老年骨质疏松小鼠钙含量的研究1
作者：张建国 袁 丁 王遵琼 李红军
单位：湖北三峡学院医学院解剖学教研室，宜昌 443003
关键词：骨质疏松；钙；衰老
990227 摘 要 目的 建立糖皮质激素诱导的老年小鼠骨质疏松模型，探讨以单位体积的钙重量变化来反映骨质疏松状况。方法 老年小鼠按不同剂量每周肌注地塞米松2次(高剂量组0.005 mg/g；中剂量组0.001 mg/g；低剂量组0.000 5 mg/g)，实验第12周末时，采用排水法测量小鼠右侧股骨体积，采用化学方法测量小鼠骨钙。结果 对照组骨钙含量(0.221 5±0.023 6 g/cm3)较中等剂量组(0.169 8±0.240 0 g/cm3)高(P<0.01)，与低剂量组(0.211 9±0.021 5 g/cm3)其差异无显著性(P>0.05)。结论 该动物模型及单位体积的钙重量表达方式可应用于实验研究。
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骨质疏松的病理特征是单位体积的骨量，以矿物质和骨基质等比例减少〔1〕。然而在实验研究中，以单位体积衡量骨钙含量(钙重/体积)的形式较少〔2，3〕，难以准确地反映骨质疏松时钙的状况。因而需探讨测量老年小鼠股骨解剖学体积，用化学方法测量骨钙重量，为研究骨质疏松单位体积骨钙变化提供一种更为精确的方法。
1 材料和方法
1.1 动物分组及给药方法 动物采用昆明种小鼠60只，雄性，24月龄，体重为46～52g，本院动物室提供。药物为地塞米松磷酸钠注射液(湖北省襄凡市生化制药厂生产，批号660803，规格2.5mg/ml)。将60只小鼠随机分为4组：对照组、低剂量组(0.0005mg/g)，中剂量组(0.001mg/g)和高剂量组(0.005mg/g)，每周注射2次，对照组给予等体积的生理盐水。于实验第12周末时断颈处死动物，取右侧股骨，仔细清除软组织，置80℃烤箱烘干48h，干燥保存、备用。
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1.2 方法
1.2.1 股骨体积测量 将已干燥股骨称重、记录、定义为B。仪器为电子天平(上海天平仪器厂生产JA-2003)。然后将股骨置入直径约5.2mm的卡介苗注射器内，用其针芯将骨推至底部，并置入4℃水中，抽芯待股骨为水所浸泡，翻转，将空气逼出，使芯抵住骨。此时，注射器内仅为水和骨，称重，记录为C。用卡尺(精确度为0.02mm)测量芯离注射器底部的间距，记录为L。抽去芯，倒去水，取出骨，插入芯，抽水至L时，用滤纸将注射器周围的水吸干、称重，记录为D。按V=D+B-C，则可计算出该骨在注射器内所占体积，为水替代后，其水的重量。根据水的体积与重量关系：水在4℃时，1g水的体积为1cm3，即可将重量换算成体积。
1.2.2 骨钙测量方法 试剂：EDTA标准溶液(0.0100mol/L)；氨性缓冲液(pH≈10)，络黑T溶液(0.5%)，三乙醇胺溶液(20%)。样品制备：取完整、干燥股骨置于5ml10%HCl溶液7d，更换5ml10%HCl溶液，再浸泡7d，共3次，收集浸泡液15ml。此时股骨钙已溶于10%HCl液中。将15ml液体稀释至100ml，备用。测定步骤：取30ml样品置于锥形瓶中，加入1ml三乙醇胺，5ml氨性缓冲液；用0.05mol/LNaOH溶液中和至pH=6.5～7.0；滴入2～3滴络黑T指标剂，用EDTA标准溶液滴至溶液中紫红色变为蓝色即为终点，记录消耗EDTA标准溶液的体积，计算样品的钙含量。
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计算公式，分两步计算：
①用标准镁标定EDTA的准确浓度
②用标准EDTA浓度计算样品钙含量
钙含量(mg)=CEDTA×VEDTA×Mca(钙原子量)×100/30
2 结 果
