的修饰，这种修饰与记忆的早期驻留或长期贮存的形成有关。要产生长期记忆，突触瞬间态就必需转化为膜构象的长期性变化，因而必须要有基因的活动。根据这个观点，Rose发现被动回避训练会使c-fos、c-jun表达增强，如果在训练前用注射c-fos 的反义ODN探针的方法封闭fos的表达，则动物就健忘。这一基因活化可能是由膜信号传导，尤其是钙通道打开和磷酸化反应引起磷酸肌醇循环的激活所发动的[17]。
2.研究某些肽类物质、蛋白质以及受体在记忆中的作用
Schmidt采用反义ODN技术研究了ependymin在金鱼脑内记忆巩固 中的作用。在学习过程以后，中枢神经系统获得的信息可以作为记忆踪迹永久保存，记忆巩固的这一阶段对转录和翻译的生化抑制剂的干扰很敏感。Ependymin 是金鱼脑内与记忆巩固有关的特异的中枢神经系统糖蛋白，在主动回避反应训练以后， ependymin mRNA 在脑膜成纤维细胞快速诱导。将18个碱基的反义ependymin S- ODN 在主动回避反应训练前注射到脑脊液中， 主要抑制新的ependymin分子的合成，而不干扰已经存在的ependymin。注射S-ODN 的动物可以学会回避反应，然而，不能保持这一记忆。S-ODN不干扰overtrained大鼠主动回避反应的完成和再现。分析FITC结合的ODN探针，在成纤维细胞显示强烈的网状FITC-S-ODN荧光， 成纤维细胞是已知的ependymin唯一的合成位点。结果显示在体选择性抑制ependymin基因的表达能够特异性阻止记忆的形成。作者认为只有新合成的ependymin分子与记忆巩固过程有关， 其原因可能是由于它们还没有经历不可逆的分子改变[18、19]。
, http://www.100md.com
小脑在运动学习记忆中起关键作用，以前的报道发现，下橄榄核的胰岛素样生长因子I(insulin-like growth factor I，IGF-I)调制谷氨酸诱导的小脑Purkinje细胞的GABA释放，在此基础上，Castro-Alamancos采用反义ODN技术研究IGF-I 是否是运动学习的调制因子。Purkinje 细胞的突触可塑性被认为是运动学习的关键。 反义IGF-I ODN(5'-ACTGCTGATTTCCCCAT-3')的设计是针对大鼠IGF-I外显子1的转录起始位点。反义IGF-I ODN(50μg/5μl)下橄榄核注射完全抑制大鼠瞬目条件反射。这一阻断是可逆的，在小脑IGF-I 返回到正常水平时条件反射恢复。但反义IGF-I对瞬目条件反射的保持没有影响[20]。
Skutella设计了针对大鼠酪氨酸羟化酶(TH) mRNA起始编码区的反义ODN，TH是调控儿茶酚胺合成代谢通路限制酶的转录信使。将反义TH ODN注射到腹侧被盖区(VTA)，36 小时后检测，操作行为显著减少，TH在VTA的免疫活性也减少。此效应在注射后5天完全消失。这一结果表明通过在边缘系统注射反义TH ODN可特异性的抑制TH的表达，这样为在体研究行为、动机等提供了一个新工具[21]。应用这一技术，Skutella进一步研究了反义CRH ODN 对应急诱导的焦虑行为的影响。CRH是应急反应的主要调节因子，反义CRH S-ODN侧脑室注射( 30μg/ 3μl)3次，间隔12h，在最后一次注射6小时后，大鼠进行应急反应，随后在水平十字迷宫中测试，大鼠在臂上停留的时间更长，表明焦虑相关行为显著减少，而且反义注射抑制应急诱导的CRH mRNA 和CRH在下丘脑的显著升高，以及血浆ACTH水平的升高[22]。
, http://www.100md.com
Matthies采用反义寡核苷酸策略研究NMDA/R1受体亚单位在LTP中的作用。反义NMDA/R1(10nmol)注入7周龄大鼠脑室，连续3天，然后进行脑片LTP的记录。结果反义注射组PS 增幅明显小于对照组，这种现象在串刺激后持续50min。而fEPSP的增加只持续了15分钟。反义注射组[3H]谷氨酸与海马细胞膜上的 NMDA 受体的特异性结合减少 63% 。 这些结果表明反义NMDA/R1脑室应用后能够达到目标区，并且抑制NMDA/R1 mRNA 的翻译。 它们进一步支持了NMDA/R1在LTP中有重要作用的观点[23]。
以反义ODN技术研究基因在学习记忆中的调控作用，目前的报道尚不多， 这一技术本身还有一些缺陷，如稳定性问题，某些修饰成分带来的细胞毒性问题等，目前尚没有达到常规的、程序化的应用阶段，但是与转基因技术相比，由于其应用范围广、没有复杂的发育问题以及花费较低等，因此,这一方法有广阔的发展前景[2]。
, http://www.100md.com
参考文献
[1] 黄胜和.反义核酸与基因治疗.见彭朝晖等主编.基因治疗与临床. 北京：中国科学技术出版社出版,1994：143～160.
[2] leslie R, Jones D. Antisense gene knockdown in the nervous system revisited:optimism for the future.TINS,1997,20(8):321～322.
