毫米波辐射对兔眼房水一氧化氮及某些细胞因子的影响
作者：王小娟 王多宁 王晓莉 李缉熙 李琦 马吉献
单位：710032 西安，第四军医大学西京医院神经内科(王小娟)，理疗科(王晓莉),眼科(马吉献)；第四军医大学基础部化学教研室(王多宁)，基础部免疫教研室(李琦)；西安电子科技大学电磁工程系(李缉熙)
关键词：辐射损伤；实验性；毫米波*；眼损伤；一氧化氮；兔
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【摘 要】 目的 观察毫米波辐射后兔眼房水一氧化氮(NO)及白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子(TNF-α)含量的变化，探讨毫米波对眼的损伤机制，为制定毫米波辐射的卫生标准提供实验依据。方法 新西兰兔按受辐照后不同取材时间及辐射剂量分组，采用35 GHz等幅连续波，辐射兔眼1 h，用硝酸酶还原法测定房水NO,用ELISA法测定IL-6、IL-8、TNF-α。结果 10 mW/cm2毫米波辐射结束后6 h，房水NO含量升高(P<0.01)，此效应可持续24 h以上；35 mW/cm2及10 mW/cm2毫米波辐射结束后24 h内，未发现房水IL-6、IL-8、TNF-α含量的升高。结论 低功率35 GHz毫米波辐射可引起房水中NO含量的增高，提示NO为毫米波致眼损伤的重要因素之一。
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【中图号】 R454.1;R779.12
Influence of nitric oxide and cytokine in rabbit aqueous humor
by millimeter wave radiation
WANG Xiaojuan,WANG Duoning,WANG Xiaoli,et al.Department of Neurology,Xijing Hospital,Fourth
Military Medical University,Xi′an 710032
【Abstract】 Objective To observe the changes of NO and cytokine content in rabbit aqueous humor followed millimeter wave radiation and to offer the experimental basis for determination of damaging threshold of millimeter wave radiation.Methods New Zealand rabbits were divided into groups according to different sampling time and radiated dosage.The eyes of the rabbits were radiated with 35GHz millimeter wave for one hour.Nitrate determination in aqueous humor was conducted by enzymatic assay with nitrate reductase.IL-6,IL-8 and TNF-α in aqueous humor were quantitatively measured by ELISA.Results Early in 6 hours following exposure with the power density of 10 mW/cm2,NO content was increased and later persisted for over 24 hours (P<0.01).IL-6,IL-8 and TNF-α were not changed in 24 hours following radiation with 35 mW/cm2 and 10 mW/cm2.Conclusion NO content in aqueous humor is increased by low power millimeter wave radiation,indicating NO is one of the important factors in the cornea injury by millimeter wave.
, 百拇医药
【Key words】 Radiation injuries,experimental Millimeter wave* Eye injuries Nitric oxide Rabbits
微波辐射可导致眼的损伤，早在1948年Daily 等就发表了微波辐射使狗眼产生白内障的实验研究报告，毫米波处于微波的极高频段，其生物学作用具有一定的特殊性，如对生物组织的穿透深度小，而生物体对毫米波的比吸收率很高，因而导致毫米波主要在辐射表面被吸收。以往的研究发现[1]，角膜对毫米波辐射极敏感，35 GHz毫米波辐射1 h，功率密度为5 mW/cm2时，可引起角膜上皮轻度损伤，功率密度为15 mW/cm2，除造成角膜上皮脱落或坏死外，甚至引起角膜内皮的肿胀、脱落。本实验通过观察毫米波辐射后兔眼房水一氧化氮(NO)含量及白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子(TNF)变化情况，为探讨毫米波损伤作用机制并为确定毫米波段的损伤阈值提供实验依据。
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1 材料与方法
1.1 毫米波辐射对兔眼房水NO含量的影响
健康成年雄性新西兰兔42只，由第四军医大学实验动物中心提供，体质量(2.0±0.5) kg，实验前经裂隙灯活体显微镜检查双眼正常者,随机分为辐射组及假辐射组，每组按不同取材时间分为照后6、12、24 h组三小组，每组7只动物。
