调理脾胃复方对PTZ点燃癫痫模型阿片肽含量的影响
作者：钱会南 王洪图 齐治家 张秋菊 梁 怡
单位：北京中医药大学 北京100029
关键词：调理脾胃复方；PTZ点燃大鼠；亮脑啡肽；β-内啡肽；强啡肽A1-13
北京中医药大学学报990111 摘 要：为了研究调理脾胃复方的抗痫作用，本实验采用放免法观察大鼠PTZ点燃以及服用调理脾胃复方治疗后，脑内阿片肽含量的变化。结果表明，PTZ点燃大鼠海马内亮脑啡肽(L-ENK)、β-内啡肽(β-EP)明显升高，强啡肽A1-13(DYNA1-13)显著降低；大脑皮层内L-ENK明显升高，DYNA1-13、β-EP无明显变化。用调理脾胃复方治疗后，上述脑区L-ENK、β-EP显著减少，DYNA1-13明显增加。提示癫痫发作及调理脾胃复方抗痫作用可能与脑内L-ENK、β-EP、DYNA1-13的变化有关。
, 百拇医药
The Effects of Spleen and Stomach Regulating Prescriptions
on Opioid Peptide Concentration in PTZ Kindled Rats
Qian Huinan(钱会南),Wang Hongtu(王洪图),Qi Zhijia(齐治家),et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT: Radioimmunologic method was used to evaluate the influence of th e complex prescription of regulating the spleen and stomach on the pentylenetetr azole (PTZ) kindled rats and changes of the opioid peptides concentration in th e brain. In the hippocampus of the PTZ kindled rats, the leu cine-enkephal in (L-ENK) and β-endorphin (β-EP) were increased and dynorphin A1-13 (DYN A1-13) decreased. After treated with the complex prescription, the L-ENK a ndβ-EP were markedly decreased, while DYNA1-13 increased. It indic ates that the epileptic attack and the antiepileptic effect of the complex prescription may relate with the changes of the L-ENK、β-Ep and DYNA1-13 in the brain.
, 百拇医药
KEY WORDS: Spleen and Stomach Regulating Presoription; Epil epsy; Leucine-enkephalin; β-endorphin; Dynorphin; PTZ Kindled Rat
癫痫是神经系统的常见病、多发病，然而其确切的发病机理至今尚未完全阐明，目前对该病也缺少理想的根治手段。有关研究资料表明，神经肽作为中枢神经系统中的重要递质或调质，在癫痫发病中起着重要作用，其中的阿片肽等肽类物质扮演着十分重要的角色，但尚未见到PTZ点燃大鼠模型脑内亮脑啡肽(L-ENK)、β-内啡肽(β-EP)、强啡肽A1-13(DYNA1-13)含量变化的有关报道。为探讨癫痫发病机制和中药调理脾胃复方的治疗作用，我们观察了PTZ点燃大鼠癫痫模型部分脑区L-ENK、β-EP、DYNA1-13含量的变化。
1 材料与方法
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1.1 材料
戊四唑(PTZ)Sigma公司产品，用前以生理盐水新鲜配制成溶液。调理脾胃复方(草果、知母、厚朴、半夏、茯苓、黄芩、甘草等)，购于北京中医药大学门诊部，按乙醇提取法提取浓缩，生药含量为2g/mL，置冰箱待用。抗痫灵(Antipilepsirine,AES)，购于北京医科大学药厂，用0.5%羟丙甲基纤维素，0.1%吐温80和双蒸水配制成混悬口服液。
L-ENK、β-EP、DYNA1-13药盒均由上海第二军医大学提供。
1.2 方法
1.2.1 PTZ点燃模型的制备
SD雄性大鼠，实验开始时体重(150±10)g，购自首都医科大学实验动物中心。造模组用PTZ亚惊厥剂量，32mg/kg，每日1次，腹腔注射，持续28d，停药1周，再用相同剂量的PTZ测试，凡显示连续5次2级以上惊厥的大鼠为达到点燃标准。大鼠惊厥发作评分标准：0级，没有行为上的发作；Ⅰ级，节律性点头或头部颤搐；Ⅱ级，阵挛性咀嚼；Ⅲ级，头部颤搐加前肢阵挛性抽搐；Ⅳ级，袋鼠姿势(上身直立)；Ⅴ级，跌倒；Ⅵ级，强直性惊厥。正常对照组给予相同剂量的生理盐水。
, 百拇医药