[3] Chiang MY.Antisense oligonucleotides inhibit intercellular adhesion molecule 1 expression by two different mechanisms. J Biol Chem, 1991,266:18162～18171.
[4] Stanley T. Therapeutic applications of oligonucleotides . Annu Rev Pharmacol Toxicol ,1992,32:329～376.
, http://www.100md.com
[5] Helene C. The anti-gene strategy: control of gene expression by triplex-forming-oligonucleotides. Anti-cancer Drug Des,1991,6:569～584.
[6] Hunter AJ, Leslie RA, Golger IS, Lawrence M.Probing the function of novel genes in the nervous system: is antisense the answer? TINS, 1995,18(8):329～330.
[7] Wahlestedt C. Antisense oligonucleotide strategies in neuropharmacology.TIPS, 1994,15:42～46.
[8] Cook PD. Medicinal chemistry of antisense oligonucleotides future opportunities .Anti-cancer Drug Des,1991,6:585-607.
, 百拇医药
[9] Grimm R, Tischmeyer W. Complex patterns of immediate early gene induction in rat brain following brightness discrimination training and pseudotraining.Behav Brain Res,1997,84:109～116.
[10] Anokhin K and Rose S. Learning-induced increase of immediate early gene messenger RNA in chick forebrain .Eur J Neurosci ,1991,3:162～ 167.
[11] Anokhin KV, Milersnic R,Shamakina IY,and Rose SPR.Effects of early experience on c-fos gene expresssion in the chick forebrain. Brain Res,1991,544:101～107.
, 百拇医药
[12] Freeman FM and Rose SPR. MK-801 blockade of Fos and Jun expression following passive avoidance training in the chick. Eur J Neurosci, 1995,7:563～569.
[13] Heurteaux C,Messier C,Destrade C et al.Memory processing and apamin induce immediate early gene expression in mouse brain. Brain Res Mol Brain Res,1993,18(1～2):17～22.
[14] Swank MW, Schafe GE, Bernstein IL. c-Fos induction in response to taste stimuli previously paired with amphetamine or LiCl during taste aversion learning. Brain Res.1995,673:251～261.
, http://www.100md.com
[15] Tischmeyer W,Grimm R,Schicknick H;et al. Sequence-specific impairment of learning by c-jun antisense oligonucleotides. Neuroreport,1994 1,5(12): 1501～1504.
[16] Xiong Ying, Cai WenQin, Li XiCheng. Active avoidance conditioning is impaired by c-jun antisense oligodeoxynucleotides. XIVth international symposium on morphological sciences,1997,4.