毫米波辐射器由西安电子科技大学研制，频率35 GHz，等幅波连续式输出，环境功率密度可调，本实验辐射剂量为10 mW/cm2，波源的辐射喇叭为圆形，直径1 cm。以右眼为辐射眼，左眼为自身对照，辐射时将兔头固定，辐射喇叭口平面距角膜1 cm，辐射1 h。
抽取房水：于辐射后不同时间，以体积分数为0.25%的磷酸的卡因表面麻醉角膜后，分组抽取房水200 μl，-70 ℃保存待测。
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房水NO含量测定采用硝酸酶还原法[2]，药盒由德国Boehringer Mannheim公司提供，样品测定前经10 000 r/min 4 ℃离心5 min，上清液按1∶3比例用蒸馏水稀释后进行测定。根据标准曲线测定结果及吸光光度值计算样品中NO-2浓度(μmol/L)，即NO浓度。
1.2 毫米波辐射对兔眼房水IL-6、IL-8及TNF-α的影响
健康成年雄性新西兰兔42只，由第四军医大学实验动物中心提供，体质量(2.0±0.5) kg。辐射前经裂隙灯活体显微镜检查双眼正常者，按辐射剂量随机分为35、10 mW/cm2两组，每组按辐射后不同取材时间分为照后6、12、24 h三小组，每组7只动物。辐射条件及取材方法同前。
采用ELISA法测定房水中的IL-6、IL-8、TNF-α含量。IL-6药盒由深圳晶美公司提供，IL-8及TNF-α药盒由本校免疫教研室提供。根据标准曲线及样本的A值，计算IL-6、IL-8及TNF-α的含量(μmol/L)。
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2 结果
2.1 毫米波辐射后兔眼房水NO含量(表1)
表1 35 GHz毫米波辐射后兔房水NO
含量的变化(μmol/L,
±s)
组别
照后6 h
照后12 h
照后24 h
(n=7)
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(n=7)
(n=7)
辐射组
R
35.41±11.21* *
29.34±12.27* *
33.75±6.17* *
(10mW/cm2)
L
8.77±3.54
9.68±4.10
, 百拇医药
7.87±6.13
假照射组
R
9.06±3.90
8.67±5.73
8.92±5.45
L
6.98±5.85
7.63±5.41
7.33±4.68
注:** P<0.01(R:右眼，即辐射眼；L：左眼，为自身对照眼)
经配对资料t检验，发现毫米波照射后6、12、24 h后，辐射组房水中NO含量明显高于对照组及假辐射组(P<0.01)。说明本实验条件下，毫米波辐射可引起房水中NO含量的升高，该效应可持续24 h以上。
, 百拇医药
2.2 毫米波辐射后兔眼房水IL-6、IL-8及TNF-α的含量
测定结果表明，两种不同剂量的毫米波在照射后6、12及24 h，均未发现房水中IL-6、IL-8及TNF-α含量的变化，测定值均低于标准曲线最小值。
3 讨论
NO是脊椎动物体内广泛分布的一种分子，它可以自由地通过细胞膜，是承担细胞内及细胞间快速信息交流的介质，参与血液循环、神经传递、物质能量代谢、细胞的发生、分化、生长与凋亡以及肿瘤细胞杀伤等众多生理过程，其合成及释放增多或减少与机体的多种机能状态密切相关。研究发现，NO的生物学作用与其浓度有关，低浓度的NO以信息传递为主，而高浓度的NO则主要表现为细胞毒性作用，可引起血管通透性增高,并直接与含氧自由基发生化学反应而呈现更高的活性及损害作用[3,4]。
形态学研究发现[1]， 35 GHz毫米波辐射兔眼，可引起角膜损伤，在辐射结束后24 h尤为明显，至48 h即有减轻的趋势，且损伤程度与辐射剂量呈正相关，当功率密度为15 mW/cm2时，电镜观察可见角膜上皮细胞脱落及内皮细胞肿胀变形。本实验发现，功率密度为10 mW/cm2时，兔眼房水NO含量在照后6 h之内即可明显升高，该效应可持续24 h以上，提示NO为毫米波致眼损伤的因素之一；由于NO具有高度的弥散能力，在此基础上，可通过神经体液途径介导远位生物学效应。NO含量的升高表明毫米波在非热剂量下，可引起某些与NO代谢有关的生物学效应，值得进一步深入研究。该指标可作为制定毫米波辐射的安全卫生标准的参考依据之一。
, 百拇医药
IL-6、IL-8及TNF是重要的免疫活性物质，对细胞间相互作用、细胞的生长和分化有调节作用。IL-6主要是由单核-吞噬细胞产生的一种糖蛋白，为机体细胞因子网络中的重要成员，除参与机体的炎症反应和抗感染防御外，还与自身免疫调节和某些肿瘤的发生和转归有关。IL-8是一种多肽，对中性粒细胞、T淋巴细胞、嗜碱性粒细胞具有趋化作用，并可激活中性粒细胞，在感染、创伤、缺血再灌注损伤发生机制中有重要作用。TNF-α是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，主要由激活的单核-巨噬细胞所分泌，参与机体的免疫调节与炎症反应。以上三种细胞因子在角膜上皮的免疫调节中起重要作用[5]。
SR.Planck等[6]报道，在大鼠角膜切割伤和碱烧伤后，有TNF-α、IL-6基因的表达，作者认为，细胞因子的表达与角膜损伤的性质有关。本实验发现，35 GHz的毫米波在两种不同剂量的条件下辐射兔眼后24 h内，未发现房水中IL-6、IL-8、TNF -α的变化，提示本实验条件对角膜上皮及房水的免疫调节网络可能不产生影响，同时毫米波辐射所造成的角膜损伤与上述细胞因子无关。
, 百拇医药
对一氧化氮的研究提示[7]，NO能介导脂多糖、TNF等细胞因子的病理作用，能调节白细胞与内皮细胞的粘附，抑制T细胞增殖，提高NK细胞活性。本实验观察到毫米波辐射后，房水内NO含量增高，而未检测到上述细胞因子，说明在毫米波对眼的损伤与NO介导的其他途径的生物学效应有关。