正常对照组大鼠10只，胃饲双蒸水2mL/(kg.d)；PTZ点燃大鼠分为3组，其中模型对照组10只，胃饲双蒸水2mL/(kg.d)；调理脾胃治疗组(中药组)，胃饲调理脾胃复方5g/(kg.d)；AES治疗组(西药组)，胃饲抗痫灵0.5g/(kg.d)；共维持28d。
1.2.2 阿片肽测定方法
实验第63天，模型组PTZ点燃测试1h后，全部动物断头活杀，迅速取出全脑，沸生理盐水煮10min，将脑正中矢状切开，分离出海马、皮层，称重后加1mL1mol/LHCl制成匀浆，室温放置100min。取上清，置-70℃冰箱保存。测定采用放免法。严格按照说明书进行操作。
2 结果
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2.1 大鼠海马内L-ENK、β-EP、DYNA1-13测定
结果见表1。
表1 大鼠海马L-ENK、β-EP、DYNA1-13含量变化(ng/g；
±s；n=10) 组别
L-ENK
β-EP
DYNA1-13
模型组
18.53±4.87
23.47±5.03
, 百拇医药
2.68±0.68
正常组
9.45±2.19**
10.82±2.57**
6.10±0.95**
西药组
9.38±2.08**
14.05±2.18*△
5.02±1.29**
中药组
, 百拇医药
10.20±2.12**
12.37±1.80**
4.89±1.32**
注：与模型组比较，*<0.05 **P<0.01；与正常组比较△P<0.05
2.2 大鼠大脑皮层内L-ENK、β-EP、DYNA1-13测定
结果见表2。
表2 大鼠大脑皮层L-ENK、β-EP、DYNA1-13含量变化(ng/g;±s；n=10) 组别
, 百拇医药
L-ENK
β-EP
DYNA1-13
模型组
19.11±2.84
3.13±0.35
3.44±0.66
正常组
8.46±1.90**
2.75±0.34
3.50±0.68
西药组
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9.40±1.72**
2.94±0.29
3.59±0.74
中药组
10.09±1.94**
3.09±0.26
3.65±0.57
注：与模型组比较**P<0.013 讨论
给予动物脑内注射L-ENK、β-EP可引起动物癫痫样活动，并产生持续的癫痫样放电，还可导致动物点燃发作效应[1，2]。脑室内注射小剂量β-EP能产生“边缘性癫痫发作”，β-EP还能降低PTZ诱导惊厥发作阈值，增强PTZ导致癫痫发作的敏感性[3]。因而有人提出ENK、β-EP与癫痫发作有密切关系，属内源性致痫物质。而DYN则与上述二者的作用不同。DYN注入动物脑内可提高PTZ及六氟双乙基乙醚等致惊剂的惊厥阈值，对癫痫点燃性发作产生强烈的抑制作用，并升高海马的后放电阈值，认为DYN可能调节点燃发作的敏感性，为内源性抗痫物质[4，5]。王氏等报道杏仁核点燃、青霉素致痫等癫痫模型海马内ENK含量显著升高，而DYN则明显下降[6，7]。沈氏等亦观察到，声源性惊厥易感大鼠海马、大脑皮层内ENK、β-EP含量明显增加[8]。本实验结果与上述报道基本相符。
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目前中医对癫痫的治疗多侧重于熄风定痫、豁痰开窃、镇惊安神、育阴潜阳、活血化瘀等方面[9]，较少重视脾胃的作用。王洪图教授根据《内经》强调脾胃为五脏枢轴的理论，结合多年临床经验，从调理脾胃入手，以草果知母汤为基础方化裁组成调理脾胃方，治疗癫痫等神志异常疾患，取得了较好疗效。通过调理脾胃，使气机调畅，不仅有利于化除痰浊，使之不再扰乱神志，又可使精微物质化生正常，营血充足，而保持神志活动正常；更为重要的是，由于脾胃气机调畅，通过其“转枢”作用，使其他脏腑气机都能得到调整，从而达到治疗癫痫等多种神志异常疾患的目的。本室以往的研究表明[10，11]，该复方能有效对抗听源性癫痫发作，PTZ阈值大发作及点燃和极量电休克惊厥发作，未见明显毒副反应。并对生长抑素mRNA的表达有影响。本实验观察到PTZ点燃大鼠海马内L-ENK、β-EP含量明显增加，DYNA1-13含量显著减少；大脑皮层内L-ENK含量亦明显升高，调理脾胃复方治疗后，上述变化被拮抗或翻转。我们认为，癫痫发作及调理脾胃复方抗痫机制可能与脑内L-ENK、β-EP、DYNA1-13的变化有关。
, 百拇医药
作者简介：钱会南，女，42岁，医学博士
参考文献
[1]Cain DP and Corcoran ME.Epleptiform effects of met-enkephalin, β-endorphin and morphine:kindling of generalized seizures and potentiation of epileptiform effe cts by handling. Brain Res，1985，338：327～336
[2]Cain DP.Intracerebral beta-endorphin,met-enkpt and morphin:kindling of seizur es and handling inuced potentiation of epileptiform effects.Life Sci,1984,34：25 3～260