[17] 陈秀芳译.记忆形成的分子机制.生命的化学,1996,16(2):28～31.
[18] Schmidt R. Cell-adhesion molecules in memory formation.Behav Brain Res,1995;66(1～2):65～72.
, 百拇医药
[19] Schmidt-R; Brysch-W; Rother-S, et al Inhibition of memory consolidation after active avoidance conditioning by antisense intervention with ependymin gene expression. J-Neurochem,1995 Oct, 65(4): 1465～71.
[20] Castro-Alamancos MA,Torres-Aleman I.Learning of the conditioned eye -blink response is impaired by an antisense insulin-like growth factor I oligonucleotide. Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:10203～ 10207.
[21] Skutella T; ProbstJC; Jirikowski GF, et al. Ventral tegmental area (VTA)injections of tyrosine hydroxylase phosphorothioate antisense oligonucleotide suppress operant behavior in rats. Neurosci-Lett, 1994 ,167(1～2): 55～58.
, 百拇医药
[22] Skutella T; Montkowski A; Stohr T, et al. Corticotropin-releasing hormone (CRH) antisense oligodeoxynucleotide treatment attenuates social defeat-induced anxiety in rats. Cell-Mol-Neurobiol,1994;14 (5):579～588.
[23] Matthies H, Schroder H, Wagner M, et al. NMDA/R1-antisense olionucleotide influences the early stage of long-term potentiation in the CA1-region of rat hippocampus. Neurosci Lett, 1995,202(1～2):113～6.
(收稿日期：1998—09—25信), 百拇医药
单位：熊鹰 蔡文琴 李希成 隋建峰(40038 四川省重庆第三军医大学)
关键词：
中国行为医学科学990144 反义核酸是指与体内某RNA或DNA序列具有互补顺序，并能通过碱基配对与互补链杂交，从而影响其转录或翻译过程的RNA或DNA片段。反义RNA和DNA的特异性源自反义序列和靶序列之间的碱基配对。反义核酸的长度可长可短，长的反义核酸一般都借助表达载体导入细胞，通过在细胞中进行转录而实现功能。反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides ，ODN)是短序列的单链DNA，在体外通过化学合成，与细胞内特异的靶序列互补。ODN比通过表达载体导入的方式应用广泛，而且由于它可以作为反义药物应用于临床，因此，ODN 的研究已引起了广泛的重视[1，2]。
, http://www.100md.com
一、反义ODN的作用机理及设计策略