参考文献
1 王小娟,于纯智,马吉献,等.不同剂量毫米波对兔眼角膜的损伤作用及阈值探讨.中华理疗杂志,1996,19:89-91.
2 Bories PN,Christian B.Nitrite determination in biological fluids by an enzymatic one-step assay with nitrate reductase.Clin Chem,1995,41:904-905.
, http://www.100md.com 3 潘家祜，伍嘉宁.NO:中枢神经系统中一个新的重要信使物质.生理科学进展,1993,24:293-297.
4 Roth S.Role of nitric oxide in retinal cell death.Clin Neurosci,1997,4:216-223.
5 金伯泉主编.细胞和分子免疫学.西安:世界图书出版公司,1995.110-133.
6 Planck SR,Rich LF,Ansel JC,et al.Trauma and alkali burns induce distinct patterns of cytokine gene expression in the rat cornea.Ocul Immunol Inflamm,1997,5:95-100.
7 莫简.关于自由基在生物体系中作用的几点看法.第四军医大学学报,1997,8:199-200.
收稿 1998-07-24
修回 1998-11-30, 百拇医药
单位：710032 西安，第四军医大学西京医院神经内科(王小娟)，理疗科(王晓莉),眼科(马吉献)；第四军医大学基础部化学教研室(王多宁)，基础部免疫教研室(李琦)；西安电子科技大学电磁工程系(李缉熙)
关键词：辐射损伤；实验性；毫米波*；眼损伤；一氧化氮；兔
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【摘 要】 目的 观察毫米波辐射后兔眼房水一氧化氮(NO)及白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子(TNF-α)含量的变化，探讨毫米波对眼的损伤机制，为制定毫米波辐射的卫生标准提供实验依据。方法 新西兰兔按受辐照后不同取材时间及辐射剂量分组，采用35 GHz等幅连续波，辐射兔眼1 h，用硝酸酶还原法测定房水NO,用ELISA法测定IL-6、IL-8、TNF-α。结果 10 mW/cm2毫米波辐射结束后6 h，房水NO含量升高(P<0.01)，此效应可持续24 h以上；35 mW/cm2及10 mW/cm2毫米波辐射结束后24 h内，未发现房水IL-6、IL-8、TNF-α含量的升高。结论 低功率35 GHz毫米波辐射可引起房水中NO含量的增高，提示NO为毫米波致眼损伤的重要因素之一。
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【中图号】 R454.1;R779.12
Influence of nitric oxide and cytokine in rabbit aqueous humor
by millimeter wave radiation
WANG Xiaojuan,WANG Duoning,WANG Xiaoli,et al.Department of Neurology,Xijing Hospital,Fourth
Military Medical University,Xi′an 710032
【Abstract】 Objective To observe the changes of NO and cytokine content in rabbit aqueous humor followed millimeter wave radiation and to offer the experimental basis for determination of damaging threshold of millimeter wave radiation.Methods New Zealand rabbits were divided into groups according to different sampling time and radiated dosage.The eyes of the rabbits were radiated with 35GHz millimeter wave for one hour.Nitrate determination in aqueous humor was conducted by enzymatic assay with nitrate reductase.IL-6,IL-8 and TNF-α in aqueous humor were quantitatively measured by ELISA.Results Early in 6 hours following exposure with the power density of 10 mW/cm2,NO content was increased and later persisted for over 24 hours (P<0.01).IL-6,IL-8 and TNF-α were not changed in 24 hours following radiation with 35 mW/cm2 and 10 mW/cm2.Conclusion NO content in aqueous humor is increased by low power millimeter wave radiation,indicating NO is one of the important factors in the cornea injury by millimeter wave.