2.1 一般情况 对照组体毛光泽度较好，反应较灵活，且与低剂量组无明显差异。中剂量组则精神差，反应较迟缓。高剂量组出现明显畏寒，反应迟缓，毛发无光泽，稀疏，精神萎靡，部分小鼠因逐渐衰退而致死亡(3只)。因此，高剂量不宜制作骨质疏松模型。
, 百拇医药 2.2 股骨体积、骨钙测定 见表1。各组平均股骨体积差异无显著性，可考虑为一个总体，其均数为0.0766±0.0069mg/cm3。小剂量组与对照组骨钙含量差异无显著性(P>0.05)。中剂量组骨钙含量较对照组低，其差异有高度显著性(P<0.01)，表明中等剂量地塞米松(0.001mg/g)所诱导的骨质疏松模型已经建立。
表1 老年小鼠股骨体积及钙含量 组别
n
平均股骨体积(cm3)
平均骨钙含量(g/cm3)
对照组
15
0.0770±0.0068
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0.2215±0.0236
小剂量组
15
0.0778±0.0057
0.2119±0.0215
中剂量组
15
0.0751±0.0077
0.1698±0.0240
合计
45
0.0766±0.0069
, 百拇医药
中剂量组与对照组平均骨钙含量比较：P<0.01
3 讨 论
3.1 骨体积测量 Trotter〔4〕等采用“置换小米法”(Milletseaddisplacement)测量骨体积，并以重量/体积形式证明人类骨量随增龄而丢失。Burtley和Arnold〔4〕则采用单位体积所含灰化骨的形式证明了人类从30岁起每10年骨量减少7%～9%。但在实验研究中，各种测量骨量的方法，无论X线摄片，还是单光子、双光子吸收法，或是X线定量测量〔5〕，都只能反映单位面积内的骨量，而不是单位体积的骨量。显然，这是不够精确的，这可能是由于骨体积不规则，难以测量所致。而要准确反映骨质疏松状况，仍有必要建立重量/体积的表达形式。直接测量小鼠股骨体积极为困难，但将其体积测量转化为重量测量后，则变得简明且精确可靠。
3.2 骨钙测量 钙是骨矿物质羟磷灰石的主要成份，测量骨钙可反映骨量的变化情况。但目前有关测量矿化骨〔6〕、骨钙〔7〕，是先称骨的重量，然后测量。这实际上反映的是单位重量的骨矿物或骨钙含量，而不是单位体积的含量，与骨质疏松的定义相差甚远。因而不能够准确地反映骨质疏松状况。本实验表明：制造老年骨质疏松小鼠模型，其地塞米松的肌注剂量在0.001mg/g左右为宜，太低不宜诱导骨质疏松，太高则易致动物死亡。本研究所建立的老年骨质疏松模型及“骨钙/体积”形式，将为进一步进行实验研究提供依据。
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1 湖北省教委科学基金资助(97A042)
作者简介：张建国，男，40岁，副教授，从事骨生物学研究
4 参考文献
1 Souhami RL，Moxhan J.Text book of medicine.In:Osteoporosis 1st ed.London:Churchill Livingstone,1990：733-735
2 韩泽辉.实验性绝经后骨质疏松症的性激素治疗.中华外科杂志，1992；30(8)：451
3 Joseph ML，Edward HR，Philip ZW.Osteoporosis:Diagnosis and treatment.J Bone and Joint Surg，1996；78A(4)：618
, http://www.100md.com
4 Nordin BEC.Metabolic bone and stone disease.1st ed.Britain:Aberdeen University Press,1973：1-51
5 陈小妹，邱明才，张 鑫 et al.检测骨质疏松方法的比较.中华内分泌代谢杂志，1995；11(2)：101
6 李 明，刘植珊，高建章 et al.实验性大鼠废用性骨质疏松的耦合电容场治疗.中华外科杂志，1992；30(8)：458
7 张剑宇，李 丽，罗润明.骨疏灵治疗药物性骨质疏松症的实验研究.中华内科杂志，1995；34(6)：410