反义ODN主要通过以下途径发挥作用：(1)抑制翻译[3、4]. 反义ODN通过与目标mRNA 发生碱基特异性互补结合，形成杂交双链体，阻止核糖体与重要起始因子结合，使其不能启动翻译；一般以针对翻译起始区的ODN效果最佳，在此区域内可直接抑制翻译起始复合物与 mRNA起始位点结合。(2)抑制转录后加工. 真核生物mRNA的核内加工包括5'端加帽结构、 内部甲基化、3'端加polyA及剪接等 ，最后转运到胞质成为成熟的mRNA，反义ODN 可影响其中的任一环节。(3)抑制DNA复制和转录. 反义ODN通过在DNA结合蛋白的识别位点处与DNA双螺旋结合形成三螺旋，阻止基因的转录和复制，又称为反基因ODN。理论上， 反基因策略具有明显优点，因为DNA序列一般是单拷贝，较之mRNA的多拷贝，只需少量的ODN与DNA 靶序列结合，即可达到较强的抑制效果。但这种策略有一定的局限性，在三聚体中其靶序列不易寻找，而且，ODN进入核内需要通过更多的屏障，并且可能造成非特异性杂交，甚至基因突变[5]。
, 百拇医药
反义ODN的设计策略主要考虑以下几方面[1、2、6、7、8]: (1)特异性 反义ODN 与靶核酸之间的特异性一方面与其长度和顺序有关，另一方面与活细胞中基因组和mRNA的复杂性有关。此外，针对某些序列的ODN本身也可能发生内部碱基互补形成发夹样结构，设计时应予考虑。(2)ODN长度 从杂交链的稳定性来看，ODN越长越好，但过长时，不易通过细胞膜，而且与非靶序列结合机率增加，会引起非特异抑制作用。一般认为ODN的长度以15～25个碱基较为合适。(3)化学修饰 未修饰的ODN易被核酸酶降解，而且不易被细胞摄取。化学修饰包括主链修饰和末端修饰，其中主链修饰包括对磷酸、糖环和碱基的修饰及寡核苷酸构型的改变。末端修饰主要是对末端疏水基团的修饰，从而有助于寡核苷酸进入靶细胞。S-ODN 均有较强的抗核酸酶的能力，能在较低的浓度下诱导RNase H的活性，合成和纯化容易，水溶性较高， 因而应用最广泛。(4)亲和性 ODN对靶序列的亲和力来自相互杂交作用。结合的自由能来自两个主要方面：形成双螺旋的氢键和碱基堆积。由于GC之间的亲和力比AU之间的亲和力大，因此，增加针对GC的靶序列的碱基在ODN的比例，可增加其杂交亲和性，而适当减少ODN的长度。(5)合理对照 ODN实验需要严格的对照才能明确其是否具有特异抑制效应及是否存在副作用。以往的实验常用正义链(sense)作对照，现在一般采用无义( missense) 或反向(reverse)作对照。
, http://www.100md.com
二、反义ODN在学习记忆研究中的应用
现代分子生物学技术使研究者发现越来越多的基因在中枢神经系统表达。然而，我们对于这些基因的功能了解很少或者根本不了解。反义寡核苷酸技术能够有效的探讨这些基因的作用。Rickman同时使用了转基因Knockout和反义knockdown技术研究trkb配基在视网膜神经元发育中的作用，反义knockdown技术避免了trkb转基因操作的一些缺点，尤其是转基因小鼠出生后极低的存活率。Robertson认为反义途径比转基因技术有很多优越性，如应用范围广、具有可逆性和解剖特异性、没有复杂的发育问题以及花费较低等[2]。
学习记忆的研究需要弄清特异脑区的分子机制和由学习产生的行为修饰的因果关系，采用传统的神经电生理和生化的方法，搞清这一关系较为困难。现在通过转基因小鼠和反义核酸两个途径使我们能够研究特异的基因在学习记忆过程中的作用。本文综述反义ODN 在学习记忆研究中的应用。
, 百拇医药
1. 研究快反应基因在记忆中的作用
快反应基因(immediately early genes，IEGs) 具有把短时程作用的细胞外信号和细胞功能的长时程改变耦联起来的作用。长时记忆的形成依赖脑内RNA和蛋白质的合成， 而这些与记忆相关的蛋白是由IEGs启动细胞内特异的目的基因(迟反应基因)表达的产物，有假说认为，细胞外信号激活胞浆第二信使(Ca2+，cAMP，IP3等)，后者再激活IEGs的表达，进而启动目的基因的表达而形成长期记忆[9、10]。
