双相血培养基的制备及应用评价
作者：刘 丁 张文俊 陈 萍 邓光贵 曾估群 刘昌林 刘 岚
单位：第三军医大学大坪医院检验科(刘 丁 张文俊 陈 萍 邓光贵)；重庆医科大学儿童医院检验科(曾估群 刘昌林 刘 岚)
关键词：
重庆医学990235
血培养是临床上检测菌血症、败血症不可缺少的诊断方法。目前，国内绝大多数实验室仍处于传统网汤基础的血培养阶段，普遍存在营养成份不高，苛养菌不易生长，阳性率较低，需传种并费时等缺点。双相血培养基能较好地解决这些问题，并且不需特殊设备，虽然，已有进口双相血培养基市售，但价格较高，为此，我们对照有关文献[1～3]，主要选用国产原料成份自制了一种双相血培养基，与国外同类产品进行了比较，并应用于临床，效果较好，现报告如下。
材料与方法
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一、双相血培养基的制备
1.液相培养基：按常规制备脑心浸液1000ml[4]，加入蛋白多胨8g，葡萄糖3g，氯化钠5g，Tris1.7g，聚乙烯磺酸钠(SPS)0.25g，氯化血红素5mg，酵母浸膏5g，并调pH至7.2～7.4，常规高压灭菌后，分别加入适量的无菌处理生长因子及辅酶Ⅰ50mg，制成液相培养基。
2.固相培养基：按常规制备脑心浸液1000ml[4]加入蛋白多胨10g，水解酪蛋白5g，酵母浸膏5g，葡萄糖1g，氯化钠5g，Tris0.7g，琼脂17g，氯化血红素5mg，调pH至7.2～7.4，常规高压灭菌。
3.先取灭菌后的固相成份30ml于血培养瓶中，制成固相斜面，再加入40ml的液相成份，即制成双相血培养基。
二、实验方法
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1.最小检出试验：分别将标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌ATCC25922、铜绿假单孢菌ATCC27853的单个菌落，置2ml无菌生理盐水中制成悬液，以10倍法稀释成每毫升含100个和10个菌落数的两种菌液(用倾注法培养计数菌落数)按1∶10的比例与正常人新鲜血混合制成10cfu/ml、1cfu/ml，不同浓度的模拟菌血标本5ml注入自制双相血培养基于35℃环境下孵育，每8小时观察细菌生长情况。
2.对比试验：取临床分离出的不同病原菌，制成模拟菌血标本共24份，用自制和进口双相血培养瓶(bioMerieux产)及传统肉汤血培养基，进行同时培养比较，若1周不生长，判为阴性。
3.临床应用：将自制双相血培养基在两所医院同时应用，观察其阳性率及检出细菌的种类。
三、统计分析：用t检验比较两种血培养基的差异。
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结 果
表1 24份模拟菌血标本在不同培养基中检出情况比较 菌血标本细菌名称
株数
阳性株数(%)
进口
自制
肉汤
金黄色葡萄球菌
5
5
5
5
无乳链球菌
, 百拇医药
2
2
2
1
草绿色链球菌
3
3
3
1
马红球菌
1
1
1
0
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淋病奈瑟氏菌
1
0
1
0
大肠埃希菌
5
5
5
5
铜绿假单孢菌
4
4
4
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4
白色念珠菌
3
3
3
3
合 计
24
23(95.7%)
24(100%)
19(79.2%)
一、自制双相血培养基的最小检出菌量：三种标准菌株，当其菌血浓度10个/ml时，培养16小时，均有明显细菌生长。当菌血浓度大约为1cfu/ml时，培养16小时，只见绿脓杆菌生长，24小时后可见金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌生长。
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三、两种血培养基的比较：24份模拟菌血标本在两种血培养基的生长情况比较见表1。在24份标本中，进口培养基阳性检出率为23株，自制培养基为24株，经t检验其检出率无明显差异(P>0.05)；传统肉汤阳性检出率为19株，均较上述两种培养基低(p均<0.01)。