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【Key words】 Radiation injuries,experimental Millimeter wave* Eye injuries Nitric oxide Rabbits
微波辐射可导致眼的损伤，早在1948年Daily 等就发表了微波辐射使狗眼产生白内障的实验研究报告，毫米波处于微波的极高频段，其生物学作用具有一定的特殊性，如对生物组织的穿透深度小，而生物体对毫米波的比吸收率很高，因而导致毫米波主要在辐射表面被吸收。以往的研究发现[1]，角膜对毫米波辐射极敏感，35 GHz毫米波辐射1 h，功率密度为5 mW/cm2时，可引起角膜上皮轻度损伤，功率密度为15 mW/cm2，除造成角膜上皮脱落或坏死外，甚至引起角膜内皮的肿胀、脱落。本实验通过观察毫米波辐射后兔眼房水一氧化氮(NO)含量及白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子(TNF)变化情况，为探讨毫米波损伤作用机制并为确定毫米波段的损伤阈值提供实验依据。
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1 材料与方法
1.1 毫米波辐射对兔眼房水NO含量的影响
健康成年雄性新西兰兔42只，由第四军医大学实验动物中心提供，体质量(2.0±0.5) kg，实验前经裂隙灯活体显微镜检查双眼正常者,随机分为辐射组及假辐射组，每组按不同取材时间分为照后6、12、24 h组三小组，每组7只动物。
毫米波辐射器由西安电子科技大学研制，频率35 GHz，等幅波连续式输出，环境功率密度可调，本实验辐射剂量为10 mW/cm2，波源的辐射喇叭为圆形，直径1 cm。以右眼为辐射眼，左眼为自身对照，辐射时将兔头固定，辐射喇叭口平面距角膜1 cm，辐射1 h。
抽取房水：于辐射后不同时间，以体积分数为0.25%的磷酸的卡因表面麻醉角膜后，分组抽取房水200 μl，-70 ℃保存待测。
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房水NO含量测定采用硝酸酶还原法[2]，药盒由德国Boehringer Mannheim公司提供，样品测定前经10 000 r/min 4 ℃离心5 min，上清液按1∶3比例用蒸馏水稀释后进行测定。根据标准曲线测定结果及吸光光度值计算样品中NO-2浓度(μmol/L)，即NO浓度。
1.2 毫米波辐射对兔眼房水IL-6、IL-8及TNF-α的影响
健康成年雄性新西兰兔42只，由第四军医大学实验动物中心提供，体质量(2.0±0.5) kg。辐射前经裂隙灯活体显微镜检查双眼正常者，按辐射剂量随机分为35、10 mW/cm2两组，每组按辐射后不同取材时间分为照后6、12、24 h三小组，每组7只动物。辐射条件及取材方法同前。
采用ELISA法测定房水中的IL-6、IL-8、TNF-α含量。IL-6药盒由深圳晶美公司提供，IL-8及TNF-α药盒由本校免疫教研室提供。根据标准曲线及样本的A值，计算IL-6、IL-8及TNF-α的含量(μmol/L)。
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2 结果
2.1 毫米波辐射后兔眼房水NO含量(表1)
表1 35 GHz毫米波辐射后兔房水NO
含量的变化(μmol/L,
±s)组别
照后6 h
照后12 h
照后24 h
(n=7)
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(n=7)
(n=7)
辐射组
R
35.41±11.21* *
29.34±12.27* *
33.75±6.17* *
(10mW/cm2)
L
8.77±3.54
9.68±4.10
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假照射组
R
9.06±3.90
8.67±5.73
8.92±5.45
L
6.98±5.85
7.63±5.41
7.33±4.68
注:** P<0.01(R:右眼，即辐射眼；L：左眼，为自身对照眼)
经配对资料t检验，发现毫米波照射后6、12、24 h后，辐射组房水中NO含量明显高于对照组及假辐射组(P<0.01)。说明本实验条件下，毫米波辐射可引起房水中NO含量的升高，该效应可持续24 h以上。
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2.2 毫米波辐射后兔眼房水IL-6、IL-8及TNF-α的含量