快反应基因fos和jun家族的表达产物是转录调节蛋白。它们通过形成二聚体复合物调节靶基因的表达。在哺乳动物中枢神经系统，c-fos，c-jun以及其它IEGs的表达可被各种刺激包括长时程增强(LTP)、长时程抑制(LTD)以及行为训练等诱导[9]。在分辨训练以后大鼠边缘系统的c-fos表达增多；Y迷宫训练后，大脑皮层c-jun mRNA表达明显增多；Anokhin等的实验表明小鸡c-fos和c-jun的表达在辨别学习和被动回避学习以后增多；Heurteaux则证实小鼠海马c-jun mRNA 在食物压杆操作学习后表达增强[10～14]。理论上可用Fos、Jun蛋白抗体来阻断其作用来研究Fos、Jun的生理功能，但Fos，Jun抗体不易进入细胞，特异性也不高，而IEGs反义ODN较易进入细胞且具有高选择性，对于c-fos、c-jun等确切功能的研究是一种理想的手段。
, 百拇医药
Tischmeyer(1994)[15]研究了反义c-jun和jun-B ODN对大鼠明暗分辨学习的影响。反义c-jun S-ODN的序列：TGCAGTCATAGAAC，反义jun-B：TTTCGTGCACATCC。 反义 c-jun 对照:TGCACTGATACAAC。双侧海马埋管，2mM/μl的S-ODN间隔8h在两侧海马注射，在最后一次注射后2h，首先观察大鼠的开场行为(open field)，然后进行分辨训练。大鼠在24h、48h、72h进行重复训练。结果，反义c-jun S-ODN海马内注射显著损害大鼠明暗分辨学习的完成， 而反义jun B S-ODN无明显影响。Northern杂交分析表明，训练后jun-B mRNA 在海马和大脑皮层的表达增加2～3倍，而c-jun mRNA的表达只在大脑皮层增加。35S标记的硫代ODN(S-ODN)在海马锥体细胞的大部分以及齿状回颗粒细胞有分布。靠近注射位点的胼胝体纤维和皮质区也有强烈标记。在FITC标记的S-ODN注射后26h，在海马锥体细胞以及注射位点周围仍然可观察到强烈的信号。海马内注射反义c-jun S-ODN的行为效果是由于降低了c-jun的稳定表达，而不是抑制其诱导，因为海马c-jun mRNA水平在明暗分辨学习以后没有增加。抑制c-jun表达主要影响分辨学习的习得，学习的损害似乎并不是由于反义c-jun注射后机体的简单神经反射造成的，因为在分辨学习前的开场行为测试中，实验组和对照组没有差异。反义jun-B 对分辨学习没有影响，说明两个问题:残留的jun-B的表达足够应付学习记忆的需要；jun-B的表达不是分辨学习习得和巩固必需的。本文作者观察到反义c-jun S-ODN对早期发育大鼠学习记忆行为以及LTP的损害更显著[16]。
, http://www.100md.com
小鸡进行一次性被动回避反应训练后，特定脑区发生一系列的生化反应过程，突触受到各种信使和调制物的修饰，这种修饰与记忆的早期驻留或长期贮存的形成有关。要产生长期记忆，突触瞬间态就必需转化为膜构象的长期性变化，因而必须要有基因的活动。根据这个观点，Rose发现被动回避训练会使c-fos、c-jun表达增强，如果在训练前用注射c-fos 的反义ODN探针的方法封闭fos的表达，则动物就健忘。这一基因活化可能是由膜信号传导，尤其是钙通道打开和磷酸化反应引起磷酸肌醇循环的激活所发动的[17]。
2.研究某些肽类物质、蛋白质以及受体在记忆中的作用
Schmidt采用反义ODN技术研究了ependymin在金鱼脑内记忆巩固 中的作用。在学习过程以后，中枢神经系统获得的信息可以作为记忆踪迹永久保存，记忆巩固的这一阶段对转录和翻译的生化抑制剂的干扰很敏感。Ependymin 是金鱼脑内与记忆巩固有关的特异的中枢神经系统糖蛋白，在主动回避反应训练以后， ependymin mRNA 在脑膜成纤维细胞快速诱导。将18个碱基的反义ependymin S- ODN 在主动回避反应训练前注射到脑脊液中， 主要抑制新的ependymin分子的合成，而不干扰已经存在的ependymin。注射S-ODN 的动物可以学会回避反应，然而，不能保持这一记忆。S-ODN不干扰overtrained大鼠主动回避反应的完成和再现。分析FITC结合的ODN探针，在成纤维细胞显示强烈的网状FITC-S-ODN荧光， 成纤维细胞是已知的ependymin唯一的合成位点。结果显示在体选择性抑制ependymin基因的表达能够特异性阻止记忆的形成。作者认为只有新合成的ependymin分子与记忆巩固过程有关， 其原因可能是由于它们还没有经历不可逆的分子改变[18、19]。