〔1998-05-08收稿 1998-10-12修回〕, 百拇医药
单位：湖北三峡学院医学院解剖学教研室，宜昌 443003
关键词：骨质疏松；钙；衰老
990227 摘 要 目的 建立糖皮质激素诱导的老年小鼠骨质疏松模型，探讨以单位体积的钙重量变化来反映骨质疏松状况。方法 老年小鼠按不同剂量每周肌注地塞米松2次(高剂量组0.005 mg/g；中剂量组0.001 mg/g；低剂量组0.000 5 mg/g)，实验第12周末时，采用排水法测量小鼠右侧股骨体积，采用化学方法测量小鼠骨钙。结果 对照组骨钙含量(0.221 5±0.023 6 g/cm3)较中等剂量组(0.169 8±0.240 0 g/cm3)高(P<0.01)，与低剂量组(0.211 9±0.021 5 g/cm3)其差异无显著性(P>0.05)。结论 该动物模型及单位体积的钙重量表达方式可应用于实验研究。
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骨质疏松的病理特征是单位体积的骨量，以矿物质和骨基质等比例减少〔1〕。然而在实验研究中，以单位体积衡量骨钙含量(钙重/体积)的形式较少〔2，3〕，难以准确地反映骨质疏松时钙的状况。因而需探讨测量老年小鼠股骨解剖学体积，用化学方法测量骨钙重量，为研究骨质疏松单位体积骨钙变化提供一种更为精确的方法。
1 材料和方法
1.1 动物分组及给药方法 动物采用昆明种小鼠60只，雄性，24月龄，体重为46～52g，本院动物室提供。药物为地塞米松磷酸钠注射液(湖北省襄凡市生化制药厂生产，批号660803，规格2.5mg/ml)。将60只小鼠随机分为4组：对照组、低剂量组(0.0005mg/g)，中剂量组(0.001mg/g)和高剂量组(0.005mg/g)，每周注射2次，对照组给予等体积的生理盐水。于实验第12周末时断颈处死动物，取右侧股骨，仔细清除软组织，置80℃烤箱烘干48h，干燥保存、备用。
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1.2 方法
1.2.1 股骨体积测量 将已干燥股骨称重、记录、定义为B。仪器为电子天平(上海天平仪器厂生产JA-2003)。然后将股骨置入直径约5.2mm的卡介苗注射器内，用其针芯将骨推至底部，并置入4℃水中，抽芯待股骨为水所浸泡，翻转，将空气逼出，使芯抵住骨。此时，注射器内仅为水和骨，称重，记录为C。用卡尺(精确度为0.02mm)测量芯离注射器底部的间距，记录为L。抽去芯，倒去水，取出骨，插入芯，抽水至L时，用滤纸将注射器周围的水吸干、称重，记录为D。按V=D+B-C，则可计算出该骨在注射器内所占体积，为水替代后，其水的重量。根据水的体积与重量关系：水在4℃时，1g水的体积为1cm3，即可将重量换算成体积。
1.2.2 骨钙测量方法 试剂：EDTA标准溶液(0.0100mol/L)；氨性缓冲液(pH≈10)，络黑T溶液(0.5%)，三乙醇胺溶液(20%)。样品制备：取完整、干燥股骨置于5ml10%HCl溶液7d，更换5ml10%HCl溶液，再浸泡7d，共3次，收集浸泡液15ml。此时股骨钙已溶于10%HCl液中。将15ml液体稀释至100ml，备用。测定步骤：取30ml样品置于锥形瓶中，加入1ml三乙醇胺，5ml氨性缓冲液；用0.05mol/LNaOH溶液中和至pH=6.5～7.0；滴入2～3滴络黑T指标剂，用EDTA标准溶液滴至溶液中紫红色变为蓝色即为终点，记录消耗EDTA标准溶液的体积，计算样品的钙含量。
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计算公式，分两步计算：
①用标准镁标定EDTA的准确浓度
②用标准EDTA浓度计算样品钙含量
钙含量(mg)=CEDTA×VEDTA×Mca(钙原子量)×100/30
2 结 果