, 百拇医药
[3]Shlomo Yehuda.Gircadiam effects of β-endorphin moletanin,DSIP,and amphala mine on pentylenetetrazol induced seizures.Peptides,1993,14：203～205
[4]Przewlok R.Shearman GT and Herz A. Mixed opioid/nor-opiod effects of dynorph in and dynorphin related peptides affer their intrathecal injection in rats.Neur opeptides,1983,3：233～239
[5]Doules W.Bornhaus DG.Lews C,et al. Intranigral dynorphin(1-13)suppresses kind led seizures by a naloxone-insensitive maechanism.Brain Res,1987,405：358～361
, 百拇医药
[6]Mcginty JE,Kanamastu T,Obie T,et al.Amygdaloid Kindling increases enkephalin -like immunoreactivity in rat hippocampus.Neurosci Leff，1981，71：31～36
[7]王布尔，程介士.大鼠海马内强啡肽1-8和亮啡肽在癫痫发作及电针的变化.中国药理学报 ，1994，2：155～157
[8]沈 上，田津斌，韩济生.P77 PMC大鼠和Wistar大鼠中枢某些神经肽含量比较.北 京医科大学学报，1996，28(1)：16
[9]钱会南.癫痫的中药治疗现状及展望.中国中医药信息杂志，1996，(10)专刊：371～372
[10]贺 娟，赵明瑞，梁 怡，等.草果知母汤抗癫痫的药效学实验研究.北京中医药大学学 报，1997，20(2)：37～39
[11]赵明瑞，贺 娟，梁 怡，等.草果知母汤对点燃癫痫模型生长抑素mRNA的影响，1998 ，21(4)：34～35
收稿日期：1998-06-25, 百拇医药
单位：北京中医药大学 北京100029
关键词：调理脾胃复方；PTZ点燃大鼠；亮脑啡肽；β-内啡肽；强啡肽A1-13
北京中医药大学学报990111 摘 要：为了研究调理脾胃复方的抗痫作用，本实验采用放免法观察大鼠PTZ点燃以及服用调理脾胃复方治疗后，脑内阿片肽含量的变化。结果表明，PTZ点燃大鼠海马内亮脑啡肽(L-ENK)、β-内啡肽(β-EP)明显升高，强啡肽A1-13(DYNA1-13)显著降低；大脑皮层内L-ENK明显升高，DYNA1-13、β-EP无明显变化。用调理脾胃复方治疗后，上述脑区L-ENK、β-EP显著减少，DYNA1-13明显增加。提示癫痫发作及调理脾胃复方抗痫作用可能与脑内L-ENK、β-EP、DYNA1-13的变化有关。
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The Effects of Spleen and Stomach Regulating Prescriptions
on Opioid Peptide Concentration in PTZ Kindled Rats
Qian Huinan(钱会南),Wang Hongtu(王洪图),Qi Zhijia(齐治家),et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT: Radioimmunologic method was used to evaluate the influence of th e complex prescription of regulating the spleen and stomach on the pentylenetetr azole (PTZ) kindled rats and changes of the opioid peptides concentration in th e brain. In the hippocampus of the PTZ kindled rats, the leu cine-enkephal in (L-ENK) and β-endorphin (β-EP) were increased and dynorphin A1-13 (DYN A1-13) decreased. After treated with the complex prescription, the L-ENK a ndβ-EP were markedly decreased, while DYNA1-13 increased. It indic ates that the epileptic attack and the antiepileptic effect of the complex prescription may relate with the changes of the L-ENK、β-Ep and DYNA1-13 in the brain.