, http://www.100md.com
小脑在运动学习记忆中起关键作用，以前的报道发现，下橄榄核的胰岛素样生长因子I(insulin-like growth factor I，IGF-I)调制谷氨酸诱导的小脑Purkinje细胞的GABA释放，在此基础上，Castro-Alamancos采用反义ODN技术研究IGF-I 是否是运动学习的调制因子。Purkinje 细胞的突触可塑性被认为是运动学习的关键。 反义IGF-I ODN(5'-ACTGCTGATTTCCCCAT-3')的设计是针对大鼠IGF-I外显子1的转录起始位点。反义IGF-I ODN(50μg/5μl)下橄榄核注射完全抑制大鼠瞬目条件反射。这一阻断是可逆的，在小脑IGF-I 返回到正常水平时条件反射恢复。但反义IGF-I对瞬目条件反射的保持没有影响[20]。
Skutella设计了针对大鼠酪氨酸羟化酶(TH) mRNA起始编码区的反义ODN，TH是调控儿茶酚胺合成代谢通路限制酶的转录信使。将反义TH ODN注射到腹侧被盖区(VTA)，36 小时后检测，操作行为显著减少，TH在VTA的免疫活性也减少。此效应在注射后5天完全消失。这一结果表明通过在边缘系统注射反义TH ODN可特异性的抑制TH的表达，这样为在体研究行为、动机等提供了一个新工具[21]。应用这一技术，Skutella进一步研究了反义CRH ODN 对应急诱导的焦虑行为的影响。CRH是应急反应的主要调节因子，反义CRH S-ODN侧脑室注射( 30μg/ 3μl)3次，间隔12h，在最后一次注射6小时后，大鼠进行应急反应，随后在水平十字迷宫中测试，大鼠在臂上停留的时间更长，表明焦虑相关行为显著减少，而且反义注射抑制应急诱导的CRH mRNA 和CRH在下丘脑的显著升高，以及血浆ACTH水平的升高[22]。
, http://www.100md.com
Matthies采用反义寡核苷酸策略研究NMDA/R1受体亚单位在LTP中的作用。反义NMDA/R1(10nmol)注入7周龄大鼠脑室，连续3天，然后进行脑片LTP的记录。结果反义注射组PS 增幅明显小于对照组，这种现象在串刺激后持续50min。而fEPSP的增加只持续了15分钟。反义注射组[3H]谷氨酸与海马细胞膜上的 NMDA 受体的特异性结合减少 63% 。 这些结果表明反义NMDA/R1脑室应用后能够达到目标区，并且抑制NMDA/R1 mRNA 的翻译。 它们进一步支持了NMDA/R1在LTP中有重要作用的观点[23]。
以反义ODN技术研究基因在学习记忆中的调控作用，目前的报道尚不多， 这一技术本身还有一些缺陷，如稳定性问题，某些修饰成分带来的细胞毒性问题等，目前尚没有达到常规的、程序化的应用阶段，但是与转基因技术相比，由于其应用范围广、没有复杂的发育问题以及花费较低等，因此,这一方法有广阔的发展前景[2]。
, http://www.100md.com
参考文献
[1] 黄胜和.反义核酸与基因治疗.见彭朝晖等主编.基因治疗与临床. 北京：中国科学技术出版社出版,1994：143～160.
[2] leslie R, Jones D. Antisense gene knockdown in the nervous system revisited:optimism for the future.TINS,1997,20(8):321～322.
[3] Chiang MY.Antisense oligonucleotides inhibit intercellular adhesion molecule 1 expression by two different mechanisms. J Biol Chem, 1991,266:18162～18171.