2.1 一般情况 对照组体毛光泽度较好，反应较灵活，且与低剂量组无明显差异。中剂量组则精神差，反应较迟缓。高剂量组出现明显畏寒，反应迟缓，毛发无光泽，稀疏，精神萎靡，部分小鼠因逐渐衰退而致死亡(3只)。因此，高剂量不宜制作骨质疏松模型。
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表1 老年小鼠股骨体积及钙含量 组别
n
平均股骨体积(cm3)
平均骨钙含量(g/cm3)
对照组
15
0.0770±0.0068
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0.2215±0.0236
小剂量组
15
0.0778±0.0057
0.2119±0.0215
中剂量组
15
0.0751±0.0077
0.1698±0.0240
合计
45
0.0766±0.0069
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中剂量组与对照组平均骨钙含量比较：P<0.01
3 讨 论
3.1 骨体积测量 Trotter〔4〕等采用“置换小米法”(Milletseaddisplacement)测量骨体积，并以重量/体积形式证明人类骨量随增龄而丢失。Burtley和Arnold〔4〕则采用单位体积所含灰化骨的形式证明了人类从30岁起每10年骨量减少7%～9%。但在实验研究中，各种测量骨量的方法，无论X线摄片，还是单光子、双光子吸收法，或是X线定量测量〔5〕，都只能反映单位面积内的骨量，而不是单位体积的骨量。显然，这是不够精确的，这可能是由于骨体积不规则，难以测量所致。而要准确反映骨质疏松状况，仍有必要建立重量/体积的表达形式。直接测量小鼠股骨体积极为困难，但将其体积测量转化为重量测量后，则变得简明且精确可靠。
3.2 骨钙测量 钙是骨矿物质羟磷灰石的主要成份，测量骨钙可反映骨量的变化情况。但目前有关测量矿化骨〔6〕、骨钙〔7〕，是先称骨的重量，然后测量。这实际上反映的是单位重量的骨矿物或骨钙含量，而不是单位体积的含量，与骨质疏松的定义相差甚远。因而不能够准确地反映骨质疏松状况。本实验表明：制造老年骨质疏松小鼠模型，其地塞米松的肌注剂量在0.001mg/g左右为宜，太低不宜诱导骨质疏松，太高则易致动物死亡。本研究所建立的老年骨质疏松模型及“骨钙/体积”形式，将为进一步进行实验研究提供依据。
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1 湖北省教委科学基金资助(97A042)
作者简介：张建国，男，40岁，副教授，从事骨生物学研究
4 参考文献
1 Souhami RL，Moxhan J.Text book of medicine.In:Osteoporosis 1st ed.London:Churchill Livingstone,1990：733-735
2 韩泽辉.实验性绝经后骨质疏松症的性激素治疗.中华外科杂志，1992；30(8)：451
3 Joseph ML，Edward HR，Philip ZW.Osteoporosis:Diagnosis and treatment.J Bone and Joint Surg，1996；78A(4)：618
, http://www.100md.com
4 Nordin BEC.Metabolic bone and stone disease.1st ed.Britain:Aberdeen University Press,1973：1-51
5 陈小妹，邱明才，张 鑫 et al.检测骨质疏松方法的比较.中华内分泌代谢杂志，1995；11(2)：101
6 李 明，刘植珊，高建章 et al.实验性大鼠废用性骨质疏松的耦合电容场治疗.中华外科杂志，1992；30(8)：458
7 张剑宇，李 丽，罗润明.骨疏灵治疗药物性骨质疏松症的实验研究.中华内科杂志，1995；34(6)：410
〔1998-05-08收稿 1998-10-12修回〕, 百拇医药