大肠癌bcl-2基因表达和重排的研究
作者：骆成玉 李世拥
单位：北京军区总医院(北京 100700)
关键词：大肠肿瘤；表达；重排；bcl-2基因
中国普外基础与临床杂志990102 摘要 应用ABC免疫组化及半巢式PCR法分别对64例大肠癌组织中bcl-2的蛋白表达及重排进行了检测。结果：bcl-2基因异常表达与重排在大肠癌早期即已出现，随着病程演变，发生率显著增加；bcl-2基因的重排在有淋巴结转移者亦明显多于无淋巴结转移者。两法联合应用相比较，以重排更能反映大肠癌分子特性。本实验结果提示：bcl-2基因参与大肠癌发生发展过程的调节，并在大肠癌细胞的增殖、进展及转移中起重要作用；研究大肠癌bcl-2基因情况可用来预测治疗效果和预后，亦为大肠癌治疗设计新的抗癌药物提供了新的靶分子。
A STUDY ON THE EXPRESSION AND REARRANGEMENT OF
, 百拇医药
BCL-2 GENE IN COLORECTAL CARCINOMA
Luo Chenyu, Li Shiyong.
Beijing Army General Hospital，Beijing 100700
Abstract The expression and rearrangement of bcl-2 gene in 64 cases with colorectal carcinoma were studied by immunohistochemical technique and semi-nest PCR respectively. The results showed the abnormal changes of the expression and rearrangement of bcl-2 gene had emerged in the early stage of colorectal carcinoma. The tumors with the expression of bcl-2 were associated with a higher incidence of metastasis to lymphatic node. The rearragement of bcl-2 was significantly higher in late-stage than that in early-stage. These suggest that bcl-2 gene involves in the regulation of the development of colorectal carcinoma. The state of the changes of bcl-2 gene in colorectal carcinoma may predict the therapeutic effect and prognosis of colorectal carcinoma.
, 百拇医药
Key words Colorectal neoplasm Expression Rearrangement Bcl-2 gene
原癌基因bcl-2在细胞凋亡的调控中起着很重要的作用，如果这一调控失常，则会导致包括肿瘤、自身免疫及AIDS等许多疾病的发生。bcl-2表达异常存在于乳腺癌、前列腺癌和肺癌等实体性肿瘤，并与这些肿瘤的生物学特性相关〔1〕。bcl-2/JH基因重排为bcl-2基因表达异常的直接原因。本研究应用免疫组化及半巢式PCR方法分别检测了大肠癌bcl-2的蛋白表达及重排情况，旨在从分子水平揭示大肠癌一方面本质，并研究其临床价值；同时也为半巢式PCR技术在其他疾病中的应用，在方法学上提供了基础。
1 材料与方法
1.1 标本来源
64例大肠癌组织取自我院住院手术治疗患者，均经病理证实。其中男40例，女24例，年龄26～74岁，平均58.41岁。手术切除后立即取小块组织行液氮速冻备检。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 免疫组化 所取肿瘤组织于-20℃～-30℃恒温冷冻切片机上作5μm厚的连续切片，-20℃保存。染色方法为ABC免疫组化法，染色步骤参照文献〔2〕方法进行。ABC试剂盒购自美国Vector公司，bcl-2单克隆抗体为Dako公司产品。实验同时设阳性对照和空白对照。其结果判定：由两人进行显微镜下独立阅片，每张切片观察5个高倍视野，阳性细胞见棕黄色颗粒状物质沉积，阳性细胞数≥10定为阳性，即为过度表达，<10为阴性。
1.2.2 半巢式PCR扩增 ①组织DNA提取，按常规酚-氯仿-异戊醇抽取基因组DNA〔3〕，TE溶解，测OD260和OD280值定量，4℃存放备用；②引物，根据bcl-2序列及t(14∶18)断裂点集中在bcl-2基因的2个热点部位〔4〕，设计两对半引物。主要断裂区(MBR)外引物C：5’-CAGCCTTGAAACATTGATGC-3’；主要断裂区内引物A：5’-TATGGTGGTTTGACCTTTAG-3’；次要断裂区(MCR)外引物D：5’-CGTGCTGGTACCACTCCTG-3’；次要断裂区内引物B：5’-GGACCTTCCTTGGTGTGTTG-3；免疫球蛋白重链基因引物JH：5’-ACCTGAGGAGACGGTGACC-3’。由于断裂点位置不同，所扩增的片断长度在200～700bp之间不等；③扩增，PCR循环在PE公司PCR仪进行，反应总体积25μl。第1轮引物用C、JH扩增MBR及D、JH扩增MCR形成的融合基因，94℃30秒、55℃35秒、72℃60秒，共35个周期。取2μl扩增产物进行第二轮扩增，引物为A、JH扩增MBR及B、JH扩增MCR形成的融合基因，条件同前。取反应产物10μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色，紫外光下观察照相记录。
