氧自由基对大鼠急性出血坏死性胰腺炎并发脑组织损害的作用
作者：赵海平 王万祥 欧阳晓晖 刘淑平 罗淑琴 杨成旺 寿乃延
单位：杨成旺 寿乃延 赵海平 王万祥 欧阳晓晖 内蒙古医学院附一院普外科(呼和浩特市，010059)；刘淑平 罗淑琴 内蒙古医学院基础部
关键词：急性出血坏死性胰腺炎；氧自由基；大鼠
990211 摘 要 目的 探讨大鼠急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)过程中，氧自由基对大鼠脑组织的损害作用。方法 通过大鼠胰胆管逆行5%牛磺胆酸钠注射诱发AHNP模型，检测6、12、24h对照组及AHNP组大鼠脑组织PLA2活性、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及脑系数(BI)，同步观察胰腺及脑组织学变化。结果 AHNP组与对照组比较，脑组织PLA2活性、MDA含量及BI增加，SOD活性降低，光镜下脑组织间质及细胞肿胀，髓鞘变性。结论 大鼠AHNP并发脑组织损害；氧自由基(OFR)可能参与脑组织损害的发展过程。
, 百拇医药
Effect of oxygen free redical on experimental rats with acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis accompanied by damage of the brain tissue.
Zhao Haiping,Wang Wanxiang,Yang Cheng wang,et al.Department of Surgery,First Affliated Hospital,Inner Monglia Medical College,010059
Abstract Objective To evaluate the effect of oxygen free redical rats with on experimental rats with acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis(AHNP) with the damage of the brain tissue.Methods The rats were randomly divided into two groups:control group and AHNP group.AHNP with damage of the brain tissue was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into the common choledocho-pancreatic duct.Phospholipid enzyme A2(PLA2)，Malondialdenhyde(MDA),scavengers superoxidedismutase(SOD) of the brain tissue and brain index(BI) were examined in control group and AHNP group.Results PLA2，MDA and BI were increased and SOD was decreased in the brain tissue of AHNP group.Conclusion The experimental model of AHNP with damage of the brain tissue is ideal.PLA2 and oxygen free redicals(OFR) participate in the occurrence and development of the brain tissue damage of AHNP.
, 百拇医药
Key word AHNP OFR Rat
目前多数作者认为胰性脑病(PE)发病机理为胰酶逸脱入血液循环，引起脑血管病变，从而出现多种精神神经症状[1]。近年来的研究表明，PLA2活化后可将胆汁内卵磷脂转变成细胞毒性溶血卵磷脂，破坏细胞膜的磷脂层，并透过血脑屏障引起脑组织出血、软化与脱髓鞘改变[2]。但氧自由基在实验性急性出血坏死性胰腺炎并发脑组织损害中的作用未见报道。本研究通过大鼠AHNP模型对脑组织损害及氧自由基变化进行观察研究。
1 材料和方法
1.1 动物分组 Wistar大鼠65只，雌雄不拘，体重250～350g；随机分成对照组(n=20，开腹后轻轻翻动胰腺，关腹)和AHNP组(n=45)。
1.2 AHNP模型复制 参照Aho等[3]方法。大鼠禁食不禁饮12h后，3%戊巴比妥钠0.1ml/100g鼠重腹腔注射麻醉，大鼠仰卧固定，上腹正中切口开腹，近肝门夹闭肝总管，以4号注射针头经十二指肠逆行插入胰胆管，夹闭固定胰胆管与针头，恒压向胰胆管内注入5%牛磺胆酸钠(包头生化厂产品)，注射量为0.1ml/100g鼠重，30s注完拔针，1min后放开血管夹，逐层关腹，放于通风处。两组术后均皮下注射生理盐水3ml/100g鼠重。
, 百拇医药