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KEY WORDS: Spleen and Stomach Regulating Presoription; Epil epsy; Leucine-enkephalin; β-endorphin; Dynorphin; PTZ Kindled Rat
癫痫是神经系统的常见病、多发病，然而其确切的发病机理至今尚未完全阐明，目前对该病也缺少理想的根治手段。有关研究资料表明，神经肽作为中枢神经系统中的重要递质或调质，在癫痫发病中起着重要作用，其中的阿片肽等肽类物质扮演着十分重要的角色，但尚未见到PTZ点燃大鼠模型脑内亮脑啡肽(L-ENK)、β-内啡肽(β-EP)、强啡肽A1-13(DYNA1-13)含量变化的有关报道。为探讨癫痫发病机制和中药调理脾胃复方的治疗作用，我们观察了PTZ点燃大鼠癫痫模型部分脑区L-ENK、β-EP、DYNA1-13含量的变化。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料
戊四唑(PTZ)Sigma公司产品，用前以生理盐水新鲜配制成溶液。调理脾胃复方(草果、知母、厚朴、半夏、茯苓、黄芩、甘草等)，购于北京中医药大学门诊部，按乙醇提取法提取浓缩，生药含量为2g/mL，置冰箱待用。抗痫灵(Antipilepsirine,AES)，购于北京医科大学药厂，用0.5%羟丙甲基纤维素，0.1%吐温80和双蒸水配制成混悬口服液。
L-ENK、β-EP、DYNA1-13药盒均由上海第二军医大学提供。
1.2 方法
1.2.1 PTZ点燃模型的制备
SD雄性大鼠，实验开始时体重(150±10)g，购自首都医科大学实验动物中心。造模组用PTZ亚惊厥剂量，32mg/kg，每日1次，腹腔注射，持续28d，停药1周，再用相同剂量的PTZ测试，凡显示连续5次2级以上惊厥的大鼠为达到点燃标准。大鼠惊厥发作评分标准：0级，没有行为上的发作；Ⅰ级，节律性点头或头部颤搐；Ⅱ级，阵挛性咀嚼；Ⅲ级，头部颤搐加前肢阵挛性抽搐；Ⅳ级，袋鼠姿势(上身直立)；Ⅴ级，跌倒；Ⅵ级，强直性惊厥。正常对照组给予相同剂量的生理盐水。
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正常对照组大鼠10只，胃饲双蒸水2mL/(kg.d)；PTZ点燃大鼠分为3组，其中模型对照组10只，胃饲双蒸水2mL/(kg.d)；调理脾胃治疗组(中药组)，胃饲调理脾胃复方5g/(kg.d)；AES治疗组(西药组)，胃饲抗痫灵0.5g/(kg.d)；共维持28d。
1.2.2 阿片肽测定方法
实验第63天，模型组PTZ点燃测试1h后，全部动物断头活杀，迅速取出全脑，沸生理盐水煮10min，将脑正中矢状切开，分离出海马、皮层，称重后加1mL1mol/LHCl制成匀浆，室温放置100min。取上清，置-70℃冰箱保存。测定采用放免法。严格按照说明书进行操作。
2 结果
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2.1 大鼠海马内L-ENK、β-EP、DYNA1-13测定
结果见表1。
表1 大鼠海马L-ENK、β-EP、DYNA1-13含量变化(ng/g；
±s；n=10) 组别L-ENK
β-EP
DYNA1-13
模型组
18.53±4.87
23.47±5.03
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2.68±0.68
正常组
9.45±2.19**
10.82±2.57**
6.10±0.95**
西药组
9.38±2.08**
14.05±2.18*△
5.02±1.29**
中药组
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10.20±2.12**
12.37±1.80**
4.89±1.32**
注：与模型组比较，*<0.05 **P<0.01；与正常组比较△P<0.05
2.2 大鼠大脑皮层内L-ENK、β-EP、DYNA1-13测定
结果见表2。
表2 大鼠大脑皮层L-ENK、β-EP、DYNA1-13含量变化(ng/g;
±s；n=10) 组别, 百拇医药
L-ENK
β-EP
DYNA1-13
模型组
19.11±2.84
3.13±0.35
3.44±0.66
正常组
8.46±1.90**
2.75±0.34
3.50±0.68
西药组
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9.40±1.72**
2.94±0.29
3.59±0.74
中药组
10.09±1.94**
3.09±0.26
3.65±0.57
注：与模型组比较**P<0.013 讨论