, 百拇医药
1.3 统计学处理
结果采用多元回归分析。
2 结果
2.1 bcl-2基因表达及重排与大肠癌临床病理特征的关系
结果见表1及图1，2。从表1可见，bcl-2基因表达在患者性别、组织学分级及淋巴结转移之间无显著性差异(P>0.05)，但与Duke's分期明显相关(P<0.05)；该基因重排在患者性别、组织学分级间无显著性差异，但在Duke's分期和淋巴结转移间有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。
表1 bcl-2基因的表达及重排与大肠癌临床病理特征的关系 临床病理
n
表达
, 百拇医药
重排
阳性例数
百分率(%)
P
阳性例数
百分率(%)
P
性别
男
40
28
70.0
>0.05
, 百拇医药
32
80.0
>0.05
女
24
19
79.2
21
87.5
组织学分类
高分化
19
13
, 百拇医药
68.4
>0.05
14
73.7
>0.05
中分化
32
25
78.1
27
84.4
低分化
13
, http://www.100md.com
10
76.9
12
92.3
Duke's分期
A期
7
2
28.6
<0.05
3
42.9
<0.05
, 百拇医药
B期
20
12
60.0
15
75.0
C期
27
23
85.2
25
92.6
D期
, http://www.100md.com 10
10
100.0
10
100.0
淋巴结转移
无
27
18
66.7
>0.05
18
66.7
, 百拇医药 <0.01
有
37
29
78.4
35
94.6
图1 bcl-2蛋白在大肠癌组织中的阳性表达 ABC ×400
1～4为大肠癌，M为×174/Mnl 1分子量标志
图2 bcl-2重排的半巢式PCR结果
, http://www.100md.com
2.2 bcl-2基因表达与重排的关系
结果见表2。由表2可见，bcl-2表达阳性检出率和重排阳性检出率分别为73.4%(47/64)和82.8%(53/64)，二者一致率为90.6%(58/64)。
表2 大肠癌bcl-2基因表达与重排间的关系 bcl-2异常
病例数
异常率(%)
表达(+)+重排(+)
47
73.4
表达(+)+重排(-)
0
, 百拇医药
0
表达(-)+重排(+)
6
9.4
表达(-)+重排(-)
11
17.2
合 计
64
100.0
3 讨论
t(14∶18)(q32∶q1)染色体易位引起18号染色体上的bcl-2基因与14号染色体免疫球蛋白重链结合区(JH)串联，形成bcl-2/JH融合基因，从而使bcl-2受免疫球蛋白重链基因(IgH)启动子及增强子所控制，导致bcl-2基因过度表达，抑制细胞的程序性死亡。本研究发现，bcl-2基因异常表达与重排在大肠癌早期即已出现，随着病程演变，这种异常逐渐增多，即愈晚期异常发生率愈高。基因的重排在淋巴结有转移者亦明显多于无转移者。提示bcl-2基因参与大肠癌的发生与发展，并在大肠癌细胞的增殖、进展及转移中起重要作用。已有研究显示，bcl-2基因异常表达的癌细胞对放疗、化疗等常规凋亡诱导剂(inducers)有明显耐受〔5，6〕。晚期和转移大肠癌中bcl-2表达和重排的多见现象，可能为这种肿瘤对常规化疗药物不敏感的部分原因。因此，研究大肠癌bcl-2基因情况可用来预测治疗效果和预后，亦可为大肠癌治疗设计新的抗癌药物提供新的靶分子。
, 百拇医药
联合应用免疫组化和半巢式PCR技术检测大肠癌中bcl-2基因蛋白的表达和重排，结果重排阳性检出率高于表达阳性检出率，其中5例有bcl-2基因重排，但其表达并不高。可能原因：①bcl-2基因重排未造成该基因表达上的改变；②免疫组化法可受组织固定方式、单抗类型、抗体结合力、显色剂及观察者误差等多种因素影响。我们建立的半巢式PCR，引用两对半引物两轮PCR扩增，即经外引物扩增的片断再经内引物扩增，既增加了反应特异性，又增加了敏感性，避免了假阳性和假阴性结果的出现。因为在第一次扩增中若发生错配，第二次扩增又以第一次扩增的产物作模板，此时因模板和引物的改变，便降低了非特异性反应连续放大的可能性，故错误模板再扩增的机率很少，从而可保证反应的特异性。另外，半巢式PCR经两次连续扩增，克服了单次扩增“平台期效应”限制，使靶基因信息量大为增加，敏感性增加。该法对于组织切片中低拷贝基因的检测更具意义。两法联合应用相比较，以重排更能反应大肠癌分子特性，无疑有益于阐明bcl-2基因异常在大肠癌发生发展过程中的作用和特点。
参 考 文 献
, 百拇医药