测定结果表明，两种不同剂量的毫米波在照射后6、12及24 h，均未发现房水中IL-6、IL-8及TNF-α含量的变化，测定值均低于标准曲线最小值。
3 讨论
NO是脊椎动物体内广泛分布的一种分子，它可以自由地通过细胞膜，是承担细胞内及细胞间快速信息交流的介质，参与血液循环、神经传递、物质能量代谢、细胞的发生、分化、生长与凋亡以及肿瘤细胞杀伤等众多生理过程，其合成及释放增多或减少与机体的多种机能状态密切相关。研究发现，NO的生物学作用与其浓度有关，低浓度的NO以信息传递为主，而高浓度的NO则主要表现为细胞毒性作用，可引起血管通透性增高,并直接与含氧自由基发生化学反应而呈现更高的活性及损害作用[3,4]。
形态学研究发现[1]， 35 GHz毫米波辐射兔眼，可引起角膜损伤，在辐射结束后24 h尤为明显，至48 h即有减轻的趋势，且损伤程度与辐射剂量呈正相关，当功率密度为15 mW/cm2时，电镜观察可见角膜上皮细胞脱落及内皮细胞肿胀变形。本实验发现，功率密度为10 mW/cm2时，兔眼房水NO含量在照后6 h之内即可明显升高，该效应可持续24 h以上，提示NO为毫米波致眼损伤的因素之一；由于NO具有高度的弥散能力，在此基础上，可通过神经体液途径介导远位生物学效应。NO含量的升高表明毫米波在非热剂量下，可引起某些与NO代谢有关的生物学效应，值得进一步深入研究。该指标可作为制定毫米波辐射的安全卫生标准的参考依据之一。
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IL-6、IL-8及TNF是重要的免疫活性物质，对细胞间相互作用、细胞的生长和分化有调节作用。IL-6主要是由单核-吞噬细胞产生的一种糖蛋白，为机体细胞因子网络中的重要成员，除参与机体的炎症反应和抗感染防御外，还与自身免疫调节和某些肿瘤的发生和转归有关。IL-8是一种多肽，对中性粒细胞、T淋巴细胞、嗜碱性粒细胞具有趋化作用，并可激活中性粒细胞，在感染、创伤、缺血再灌注损伤发生机制中有重要作用。TNF-α是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，主要由激活的单核-巨噬细胞所分泌，参与机体的免疫调节与炎症反应。以上三种细胞因子在角膜上皮的免疫调节中起重要作用[5]。
SR.Planck等[6]报道，在大鼠角膜切割伤和碱烧伤后，有TNF-α、IL-6基因的表达，作者认为，细胞因子的表达与角膜损伤的性质有关。本实验发现，35 GHz的毫米波在两种不同剂量的条件下辐射兔眼后24 h内，未发现房水中IL-6、IL-8、TNF -α的变化，提示本实验条件对角膜上皮及房水的免疫调节网络可能不产生影响，同时毫米波辐射所造成的角膜损伤与上述细胞因子无关。
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对一氧化氮的研究提示[7]，NO能介导脂多糖、TNF等细胞因子的病理作用，能调节白细胞与内皮细胞的粘附，抑制T细胞增殖，提高NK细胞活性。本实验观察到毫米波辐射后，房水内NO含量增高，而未检测到上述细胞因子，说明在毫米波对眼的损伤与NO介导的其他途径的生物学效应有关。
参考文献
1 王小娟,于纯智,马吉献,等.不同剂量毫米波对兔眼角膜的损伤作用及阈值探讨.中华理疗杂志,1996,19:89-91.
2 Bories PN,Christian B.Nitrite determination in biological fluids by an enzymatic one-step assay with nitrate reductase.Clin Chem,1995,41:904-905.
, http://www.100md.com 3 潘家祜，伍嘉宁.NO:中枢神经系统中一个新的重要信使物质.生理科学进展,1993,24:293-297.
4 Roth S.Role of nitric oxide in retinal cell death.Clin Neurosci,1997,4:216-223.
5 金伯泉主编.细胞和分子免疫学.西安:世界图书出版公司,1995.110-133.
6 Planck SR,Rich LF,Ansel JC,et al.Trauma and alkali burns induce distinct patterns of cytokine gene expression in the rat cornea.Ocul Immunol Inflamm,1997,5:95-100.
7 莫简.关于自由基在生物体系中作用的几点看法.第四军医大学学报,1997,8:199-200.
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