天麻素对谷氨酸致培养皮层神经细胞损伤的保护作用
作者：薛柳华 唐一鹏 洪庆涛 孙承琳
单位：北京中医药大学 北京100029
关键词：天麻素；谷氨酸；培养神经细胞；大鼠
北京中医药大学学报990113 摘 要：取新生大鼠大脑皮层进行体外神经细胞培养，用谷氨酸建立离体的神经元损害模型，观察天麻素对兴奋性氨基酸神经毒性的影响。结果表明：200μmol/L谷氨酸作用10min能造成培养神经元的大量死亡，培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量明显增高；在培养液中加入天麻素或氯胺酮可明显降低神经细胞死亡率，减少乳酸脱氢酶的漏出。提示天麻素可拮抗兴奋性氨基酸神经毒性。
Protective Effects of Gastrodine on Injured Cortical Neurons by Glutamic Acid
, http://www.100md.com
Xue Liuhua(薛柳华),Tang Yipeng(唐一鹏),Hong Qingtao(洪庆涛),et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT：Cerebral cortex of the newborn rat was used for neurons cu lture in vitro. An isolated pattern of injured neuro by glutamic acid was built up. Observe the effect of gastrodine on the neurotoxicity of excitatory amino ac id. The results show that: Glutamic acid can cause the expiration of cultured ne urons in large quantities and the amount of lactic dehydrogenase (LDH) in the nu trient solution can be markedly increased. By adding gastrodine or ketamine into th e nutrient solution, mortality rate of the neurons can be significantly decrease d and the transudation of LDH also diminished, which suggests gastrodine ca n antagonize the neurotoxicity of excitatory amino acid.
, 百拇医药
KEY WORDS：Gastrodine; Glutamic Acid; Cultured neuron; Rat
谷氨酸是脑内兴奋性突触的主要神经递质之一，已证实在脑损伤等病理情况下，谷氨酸参与了神经细胞的损害。本研究观察了天麻素对谷氨酸所致兴奋性神经毒性的影响，以期为临床用药提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物
新生当天Wistar大鼠，由北京医科大学动物中心提供。
1.2 大脑皮层神经元原代培养
根据文献[1]方法进行，在解剖镜下取新生24h内Wistar大鼠大脑皮层，用0.125%胰蛋白酶消化30min(37℃)。制备成1.0×109L-1密度的细胞悬液。按每皿中2mL的细胞悬液接种于已涂有胶原的35mm培养皿中。随后置于含94%空气、6%CO2的37℃培养箱内培养8d。培养液为DMEM。培养第3～5天加入10-5mol/L阿糖胞苷以抑制非神经细胞增殖。
, 百拇医药
1.3 谷氨酸对体外培养神经细胞兴奋毒性模型的建立
参考文献[2，3]方法，将体外培养8d的神经细胞培养液中加入200μmol/L谷氨酸钠作用10min，用解剖液(NaCl8g,KCl0.4g，Na2HPO4.7H2O0.18g,KH2PO40.03g,蔗糖3g，葡萄糖7.5g，Hepes2.34g，加蒸馏水至1000mL)漂洗1次。换无血清培养液继续培养24h；正常对照组加入20μL培养液，用解剖液漂洗1次，换无血清培养液继续培养24h；阳性对照药组用氯胺酮50μmol/L，天麻素设3个剂量组：52mg/L、26mg/L、13mg/L各组用药20min后加入谷氨酸钠200μmol/L，作用10min后用解剖液漂洗1次，换无血清培养液，并继续加药，培养24h。
1.4 培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的测定
, 百拇医药
取上述经处理继续培养24h后的无血清培养液，每皿0.3mL，3000r/min离心10min，按文献[4]方法测定LDH，结果按每皿中蛋白量进行计算，按Bradford法测定细胞蛋白量[5]。
1.5 细胞染色计数