1 Leek RD, Kaklamanis L, Pezzela F, et al. bcl-2 in normal human breast and carcinoma,association with oestrogen receptor-positive, epidermal growth factor receptor-negative tumors and in situ cancer. Br J Cancer, 1994; 69(1)∶135
2 骆成玉，詹新恩，姜 军. 乳腺癌组织中T细胞亚群分布的观察与分析. 中华实验外科杂志， 1992； 9(增刊)∶219
3 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: laboratory manuals. 2th ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989∶463-493
, 百拇医药
4 Yuan R, Dowling P, Zucca E, et al. Detection of bcl-2/JH rearrangement in follicular and diffuse lymphoma: concordant results of peripheral blood and bone marrow analysis at diagnosis. Br J Cancer, 1993; 67(5)∶922
5 Hsu B, Marin MC, Brisbay S, et al. Expression of bcl-2 gene confers multidrug resistance to chemotherapy-induced cell death. Cancer Bull, 1994; 46(1)∶125
6 Fisher TC, Milner AE, Gregory CD, et al. Bcl-2 modulation of apoptosis induced by anticancer drugs: resistance to thymidylate stress is independent of classical resistance pathways. Cancer Res, 1993; 53(15)∶3321
(1998-05-13收稿，1998-10-22修回), http://www.100md.com
单位：北京军区总医院(北京 100700)
关键词：大肠肿瘤；表达；重排；bcl-2基因
中国普外基础与临床杂志990102 摘要 应用ABC免疫组化及半巢式PCR法分别对64例大肠癌组织中bcl-2的蛋白表达及重排进行了检测。结果：bcl-2基因异常表达与重排在大肠癌早期即已出现，随着病程演变，发生率显著增加；bcl-2基因的重排在有淋巴结转移者亦明显多于无淋巴结转移者。两法联合应用相比较，以重排更能反映大肠癌分子特性。本实验结果提示：bcl-2基因参与大肠癌发生发展过程的调节，并在大肠癌细胞的增殖、进展及转移中起重要作用；研究大肠癌bcl-2基因情况可用来预测治疗效果和预后，亦为大肠癌治疗设计新的抗癌药物提供了新的靶分子。
A STUDY ON THE EXPRESSION AND REARRANGEMENT OF
, 百拇医药
BCL-2 GENE IN COLORECTAL CARCINOMA
Luo Chenyu, Li Shiyong.
Beijing Army General Hospital，Beijing 100700
Abstract The expression and rearrangement of bcl-2 gene in 64 cases with colorectal carcinoma were studied by immunohistochemical technique and semi-nest PCR respectively. The results showed the abnormal changes of the expression and rearrangement of bcl-2 gene had emerged in the early stage of colorectal carcinoma. The tumors with the expression of bcl-2 were associated with a higher incidence of metastasis to lymphatic node. The rearragement of bcl-2 was significantly higher in late-stage than that in early-stage. These suggest that bcl-2 gene involves in the regulation of the development of colorectal carcinoma. The state of the changes of bcl-2 gene in colorectal carcinoma may predict the therapeutic effect and prognosis of colorectal carcinoma.