临床应用：从临床送检557份标本中，共54份标本有菌生长，阳性率9.7%，经鉴定细菌种类如表2所示表2 54株血培养细菌分布 细菌种类
株数
%
细菌种类
株数
%
金黄色葡萄球菌
, 百拇医药 6
11.11
荧光假单胞杆菌
1
1.85
凝固酶阴性葡萄球菌
12
22.22
产单核李斯特氏菌
2
3.70
乙型链球菌
3
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5.56
藤黄微球菌
3
5.56
草绿色链球菌
3
5.56
大肠埃希氏菌
1
1.85
伤寒沙门氏菌
2
3.70
, 百拇医药
硝酸盐阴性杆菌
1
1.85
铜绿假单胞菌
3
5.56
奴卡氏菌
1
1.85
肺炎克雷伯氏菌
2
3.70
酵母样霉菌
, 百拇医药
4
7.41
液化沙雷氏菌
1
1.85
白色念珠菌
1
1.85
阴沟肠杆菌
1
1.85
类白喉棒状杆菌
3
, 百拇医药
5.56
黄杆菌属
1
1.85
库尔特氏杆菌
2
3.70
乙酸钙不动杆菌
1
1.85
合计
54
100.00
, 百拇医药
讨 论
快速、准确检测出血液中的病原菌是血培养检查的目标。尽管国内有部分实验室使用全自动血培养仪来检测细菌生长，但绝大部分实验室的血培养尚处在手工操作观察阳性结果阶段，加之目前国产市售成品的血培养基营养成份单一，均为液相成份，导致阳性率低，同时在盲传过程中易被污染，而自制双相培养基营养成份丰富，固、液相一体易于观察，同时，缩短了传种培养时间，从而达到了快速、准确的目的，从本血培养基检出菌量来看每毫升血中如含有1个左右菌落数，即可检测出阳性结果，敏感性高于一般增菌培养10cfu/ml细菌数。同时本实验中采用了临床上分离出的、由本室保存的菌株，制成模拟菌血标本，较普遍地代表了病原微生物的不同生长特性，自制和进口血培养基培养结果表明自制培养基检出率与进口产品相近，且高于普通肉汤培养基。说明自制血培养基营养丰富，含有氨基营养丰富，含有氨基酸、维生素、生长因子(X、V因子)及辅酶等成份，适宜于各种细菌生长，特别是淋病奈瑟氏菌也能在此培养基生长，说明该培养基可用于脑脊液的培养，具有适于脑膜炎奈瑟氏菌生长的条件，能满足临床上快速、准确之需要。临床运用其阳性检出率为9.7%，除能培养出一般细菌外，还能培养出一些苛养菌，同时，具有成本较低、使用方便、不易受污染等特点，适于基层医院微生物室应用。, 百拇医药
单位：第三军医大学大坪医院检验科(刘 丁 张文俊 陈 萍 邓光贵)；重庆医科大学儿童医院检验科(曾估群 刘昌林 刘 岚)
关键词：
重庆医学990235
血培养是临床上检测菌血症、败血症不可缺少的诊断方法。目前，国内绝大多数实验室仍处于传统网汤基础的血培养阶段，普遍存在营养成份不高，苛养菌不易生长，阳性率较低，需传种并费时等缺点。双相血培养基能较好地解决这些问题，并且不需特殊设备，虽然，已有进口双相血培养基市售，但价格较高，为此，我们对照有关文献[1～3]，主要选用国产原料成份自制了一种双相血培养基，与国外同类产品进行了比较，并应用于临床，效果较好，现报告如下。
材料与方法
, http://www.100md.com
一、双相血培养基的制备
1.液相培养基：按常规制备脑心浸液1000ml[4]，加入蛋白多胨8g，葡萄糖3g，氯化钠5g，Tris1.7g，聚乙烯磺酸钠(SPS)0.25g，氯化血红素5mg，酵母浸膏5g，并调pH至7.2～7.4，常规高压灭菌后，分别加入适量的无菌处理生长因子及辅酶Ⅰ50mg，制成液相培养基。
2.固相培养基：按常规制备脑心浸液1000ml[4]加入蛋白多胨10g，水解酪蛋白5g，酵母浸膏5g，葡萄糖1g，氯化钠5g，Tris0.7g，琼脂17g，氯化血红素5mg，调pH至7.2～7.4，常规高压灭菌。
3.先取灭菌后的固相成份30ml于血培养瓶中，制成固相斜面，再加入40ml的液相成份，即制成双相血培养基。
二、实验方法
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1.最小检出试验：分别将标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌ATCC25922、铜绿假单孢菌ATCC27853的单个菌落，置2ml无菌生理盐水中制成悬液，以10倍法稀释成每毫升含100个和10个菌落数的两种菌液(用倾注法培养计数菌落数)按1∶10的比例与正常人新鲜血混合制成10cfu/ml、1cfu/ml，不同浓度的模拟菌血标本5ml注入自制双相血培养基于35℃环境下孵育，每8小时观察细菌生长情况。