1.3 脑组织PLA2活性、MDA含量、SOD活性及脑系数(BI)测定 对照组大鼠15只、AHNP组30只分别于6、12、24h等数量活杀，开颅取全脑称重与体重比值，然后取脑额叶匀浆离心，检测其PLA2[4]活性、MDA含量、SOD活性(南京建成生物工程研究所试剂盒，化学比色法)。
1.4 生存情况 AHNP组15只，对照组5只，记录72h大鼠病死数及每只大鼠存活时间。
1.5 脑组织学观察 对照组、AHNP组于6、12、24h分别活杀5只，开颅取出额叶，行K.B法染色。后行光镜观察。
1.6 胰腺病理 取胰腺尾部组织分别浸泡10%甲醛，HE染色，光镜观察组织学变化；4%戊二醛及1%锇酸双固定，EPON812包埋超薄切片，铀铅双重染色，最后用H700H透射电镜观察。
, 百拇医药
1.7 统计处理 PLA2、SOD、MDA值及大鼠存活时间用χ±s表示，采用方差分析、t检验。两组病死率比较用χ2检验。
2 结果
2.1 脑组织PLA2活性、MDA含量、SOD活性及BI变化见表1。
表1 脑组织PLA2活性、MDA、SOD活性及BI变化(x±s) Group
Time
n
PLA2
[umol/(L*min)]
, http://www.100md.com MDA
(umol/L)
SOD
(umol/L)
BI
(×10-3)
6h
5
72.5±29.3
5.3±1.2
121.4±41.2
6.4±1.3
, http://www.100md.com
Control
12h
5
87.5±33.2
5.2±1.6
135.6±47.3
6.6±1.6
24h
5
91.5±22.5
4.4±1.3
112.7±40.8
, 百拇医药
6.8±1.2
6h
10
214.5±32.6*
23.6±5.5*
82.3±27.3*
10.4±1.1*
AHNP
12h
10
253.1±41.2*
, 百拇医药
16.7±5.3*
58.0±21.7*
9.8±1.8**
24h
10
317.6±51.5*
10.5±4.3**
46.3±18.5*
8.3±1.6**
与对照组相应各时点比较，*P<0.05；**P<0.01；对照组各时点间比较P>0.05，AHNP组各时点间比较P<0.05。
, http://www.100md.com
2.2 大鼠存活状态 对照组麻醉清醒后开始饮食、活动；AHNP组麻醉清醒后，饮水及少量进食，静卧、流泪、奔跑及相互撕咬交替进行。
2.3 胰腺及脑组织学改变
2.3.1 胰腺光镜：AHNP组光镜下胰腺腺胞及间质细胞6、12、24h分别以红细胞溢出、炎性细胞浸润、灶性凝固性坏死为主。
2.3.2 胰腺电镜：电镜下胰腺腺泡及间质细胞6h可见线粒体肿胀，粗面内质网扩张；12h线粒体肿胀，空泡样变性，嵴断失，粗面内质网脱颗粒；24h髓样小体及次级溶酶体出现，泡心细胞绒毛断失。对照组各时点镜下胰腺结构均正常。
2.3.3 脑组织光镜：对照组各时点均未发现明显脑组织病变。AHNP组6、12h脑间质及神经细胞肿胀随时间延长而加重，髓鞘无异常；24h脑间质及神经细胞破坏，髓鞘变性，但未发现脑组织出血、软化及脱髓鞘改变。
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2.4 生存情况 AHNP组大鼠72h病死率为66.7%(10/15)，病死鼠平均存活时间为19.6±7.2h；对照组72h全部存活。两组病死率比较P<0.05。
3 讨论
3.1 AHNP模型复制
目前尚无理想的实验性PE动物模型复制方法。苗毅等[5]应用PLA2经颈内动脉注射复制成功大鼠酶性PE动物模型。本实验参照Aho等方法复制实验性大鼠AHNP模型以各时点脑组织PLA2含量及胰腺及脑组织病理变化探讨AHNP合并脑组织损害并推测PE发病过程。对照组6、12、24h胰腺结构正常；AHNP组6h以胰腺出血为主，12h以胰腺出血及坏死为主，24h以胰腺坏死为主，胰腺损害随时间延长而加重，与脑组织PLA2活性变化呈平行趋势；AHNP组各时间PLA2变化均较对照组显著，对照组间无显著性差异。6、12h脑间质及神经细胞肿胀随时间延长而加重，髓鞘无异常；24h脑间质及神经细胞遭破坏，髓鞘变性，未发现脑组织出血、软化及脱髓鞘改变。大鼠急性出血坏死性胰腺炎并发脑组织损害及功能障碍，基本符合PE脑组织病理及酶的变化。该模型较稳定，重复性好，对研究AHNP合并组织损害或早期PE的变化较为理想。
, http://www.100md.com
3.2 氧自由基参与脑组织损害的发生及发展过程
氧自由基对实验性AHNP并发脑组织损害的作用未见报道。本实验AHNP组较对照组各时点MDA含量、SOD活性及BI变化均有显著性差异，AHNP组MDA与SOD各时点变化呈负相关关系(r=-0.6213,P<0.01)，而MDA及BI各时点变化呈正相关关系(r=0.5564,P<0.01)；光镜观察对照组无变化，AHNP组随时间延长逐渐出现脑间质及神经细胞肿胀、破坏及髓鞘变性，但无明显出血、坏死及脱髓鞘改变；大鼠AHNP合并脑组织损害产生的氧自由基升高加重了脑组织的损害；氧自由基在AHNP合并脑组织损害发病机理中可能起重要作用；AHNP脑组织中OFR代谢产物MDA增高可能有如下机制：(1)胆源性胰腺炎胰酶激活黄嘌呤氧化酶，该酶催化次黄嘌呤而产生OFR，OFR透过血脑屏障损害脑组织。(2)PLA2及其它炎性介质和损害的血管内膜细胞均可活化血小板，释放OFR并使脑组织遭破坏，脑微血管血栓形成；脑组织缺氧可产生OFR并加重脑损害。