, 百拇医药
Key words Colorectal neoplasm Expression Rearrangement Bcl-2 gene
原癌基因bcl-2在细胞凋亡的调控中起着很重要的作用，如果这一调控失常，则会导致包括肿瘤、自身免疫及AIDS等许多疾病的发生。bcl-2表达异常存在于乳腺癌、前列腺癌和肺癌等实体性肿瘤，并与这些肿瘤的生物学特性相关〔1〕。bcl-2/JH基因重排为bcl-2基因表达异常的直接原因。本研究应用免疫组化及半巢式PCR方法分别检测了大肠癌bcl-2的蛋白表达及重排情况，旨在从分子水平揭示大肠癌一方面本质，并研究其临床价值；同时也为半巢式PCR技术在其他疾病中的应用，在方法学上提供了基础。
1 材料与方法
1.1 标本来源
64例大肠癌组织取自我院住院手术治疗患者，均经病理证实。其中男40例，女24例，年龄26～74岁，平均58.41岁。手术切除后立即取小块组织行液氮速冻备检。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 免疫组化 所取肿瘤组织于-20℃～-30℃恒温冷冻切片机上作5μm厚的连续切片，-20℃保存。染色方法为ABC免疫组化法，染色步骤参照文献〔2〕方法进行。ABC试剂盒购自美国Vector公司，bcl-2单克隆抗体为Dako公司产品。实验同时设阳性对照和空白对照。其结果判定：由两人进行显微镜下独立阅片，每张切片观察5个高倍视野，阳性细胞见棕黄色颗粒状物质沉积，阳性细胞数≥10定为阳性，即为过度表达，<10为阴性。
1.2.2 半巢式PCR扩增 ①组织DNA提取，按常规酚-氯仿-异戊醇抽取基因组DNA〔3〕，TE溶解，测OD260和OD280值定量，4℃存放备用；②引物，根据bcl-2序列及t(14∶18)断裂点集中在bcl-2基因的2个热点部位〔4〕，设计两对半引物。主要断裂区(MBR)外引物C：5’-CAGCCTTGAAACATTGATGC-3’；主要断裂区内引物A：5’-TATGGTGGTTTGACCTTTAG-3’；次要断裂区(MCR)外引物D：5’-CGTGCTGGTACCACTCCTG-3’；次要断裂区内引物B：5’-GGACCTTCCTTGGTGTGTTG-3；免疫球蛋白重链基因引物JH：5’-ACCTGAGGAGACGGTGACC-3’。由于断裂点位置不同，所扩增的片断长度在200～700bp之间不等；③扩增，PCR循环在PE公司PCR仪进行，反应总体积25μl。第1轮引物用C、JH扩增MBR及D、JH扩增MCR形成的融合基因，94℃30秒、55℃35秒、72℃60秒，共35个周期。取2μl扩增产物进行第二轮扩增，引物为A、JH扩增MBR及B、JH扩增MCR形成的融合基因，条件同前。取反应产物10μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色，紫外光下观察照相记录。
, 百拇医药
1.3 统计学处理
结果采用多元回归分析。
2 结果
2.1 bcl-2基因表达及重排与大肠癌临床病理特征的关系
结果见表1及图1，2。从表1可见，bcl-2基因表达在患者性别、组织学分级及淋巴结转移之间无显著性差异(P>0.05)，但与Duke's分期明显相关(P<0.05)；该基因重排在患者性别、组织学分级间无显著性差异，但在Duke's分期和淋巴结转移间有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。
表1 bcl-2基因的表达及重排与大肠癌临床病理特征的关系 临床病理
n
表达
, 百拇医药
重排
阳性例数
百分率(%)
P
阳性例数
百分率(%)
P
性别
男
40
28
70.0
>0.05
, 百拇医药
32
80.0
>0.05
女
24
19
79.2
21
87.5
组织学分类
高分化
19
13
, 百拇医药
68.4
>0.05
14
73.7
>0.05
中分化
32
25
78.1
27
84.4
低分化
13
, http://www.100md.com
10
76.9
12
92.3
Duke's分期
A期
7
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28.6
<0.05
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42.9
<0.05
, 百拇医药
B期
20
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60.0
15
75.0
C期
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85.2
25
92.6
D期
, http://www.100md.com 10
10
100.0
10
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淋巴结转移
无
27
18
66.7
>0.05
18
66.7
, 百拇医药 <0.01
有
37
29
78.4
35
94.6
图1 bcl-2蛋白在大肠癌组织中的阳性表达 ABC ×400
1～4为大肠癌，M为×174/Mnl 1分子量标志