上述经药物处理继续培养24h的细胞，用解剖液清洗1次，取0.9%NaCl配制的0.4%台盼蓝溶液200μL直接滴于盖玻片上，3min后镜检。每一盖片中心处随机计数500个细胞中着蓝染(为死亡细胞)及不着蓝染(为存活细胞)的细胞个数计算细胞死亡率。
1.6 药品
天麻素由北京中医药大学中药学院魏璐雪教授提供；谷氨酸钠为北京化工厂分析纯产品；氯胺酮为北京制药厂产品。
2 结果
, 百拇医药
2.1 天麻素对谷氨酸所致神经细胞LDH漏出的影响
200μmol/L谷氨酸钠作用于神经细胞10min，培养液中LDH浓度明显增加，经天麻素或氯胺酮作用的细胞LDH漏出量明显降低，差异非常显著(P<0.01)，见表1。
2.2 天麻素对谷氨酸所致神经细胞死亡率的影响
神经细胞暴露于200μmol/L谷氨酸10min，即可造成神经细胞的大量死亡，加用天麻素或氯胺酮后神经细胞死亡率明显下降，差异非常显著(P<0.01)。见表1。
表1 天麻素对谷氨酸所致神经细胞LDH漏出及细胞死亡率的影响(
±s) 组别
剂量
, 百拇医药
LDH/mu/mgpro
细胞死亡率/%
正常组
—
2.79±1.06***
7.4±0.9***
损伤组
200μmol/L
11.65±2.03
57.8±3.6
天麻素组
52mg/L
, 百拇医药
7.73±2.03*
36.4±2.9***
天麻素组
26mg/L
8.33±2.06*
40.4±4.2**
天麻素组
13mg/L
8.64±1.90*
46.0±5.1**
, 百拇医药
氯胺酮组
50μmol/L
5.69±1.11***
33.2±4.3***
注：与损伤组比较：*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.0013 讨论
谷氨酸(Glu)是脑内兴奋性突触的主要神经递质之一，在生理状态下，对脑维持其正常生理功能起重要作用。近年来，大量研究表明，在脑受到伤害，例如缺血、缺氧、癫痫、外伤等时，脑中Glu含量大量增加，对脑细胞的损害起到重要作用。脑缺血后病灶区Glu含量明显升高，并且随时相持续升高，再灌注后脑组织内Glu仍持续高值[6]。Glu与其特异性受体结合后启动Na+、Ca2+，促使Na+、Ca2+大量内流，导致急性细胞内水肿和继发性神经毒性[7]。本实验用200μmol/LGlu在体外培养神经细胞上作用10min即可造成半数以上细胞死亡，从而亦证实了Glu对神经细胞有直接毒性。氯胺酮或天麻素对此毒性皆表现出一定的保护作用。氯胺酮是NMDA受体的非竞争性拮抗剂，该药对神经细胞的保护作用亦说明了Glu激活NMDA受体，导致胞内钙超载是其作用的一个重要途径。天麻素对神经细胞的兴奋毒性亦具有一定的保护作用，细胞的损伤首先表现为细胞膜的损伤，膜的通透性增大，使正常生理情况下很少漏出的LDH大量漏出，通过染色计数死亡细胞数增多；而天麻素作用后细胞内LDH的漏出减少，细胞死亡率降低，说明天麻素能够稳定神经细胞膜，阻止细胞膜通透性的改变，具有拮抗Glu的兴奋毒性作用。另有研究报道[8]，合成的天麻甙元同型物是γ-氨基丁酸受体(GABA-R)的高亲和性配体。天麻素对神经细胞的保护作用是作为一种兴奋性氨基酸拮抗剂或作为γ-氨基丁酸受体的高亲和性配体/激动剂而起作用。
, 百拇医药
作者简介：薛柳华，女，25岁，在读硕士生
参考文献
[1]洪庆涛，唐一鹏.新生大鼠大脑皮层神经细胞的原代培养.神经解剖学杂志，199 4，10(3)：259～262
[2]毋敬郁，熊 文，杨世杰，等.自由基介导兴奋性氨基酸对培养神经细胞毒性的研究.中 风与神经疾病杂志，1996，13(1)：2
[3]杨 忠，蔡文琴.牛磺酸减轻兴奋性氨基酸对培养新生大鼠小脑皮层神经元的损害.第三 军医大学学报，1996，18(1)：22
[4]蒋传葵.工具酶的活力测定.上海：上海科学技术出版社，1982.11
[5]Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram qu antitation of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Bioche m,1976,72：248
, 百拇医药
[6]Benveniste H,Drejer J,Schoushoe A,et al.Elevation of the extracellular conce ntrations of glutamates and aspartate in rat hippocampus during transint cerebra l ischmia monitored by intracerebral microdialysis.J Neurochem,1984,43：1369～13 74
[7]李鳞仙.钙离子、兴奋性氨基酸与缺血性脑损伤.生理科学进展，1992，23：131～136
[8]钟裕国，庞其杰，张恒渝，等.天麻甙元同系物与同型物的合成及其中枢镇静抗惊活性. 四川医学院学报，1984，15(1)：17～22
收稿日期：1998-01-20, 百拇医药