, 百拇医药
参考文献
1 Pitchumoni CS,Agarwal N,Jain NK.Systemic complications of acute pancreatitis.Ann J Gastroenterol,1989，83∶597
2 Vogel FS. Demyelination induced living rabbits by means of acute pancreatitis.Ann J Gastroenterol,1989，83∶597
3 Aho J,Hom SS,Topalian SL.Experimental pancreatitis in the rat.Sc and J Gastroenterol,1980,15∶411
4 陈思锋，吴中立.体液和组织磷脂酶A2简便快速测定法.第二军医大学学报，1989，10(3)∶254
5 苗毅，钱祝银，刘训良等.胰性脑病动物模型的制备.中华实验外科杂志，1997，14(4)∶235
收稿：1998-04-28
修回：1998-10-15, 百拇医药
单位：杨成旺 寿乃延 赵海平 王万祥 欧阳晓晖 内蒙古医学院附一院普外科(呼和浩特市，010059)；刘淑平 罗淑琴 内蒙古医学院基础部
关键词：急性出血坏死性胰腺炎；氧自由基；大鼠
990211 摘 要 目的 探讨大鼠急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)过程中，氧自由基对大鼠脑组织的损害作用。方法 通过大鼠胰胆管逆行5%牛磺胆酸钠注射诱发AHNP模型，检测6、12、24h对照组及AHNP组大鼠脑组织PLA2活性、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及脑系数(BI)，同步观察胰腺及脑组织学变化。结果 AHNP组与对照组比较，脑组织PLA2活性、MDA含量及BI增加，SOD活性降低，光镜下脑组织间质及细胞肿胀，髓鞘变性。结论 大鼠AHNP并发脑组织损害；氧自由基(OFR)可能参与脑组织损害的发展过程。
, 百拇医药
Effect of oxygen free redical on experimental rats with acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis accompanied by damage of the brain tissue.
Zhao Haiping,Wang Wanxiang,Yang Cheng wang,et al.Department of Surgery,First Affliated Hospital,Inner Monglia Medical College,010059
Abstract Objective To evaluate the effect of oxygen free redical rats with on experimental rats with acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis(AHNP) with the damage of the brain tissue.Methods The rats were randomly divided into two groups:control group and AHNP group.AHNP with damage of the brain tissue was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into the common choledocho-pancreatic duct.Phospholipid enzyme A2(PLA2)，Malondialdenhyde(MDA),scavengers superoxidedismutase(SOD) of the brain tissue and brain index(BI) were examined in control group and AHNP group.Results PLA2，MDA and BI were increased and SOD was decreased in the brain tissue of AHNP group.Conclusion The experimental model of AHNP with damage of the brain tissue is ideal.PLA2 and oxygen free redicals(OFR) participate in the occurrence and development of the brain tissue damage of AHNP.