图2 bcl-2重排的半巢式PCR结果
, http://www.100md.com
2.2 bcl-2基因表达与重排的关系
结果见表2。由表2可见，bcl-2表达阳性检出率和重排阳性检出率分别为73.4%(47/64)和82.8%(53/64)，二者一致率为90.6%(58/64)。
表2 大肠癌bcl-2基因表达与重排间的关系 bcl-2异常
病例数
异常率(%)
表达(+)+重排(+)
47
73.4
表达(+)+重排(-)
0
, 百拇医药
0
表达(-)+重排(+)
6
9.4
表达(-)+重排(-)
11
17.2
合 计
64
100.0
3 讨论
t(14∶18)(q32∶q1)染色体易位引起18号染色体上的bcl-2基因与14号染色体免疫球蛋白重链结合区(JH)串联，形成bcl-2/JH融合基因，从而使bcl-2受免疫球蛋白重链基因(IgH)启动子及增强子所控制，导致bcl-2基因过度表达，抑制细胞的程序性死亡。本研究发现，bcl-2基因异常表达与重排在大肠癌早期即已出现，随着病程演变，这种异常逐渐增多，即愈晚期异常发生率愈高。基因的重排在淋巴结有转移者亦明显多于无转移者。提示bcl-2基因参与大肠癌的发生与发展，并在大肠癌细胞的增殖、进展及转移中起重要作用。已有研究显示，bcl-2基因异常表达的癌细胞对放疗、化疗等常规凋亡诱导剂(inducers)有明显耐受〔5，6〕。晚期和转移大肠癌中bcl-2表达和重排的多见现象，可能为这种肿瘤对常规化疗药物不敏感的部分原因。因此，研究大肠癌bcl-2基因情况可用来预测治疗效果和预后，亦可为大肠癌治疗设计新的抗癌药物提供新的靶分子。
, 百拇医药
联合应用免疫组化和半巢式PCR技术检测大肠癌中bcl-2基因蛋白的表达和重排，结果重排阳性检出率高于表达阳性检出率，其中5例有bcl-2基因重排，但其表达并不高。可能原因：①bcl-2基因重排未造成该基因表达上的改变；②免疫组化法可受组织固定方式、单抗类型、抗体结合力、显色剂及观察者误差等多种因素影响。我们建立的半巢式PCR，引用两对半引物两轮PCR扩增，即经外引物扩增的片断再经内引物扩增，既增加了反应特异性，又增加了敏感性，避免了假阳性和假阴性结果的出现。因为在第一次扩增中若发生错配，第二次扩增又以第一次扩增的产物作模板，此时因模板和引物的改变，便降低了非特异性反应连续放大的可能性，故错误模板再扩增的机率很少，从而可保证反应的特异性。另外，半巢式PCR经两次连续扩增，克服了单次扩增“平台期效应”限制，使靶基因信息量大为增加，敏感性增加。该法对于组织切片中低拷贝基因的检测更具意义。两法联合应用相比较，以重排更能反应大肠癌分子特性，无疑有益于阐明bcl-2基因异常在大肠癌发生发展过程中的作用和特点。
参 考 文 献
, 百拇医药
1 Leek RD, Kaklamanis L, Pezzela F, et al. bcl-2 in normal human breast and carcinoma,association with oestrogen receptor-positive, epidermal growth factor receptor-negative tumors and in situ cancer. Br J Cancer, 1994; 69(1)∶135
2 骆成玉，詹新恩，姜 军. 乳腺癌组织中T细胞亚群分布的观察与分析. 中华实验外科杂志， 1992； 9(增刊)∶219
3 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: laboratory manuals. 2th ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989∶463-493
, 百拇医药
4 Yuan R, Dowling P, Zucca E, et al. Detection of bcl-2/JH rearrangement in follicular and diffuse lymphoma: concordant results of peripheral blood and bone marrow analysis at diagnosis. Br J Cancer, 1993; 67(5)∶922
5 Hsu B, Marin MC, Brisbay S, et al. Expression of bcl-2 gene confers multidrug resistance to chemotherapy-induced cell death. Cancer Bull, 1994; 46(1)∶125
6 Fisher TC, Milner AE, Gregory CD, et al. Bcl-2 modulation of apoptosis induced by anticancer drugs: resistance to thymidylate stress is independent of classical resistance pathways. Cancer Res, 1993; 53(15)∶3321
(1998-05-13收稿，1998-10-22修回), http://www.100md.com