单位：北京中医药大学 北京100029
关键词：天麻素；谷氨酸；培养神经细胞；大鼠
北京中医药大学学报990113 摘 要：取新生大鼠大脑皮层进行体外神经细胞培养，用谷氨酸建立离体的神经元损害模型，观察天麻素对兴奋性氨基酸神经毒性的影响。结果表明：200μmol/L谷氨酸作用10min能造成培养神经元的大量死亡，培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量明显增高；在培养液中加入天麻素或氯胺酮可明显降低神经细胞死亡率，减少乳酸脱氢酶的漏出。提示天麻素可拮抗兴奋性氨基酸神经毒性。
Protective Effects of Gastrodine on Injured Cortical Neurons by Glutamic Acid
, http://www.100md.com
Xue Liuhua(薛柳华),Tang Yipeng(唐一鹏),Hong Qingtao(洪庆涛),et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT：Cerebral cortex of the newborn rat was used for neurons cu lture in vitro. An isolated pattern of injured neuro by glutamic acid was built up. Observe the effect of gastrodine on the neurotoxicity of excitatory amino ac id. The results show that: Glutamic acid can cause the expiration of cultured ne urons in large quantities and the amount of lactic dehydrogenase (LDH) in the nu trient solution can be markedly increased. By adding gastrodine or ketamine into th e nutrient solution, mortality rate of the neurons can be significantly decrease d and the transudation of LDH also diminished, which suggests gastrodine ca n antagonize the neurotoxicity of excitatory amino acid.
, 百拇医药
KEY WORDS：Gastrodine; Glutamic Acid; Cultured neuron; Rat
谷氨酸是脑内兴奋性突触的主要神经递质之一，已证实在脑损伤等病理情况下，谷氨酸参与了神经细胞的损害。本研究观察了天麻素对谷氨酸所致兴奋性神经毒性的影响，以期为临床用药提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物
新生当天Wistar大鼠，由北京医科大学动物中心提供。
1.2 大脑皮层神经元原代培养
根据文献[1]方法进行，在解剖镜下取新生24h内Wistar大鼠大脑皮层，用0.125%胰蛋白酶消化30min(37℃)。制备成1.0×109L-1密度的细胞悬液。按每皿中2mL的细胞悬液接种于已涂有胶原的35mm培养皿中。随后置于含94%空气、6%CO2的37℃培养箱内培养8d。培养液为DMEM。培养第3～5天加入10-5mol/L阿糖胞苷以抑制非神经细胞增殖。
, 百拇医药
1.3 谷氨酸对体外培养神经细胞兴奋毒性模型的建立
参考文献[2，3]方法，将体外培养8d的神经细胞培养液中加入200μmol/L谷氨酸钠作用10min，用解剖液(NaCl8g,KCl0.4g，Na2HPO4.7H2O0.18g,KH2PO40.03g,蔗糖3g，葡萄糖7.5g，Hepes2.34g，加蒸馏水至1000mL)漂洗1次。换无血清培养液继续培养24h；正常对照组加入20μL培养液，用解剖液漂洗1次，换无血清培养液继续培养24h；阳性对照药组用氯胺酮50μmol/L，天麻素设3个剂量组：52mg/L、26mg/L、13mg/L各组用药20min后加入谷氨酸钠200μmol/L，作用10min后用解剖液漂洗1次，换无血清培养液，并继续加药，培养24h。
1.4 培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的测定
, 百拇医药
取上述经处理继续培养24h后的无血清培养液，每皿0.3mL，3000r/min离心10min，按文献[4]方法测定LDH，结果按每皿中蛋白量进行计算，按Bradford法测定细胞蛋白量[5]。
1.5 细胞染色计数