[4] Stanley T. Therapeutic applications of oligonucleotides . Annu Rev Pharmacol Toxicol ,1992,32:329～376.
, http://www.100md.com
[5] Helene C. The anti-gene strategy: control of gene expression by triplex-forming-oligonucleotides. Anti-cancer Drug Des,1991,6:569～584.
[6] Hunter AJ, Leslie RA, Golger IS, Lawrence M.Probing the function of novel genes in the nervous system: is antisense the answer? TINS, 1995,18(8):329～330.
[7] Wahlestedt C. Antisense oligonucleotide strategies in neuropharmacology.TIPS, 1994,15:42～46.
[8] Cook PD. Medicinal chemistry of antisense oligonucleotides future opportunities .Anti-cancer Drug Des,1991,6:585-607.
, 百拇医药
[9] Grimm R, Tischmeyer W. Complex patterns of immediate early gene induction in rat brain following brightness discrimination training and pseudotraining.Behav Brain Res,1997,84:109～116.
[10] Anokhin K and Rose S. Learning-induced increase of immediate early gene messenger RNA in chick forebrain .Eur J Neurosci ,1991,3:162～ 167.
[11] Anokhin KV, Milersnic R,Shamakina IY,and Rose SPR.Effects of early experience on c-fos gene expresssion in the chick forebrain. Brain Res,1991,544:101～107.
, 百拇医药
[12] Freeman FM and Rose SPR. MK-801 blockade of Fos and Jun expression following passive avoidance training in the chick. Eur J Neurosci, 1995,7:563～569.
[13] Heurteaux C,Messier C,Destrade C et al.Memory processing and apamin induce immediate early gene expression in mouse brain. Brain Res Mol Brain Res,1993,18(1～2):17～22.
[14] Swank MW, Schafe GE, Bernstein IL. c-Fos induction in response to taste stimuli previously paired with amphetamine or LiCl during taste aversion learning. Brain Res.1995,673:251～261.
, http://www.100md.com
[15] Tischmeyer W,Grimm R,Schicknick H;et al. Sequence-specific impairment of learning by c-jun antisense oligonucleotides. Neuroreport,1994 1,5(12): 1501～1504.
[16] Xiong Ying, Cai WenQin, Li XiCheng. Active avoidance conditioning is impaired by c-jun antisense oligodeoxynucleotides. XIVth international symposium on morphological sciences,1997,4.
[17] 陈秀芳译.记忆形成的分子机制.生命的化学,1996,16(2):28～31.
[18] Schmidt R. Cell-adhesion molecules in memory formation.Behav Brain Res,1995;66(1～2):65～72.
, 百拇医药
[19] Schmidt-R; Brysch-W; Rother-S, et al Inhibition of memory consolidation after active avoidance conditioning by antisense intervention with ependymin gene expression. J-Neurochem,1995 Oct, 65(4): 1465～71.
[20] Castro-Alamancos MA,Torres-Aleman I.Learning of the conditioned eye -blink response is impaired by an antisense insulin-like growth factor I oligonucleotide. Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:10203～ 10207.
[21] Skutella T; ProbstJC; Jirikowski GF, et al. Ventral tegmental area (VTA)injections of tyrosine hydroxylase phosphorothioate antisense oligonucleotide suppress operant behavior in rats. Neurosci-Lett, 1994 ,167(1～2): 55～58.
, 百拇医药
[22] Skutella T; Montkowski A; Stohr T, et al. Corticotropin-releasing hormone (CRH) antisense oligodeoxynucleotide treatment attenuates social defeat-induced anxiety in rats. Cell-Mol-Neurobiol,1994;14 (5):579～588.
[23] Matthies H, Schroder H, Wagner M, et al. NMDA/R1-antisense olionucleotide influences the early stage of long-term potentiation in the CA1-region of rat hippocampus. Neurosci Lett, 1995,202(1～2):113～6.
(收稿日期：1998—09—25信), 百拇医药