2.对比试验：取临床分离出的不同病原菌，制成模拟菌血标本共24份，用自制和进口双相血培养瓶(bioMerieux产)及传统肉汤血培养基，进行同时培养比较，若1周不生长，判为阴性。
3.临床应用：将自制双相血培养基在两所医院同时应用，观察其阳性率及检出细菌的种类。
三、统计分析：用t检验比较两种血培养基的差异。
, http://www.100md.com
结 果
表1 24份模拟菌血标本在不同培养基中检出情况比较 菌血标本细菌名称
株数
阳性株数(%)
进口
自制
肉汤
金黄色葡萄球菌
5
5
5
5
无乳链球菌
, 百拇医药
2
2
2
1
草绿色链球菌
3
3
3
1
马红球菌
1
1
1
0
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淋病奈瑟氏菌
1
0
1
0
大肠埃希菌
5
5
5
5
铜绿假单孢菌
4
4
4
, http://www.100md.com
4
白色念珠菌
3
3
3
3
合 计
24
23(95.7%)
24(100%)
19(79.2%)
一、自制双相血培养基的最小检出菌量：三种标准菌株，当其菌血浓度10个/ml时，培养16小时，均有明显细菌生长。当菌血浓度大约为1cfu/ml时，培养16小时，只见绿脓杆菌生长，24小时后可见金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌生长。
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三、两种血培养基的比较：24份模拟菌血标本在两种血培养基的生长情况比较见表1。在24份标本中，进口培养基阳性检出率为23株，自制培养基为24株，经t检验其检出率无明显差异(P>0.05)；传统肉汤阳性检出率为19株，均较上述两种培养基低(p均<0.01)。
临床应用：从临床送检557份标本中，共54份标本有菌生长，阳性率9.7%，经鉴定细菌种类如表2所示表2 54株血培养细菌分布 细菌种类
株数
%
细菌种类
株数
%
金黄色葡萄球菌
, 百拇医药 6
11.11
荧光假单胞杆菌
1
1.85
凝固酶阴性葡萄球菌
12
22.22
产单核李斯特氏菌
2
3.70
乙型链球菌
3
, http://www.100md.com
5.56
藤黄微球菌
3
5.56
草绿色链球菌
3
5.56
大肠埃希氏菌
1
1.85
伤寒沙门氏菌
2
3.70
, 百拇医药
硝酸盐阴性杆菌
1
1.85
铜绿假单胞菌
3
5.56
奴卡氏菌
1
1.85
肺炎克雷伯氏菌
2
3.70
酵母样霉菌
, 百拇医药
4
7.41
液化沙雷氏菌
1
1.85
白色念珠菌
1
1.85
阴沟肠杆菌
1
1.85
类白喉棒状杆菌
3
, 百拇医药
5.56
黄杆菌属
1
1.85
库尔特氏杆菌
2
3.70
乙酸钙不动杆菌
1
1.85
合计
54
100.00
, 百拇医药
讨 论
快速、准确检测出血液中的病原菌是血培养检查的目标。尽管国内有部分实验室使用全自动血培养仪来检测细菌生长，但绝大部分实验室的血培养尚处在手工操作观察阳性结果阶段，加之目前国产市售成品的血培养基营养成份单一，均为液相成份，导致阳性率低，同时在盲传过程中易被污染，而自制双相培养基营养成份丰富，固、液相一体易于观察，同时，缩短了传种培养时间，从而达到了快速、准确的目的，从本血培养基检出菌量来看每毫升血中如含有1个左右菌落数，即可检测出阳性结果，敏感性高于一般增菌培养10cfu/ml细菌数。同时本实验中采用了临床上分离出的、由本室保存的菌株，制成模拟菌血标本，较普遍地代表了病原微生物的不同生长特性，自制和进口血培养基培养结果表明自制培养基检出率与进口产品相近，且高于普通肉汤培养基。说明自制血培养基营养丰富，含有氨基营养丰富，含有氨基酸、维生素、生长因子(X、V因子)及辅酶等成份，适宜于各种细菌生长，特别是淋病奈瑟氏菌也能在此培养基生长，说明该培养基可用于脑脊液的培养，具有适于脑膜炎奈瑟氏菌生长的条件，能满足临床上快速、准确之需要。临床运用其阳性检出率为9.7%，除能培养出一般细菌外，还能培养出一些苛养菌，同时，具有成本较低、使用方便、不易受污染等特点，适于基层医院微生物室应用。, 百拇医药