给予动物脑内注射L-ENK、β-EP可引起动物癫痫样活动，并产生持续的癫痫样放电，还可导致动物点燃发作效应[1，2]。脑室内注射小剂量β-EP能产生“边缘性癫痫发作”，β-EP还能降低PTZ诱导惊厥发作阈值，增强PTZ导致癫痫发作的敏感性[3]。因而有人提出ENK、β-EP与癫痫发作有密切关系，属内源性致痫物质。而DYN则与上述二者的作用不同。DYN注入动物脑内可提高PTZ及六氟双乙基乙醚等致惊剂的惊厥阈值，对癫痫点燃性发作产生强烈的抑制作用，并升高海马的后放电阈值，认为DYN可能调节点燃发作的敏感性，为内源性抗痫物质[4，5]。王氏等报道杏仁核点燃、青霉素致痫等癫痫模型海马内ENK含量显著升高，而DYN则明显下降[6，7]。沈氏等亦观察到，声源性惊厥易感大鼠海马、大脑皮层内ENK、β-EP含量明显增加[8]。本实验结果与上述报道基本相符。
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目前中医对癫痫的治疗多侧重于熄风定痫、豁痰开窃、镇惊安神、育阴潜阳、活血化瘀等方面[9]，较少重视脾胃的作用。王洪图教授根据《内经》强调脾胃为五脏枢轴的理论，结合多年临床经验，从调理脾胃入手，以草果知母汤为基础方化裁组成调理脾胃方，治疗癫痫等神志异常疾患，取得了较好疗效。通过调理脾胃，使气机调畅，不仅有利于化除痰浊，使之不再扰乱神志，又可使精微物质化生正常，营血充足，而保持神志活动正常；更为重要的是，由于脾胃气机调畅，通过其“转枢”作用，使其他脏腑气机都能得到调整，从而达到治疗癫痫等多种神志异常疾患的目的。本室以往的研究表明[10，11]，该复方能有效对抗听源性癫痫发作，PTZ阈值大发作及点燃和极量电休克惊厥发作，未见明显毒副反应。并对生长抑素mRNA的表达有影响。本实验观察到PTZ点燃大鼠海马内L-ENK、β-EP含量明显增加，DYNA1-13含量显著减少；大脑皮层内L-ENK含量亦明显升高，调理脾胃复方治疗后，上述变化被拮抗或翻转。我们认为，癫痫发作及调理脾胃复方抗痫机制可能与脑内L-ENK、β-EP、DYNA1-13的变化有关。
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作者简介：钱会南，女，42岁，医学博士
参考文献
[1]Cain DP and Corcoran ME.Epleptiform effects of met-enkephalin, β-endorphin and morphine:kindling of generalized seizures and potentiation of epileptiform effe cts by handling. Brain Res，1985，338：327～336
[2]Cain DP.Intracerebral beta-endorphin,met-enkpt and morphin:kindling of seizur es and handling inuced potentiation of epileptiform effects.Life Sci,1984,34：25 3～260
, 百拇医药
[3]Shlomo Yehuda.Gircadiam effects of β-endorphin moletanin,DSIP,and amphala mine on pentylenetetrazol induced seizures.Peptides,1993,14：203～205
[4]Przewlok R.Shearman GT and Herz A. Mixed opioid/nor-opiod effects of dynorph in and dynorphin related peptides affer their intrathecal injection in rats.Neur opeptides,1983,3：233～239
[5]Doules W.Bornhaus DG.Lews C,et al. Intranigral dynorphin(1-13)suppresses kind led seizures by a naloxone-insensitive maechanism.Brain Res,1987,405：358～361
, 百拇医药
[6]Mcginty JE,Kanamastu T,Obie T,et al.Amygdaloid Kindling increases enkephalin -like immunoreactivity in rat hippocampus.Neurosci Leff，1981，71：31～36
[7]王布尔，程介士.大鼠海马内强啡肽1-8和亮啡肽在癫痫发作及电针的变化.中国药理学报 ，1994，2：155～157
[8]沈 上，田津斌，韩济生.P77 PMC大鼠和Wistar大鼠中枢某些神经肽含量比较.北 京医科大学学报，1996，28(1)：16
[9]钱会南.癫痫的中药治疗现状及展望.中国中医药信息杂志，1996，(10)专刊：371～372
[10]贺 娟，赵明瑞，梁 怡，等.草果知母汤抗癫痫的药效学实验研究.北京中医药大学学 报，1997，20(2)：37～39
[11]赵明瑞，贺 娟，梁 怡，等.草果知母汤对点燃癫痫模型生长抑素mRNA的影响，1998 ，21(4)：34～35
收稿日期：1998-06-25, 百拇医药