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Key word AHNP OFR Rat
目前多数作者认为胰性脑病(PE)发病机理为胰酶逸脱入血液循环，引起脑血管病变，从而出现多种精神神经症状[1]。近年来的研究表明，PLA2活化后可将胆汁内卵磷脂转变成细胞毒性溶血卵磷脂，破坏细胞膜的磷脂层，并透过血脑屏障引起脑组织出血、软化与脱髓鞘改变[2]。但氧自由基在实验性急性出血坏死性胰腺炎并发脑组织损害中的作用未见报道。本研究通过大鼠AHNP模型对脑组织损害及氧自由基变化进行观察研究。
1 材料和方法
1.1 动物分组 Wistar大鼠65只，雌雄不拘，体重250～350g；随机分成对照组(n=20，开腹后轻轻翻动胰腺，关腹)和AHNP组(n=45)。
1.2 AHNP模型复制 参照Aho等[3]方法。大鼠禁食不禁饮12h后，3%戊巴比妥钠0.1ml/100g鼠重腹腔注射麻醉，大鼠仰卧固定，上腹正中切口开腹，近肝门夹闭肝总管，以4号注射针头经十二指肠逆行插入胰胆管，夹闭固定胰胆管与针头，恒压向胰胆管内注入5%牛磺胆酸钠(包头生化厂产品)，注射量为0.1ml/100g鼠重，30s注完拔针，1min后放开血管夹，逐层关腹，放于通风处。两组术后均皮下注射生理盐水3ml/100g鼠重。
, 百拇医药
1.3 脑组织PLA2活性、MDA含量、SOD活性及脑系数(BI)测定 对照组大鼠15只、AHNP组30只分别于6、12、24h等数量活杀，开颅取全脑称重与体重比值，然后取脑额叶匀浆离心，检测其PLA2[4]活性、MDA含量、SOD活性(南京建成生物工程研究所试剂盒，化学比色法)。
1.4 生存情况 AHNP组15只，对照组5只，记录72h大鼠病死数及每只大鼠存活时间。
1.5 脑组织学观察 对照组、AHNP组于6、12、24h分别活杀5只，开颅取出额叶，行K.B法染色。后行光镜观察。
1.6 胰腺病理 取胰腺尾部组织分别浸泡10%甲醛，HE染色，光镜观察组织学变化；4%戊二醛及1%锇酸双固定，EPON812包埋超薄切片，铀铅双重染色，最后用H700H透射电镜观察。
, 百拇医药
1.7 统计处理 PLA2、SOD、MDA值及大鼠存活时间用χ±s表示，采用方差分析、t检验。两组病死率比较用χ2检验。
2 结果
2.1 脑组织PLA2活性、MDA含量、SOD活性及BI变化见表1。
表1 脑组织PLA2活性、MDA、SOD活性及BI变化(x±s) Group
Time
n
PLA2
[umol/(L*min)]
, http://www.100md.com MDA
(umol/L)
SOD
(umol/L)
BI
(×10-3)
6h
5
72.5±29.3
5.3±1.2
121.4±41.2
6.4±1.3
, http://www.100md.com
Control
12h
5
87.5±33.2
5.2±1.6
135.6±47.3
6.6±1.6
24h
5
91.5±22.5
4.4±1.3
112.7±40.8
, 百拇医药
6.8±1.2
6h
10
214.5±32.6*
23.6±5.5*
82.3±27.3*
10.4±1.1*
AHNP
12h
10
253.1±41.2*
, 百拇医药
16.7±5.3*
58.0±21.7*
9.8±1.8**
24h
10
317.6±51.5*
10.5±4.3**
46.3±18.5*
8.3±1.6**
与对照组相应各时点比较，*P<0.05；**P<0.01；对照组各时点间比较P>0.05，AHNP组各时点间比较P<0.05。
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2.2 大鼠存活状态 对照组麻醉清醒后开始饮食、活动；AHNP组麻醉清醒后，饮水及少量进食，静卧、流泪、奔跑及相互撕咬交替进行。
2.3 胰腺及脑组织学改变
2.3.1 胰腺光镜：AHNP组光镜下胰腺腺胞及间质细胞6、12、24h分别以红细胞溢出、炎性细胞浸润、灶性凝固性坏死为主。