上述经药物处理继续培养24h的细胞，用解剖液清洗1次，取0.9%NaCl配制的0.4%台盼蓝溶液200μL直接滴于盖玻片上，3min后镜检。每一盖片中心处随机计数500个细胞中着蓝染(为死亡细胞)及不着蓝染(为存活细胞)的细胞个数计算细胞死亡率。
1.6 药品
天麻素由北京中医药大学中药学院魏璐雪教授提供；谷氨酸钠为北京化工厂分析纯产品；氯胺酮为北京制药厂产品。
2 结果
, 百拇医药
2.1 天麻素对谷氨酸所致神经细胞LDH漏出的影响
200μmol/L谷氨酸钠作用于神经细胞10min，培养液中LDH浓度明显增加，经天麻素或氯胺酮作用的细胞LDH漏出量明显降低，差异非常显著(P<0.01)，见表1。
2.2 天麻素对谷氨酸所致神经细胞死亡率的影响
神经细胞暴露于200μmol/L谷氨酸10min，即可造成神经细胞的大量死亡，加用天麻素或氯胺酮后神经细胞死亡率明显下降，差异非常显著(P<0.01)。见表1。
表1 天麻素对谷氨酸所致神经细胞LDH漏出及细胞死亡率的影响(
±s) 组别剂量
, 百拇医药
LDH/mu/mgpro
细胞死亡率/%
正常组
—
2.79±1.06***
7.4±0.9***
损伤组
200μmol/L
11.65±2.03
57.8±3.6
天麻素组
52mg/L
, 百拇医药
7.73±2.03*
36.4±2.9***
天麻素组
26mg/L
8.33±2.06*
40.4±4.2**
天麻素组
13mg/L
8.64±1.90*
46.0±5.1**
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氯胺酮组
50μmol/L
5.69±1.11***
33.2±4.3***
注：与损伤组比较：*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.0013 讨论
谷氨酸(Glu)是脑内兴奋性突触的主要神经递质之一，在生理状态下，对脑维持其正常生理功能起重要作用。近年来，大量研究表明，在脑受到伤害，例如缺血、缺氧、癫痫、外伤等时，脑中Glu含量大量增加，对脑细胞的损害起到重要作用。脑缺血后病灶区Glu含量明显升高，并且随时相持续升高，再灌注后脑组织内Glu仍持续高值[6]。Glu与其特异性受体结合后启动Na+、Ca2+，促使Na+、Ca2+大量内流，导致急性细胞内水肿和继发性神经毒性[7]。本实验用200μmol/LGlu在体外培养神经细胞上作用10min即可造成半数以上细胞死亡，从而亦证实了Glu对神经细胞有直接毒性。氯胺酮或天麻素对此毒性皆表现出一定的保护作用。氯胺酮是NMDA受体的非竞争性拮抗剂，该药对神经细胞的保护作用亦说明了Glu激活NMDA受体，导致胞内钙超载是其作用的一个重要途径。天麻素对神经细胞的兴奋毒性亦具有一定的保护作用，细胞的损伤首先表现为细胞膜的损伤，膜的通透性增大，使正常生理情况下很少漏出的LDH大量漏出，通过染色计数死亡细胞数增多；而天麻素作用后细胞内LDH的漏出减少，细胞死亡率降低，说明天麻素能够稳定神经细胞膜，阻止细胞膜通透性的改变，具有拮抗Glu的兴奋毒性作用。另有研究报道[8]，合成的天麻甙元同型物是γ-氨基丁酸受体(GABA-R)的高亲和性配体。天麻素对神经细胞的保护作用是作为一种兴奋性氨基酸拮抗剂或作为γ-氨基丁酸受体的高亲和性配体/激动剂而起作用。
, 百拇医药
作者简介：薛柳华，女，25岁，在读硕士生
参考文献
[1]洪庆涛，唐一鹏.新生大鼠大脑皮层神经细胞的原代培养.神经解剖学杂志，199 4，10(3)：259～262
[2]毋敬郁，熊 文，杨世杰，等.自由基介导兴奋性氨基酸对培养神经细胞毒性的研究.中 风与神经疾病杂志，1996，13(1)：2
[3]杨 忠，蔡文琴.牛磺酸减轻兴奋性氨基酸对培养新生大鼠小脑皮层神经元的损害.第三 军医大学学报，1996，18(1)：22
[4]蒋传葵.工具酶的活力测定.上海：上海科学技术出版社，1982.11
[5]Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram qu antitation of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Bioche m,1976,72：248
, 百拇医药
[6]Benveniste H,Drejer J,Schoushoe A,et al.Elevation of the extracellular conce ntrations of glutamates and aspartate in rat hippocampus during transint cerebra l ischmia monitored by intracerebral microdialysis.J Neurochem,1984,43：1369～13 74
[7]李鳞仙.钙离子、兴奋性氨基酸与缺血性脑损伤.生理科学进展，1992，23：131～136
[8]钟裕国，庞其杰，张恒渝，等.天麻甙元同系物与同型物的合成及其中枢镇静抗惊活性. 四川医学院学报，1984，15(1)：17～22
收稿日期：1998-01-20, 百拇医药