2.3.2 胰腺电镜：电镜下胰腺腺泡及间质细胞6h可见线粒体肿胀，粗面内质网扩张；12h线粒体肿胀，空泡样变性，嵴断失，粗面内质网脱颗粒；24h髓样小体及次级溶酶体出现，泡心细胞绒毛断失。对照组各时点镜下胰腺结构均正常。
2.3.3 脑组织光镜：对照组各时点均未发现明显脑组织病变。AHNP组6、12h脑间质及神经细胞肿胀随时间延长而加重，髓鞘无异常；24h脑间质及神经细胞破坏，髓鞘变性，但未发现脑组织出血、软化及脱髓鞘改变。
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2.4 生存情况 AHNP组大鼠72h病死率为66.7%(10/15)，病死鼠平均存活时间为19.6±7.2h；对照组72h全部存活。两组病死率比较P<0.05。
3 讨论
3.1 AHNP模型复制
目前尚无理想的实验性PE动物模型复制方法。苗毅等[5]应用PLA2经颈内动脉注射复制成功大鼠酶性PE动物模型。本实验参照Aho等方法复制实验性大鼠AHNP模型以各时点脑组织PLA2含量及胰腺及脑组织病理变化探讨AHNP合并脑组织损害并推测PE发病过程。对照组6、12、24h胰腺结构正常；AHNP组6h以胰腺出血为主，12h以胰腺出血及坏死为主，24h以胰腺坏死为主，胰腺损害随时间延长而加重，与脑组织PLA2活性变化呈平行趋势；AHNP组各时间PLA2变化均较对照组显著，对照组间无显著性差异。6、12h脑间质及神经细胞肿胀随时间延长而加重，髓鞘无异常；24h脑间质及神经细胞遭破坏，髓鞘变性，未发现脑组织出血、软化及脱髓鞘改变。大鼠急性出血坏死性胰腺炎并发脑组织损害及功能障碍，基本符合PE脑组织病理及酶的变化。该模型较稳定，重复性好，对研究AHNP合并组织损害或早期PE的变化较为理想。
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3.2 氧自由基参与脑组织损害的发生及发展过程
氧自由基对实验性AHNP并发脑组织损害的作用未见报道。本实验AHNP组较对照组各时点MDA含量、SOD活性及BI变化均有显著性差异，AHNP组MDA与SOD各时点变化呈负相关关系(r=-0.6213,P<0.01)，而MDA及BI各时点变化呈正相关关系(r=0.5564,P<0.01)；光镜观察对照组无变化，AHNP组随时间延长逐渐出现脑间质及神经细胞肿胀、破坏及髓鞘变性，但无明显出血、坏死及脱髓鞘改变；大鼠AHNP合并脑组织损害产生的氧自由基升高加重了脑组织的损害；氧自由基在AHNP合并脑组织损害发病机理中可能起重要作用；AHNP脑组织中OFR代谢产物MDA增高可能有如下机制：(1)胆源性胰腺炎胰酶激活黄嘌呤氧化酶，该酶催化次黄嘌呤而产生OFR，OFR透过血脑屏障损害脑组织。(2)PLA2及其它炎性介质和损害的血管内膜细胞均可活化血小板，释放OFR并使脑组织遭破坏，脑微血管血栓形成；脑组织缺氧可产生OFR并加重脑损害。
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参考文献
1 Pitchumoni CS,Agarwal N,Jain NK.Systemic complications of acute pancreatitis.Ann J Gastroenterol,1989，83∶597
2 Vogel FS. Demyelination induced living rabbits by means of acute pancreatitis.Ann J Gastroenterol,1989，83∶597
3 Aho J,Hom SS,Topalian SL.Experimental pancreatitis in the rat.Sc and J Gastroenterol,1980,15∶411
4 陈思锋，吴中立.体液和组织磷脂酶A2简便快速测定法.第二军医大学学报，1989，10(3)∶254
5 苗毅，钱祝银，刘训良等.胰性脑病动物模型的制备.中华实验外科杂志，1997，14(4)∶235
收稿：1998-04-28
修回：1998-10-15, 百拇医药