应用α-珠蛋白3′-HVR探针进行小鼠的DNA指纹分析
作者：陈丙波 魏泓 罗刚 牛荣 刘春 唐晓喻 修崇贤
单位：陈丙波 魏泓 罗刚 牛荣 第三军医大学实验动物中心 重庆，400038；刘春 唐晓喻 修崇贤 重庆市公安局刑侦所DNA实验室 重庆，400042
关键词：DNA指纹分析；遗传监测；实验小鼠
第三军医大学学报990208
提要 目的：探讨3′-HVR探针及Southern杂交技术应用于实验小鼠遗传质量监测的可行性。方法：采用人源α-珠蛋白3′-HVR探针，应用ECL试剂盒，以HRP标记进行Southern杂交，以化学发光法进行检测，对5种近交系小鼠(BALB/c、DBA/2、T739、TA1、615)、1种封闭群小鼠(KM)及2种免疫缺陷小鼠(BALB/c-nu/nu及C.B-17SCID)进行DNA指纹分析。结果：其不同近交小鼠的DNA指纹图各异，而同种近交系的不同个体的DNA指纹图相同，封闭群KM小鼠不同个体之间的DNA指纹图存在一定差异。BALB/c-nu/nu小鼠、CB-17SCID小鼠不同个体之间的DNA指纹图相同，并且与BALB/c小鼠的一致。结论：该探针及其Southern杂交技术可用于实验小鼠的遗传质量监测。
, 百拇医药
中图法分类号 Q523
Use of probe α-globin 3'-HVR in fingerprinting in laboratory mice
Chen Bingbo, Liu Chun, Wei Hong, Luo Gang, Niu Rong, Tang Xiaoyu, Xiu Chongxian
(Laboratory Animal Center, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To explore the possibility of using the probe α-globin 3'-HVR and Southern blot hybridization in monitoring genetic quality of laboratory mice. Methods: Fingerprinting of 5 strains of inbred mice (BALB/c, DBA/2, T739, TA1 and 615), 1 closed colony KM mice and 2 immunological deficient mice (BALA/c-nu/nu mice and C.B-17SCID mice) was conducted using a nonisotopically HRP labeled human origin minisatellite probe α-globin 3'-HVR and southern blot hybridization. Results: Typical hypervariable patterns of DNA fingerprint were obtained in inbred mouse strains. The patterns were completely different among the 5 strains of mice and those of the samples from the same strain were completely identical. The patterns obtained from various individuals of closed colony KM mice had some variations. BALA/c-nu/nu mice and C.B-17SCID mice produced the same DNA fingerprint patterns with BALA/c mice. Conclusion: HRP labeled human origin minisatellite α-globin 3'-HVR probe and southern blot hybridization are useful to monitor genetic quality of laboratory mice
, 百拇医药
Key words DNA fingerprinting; genetic monitoring; laboratory mouse
实验动物遗传质量监测是保证实验动物遗传质量的主要途径及方法。常规实验动物遗传质量监测方法主要有：毛色基因检测、下颌骨形态测量、皮肤移植、生化标志分析等，这些方法均是遗传表型监测，不能反映遗传物质本身。分子生物学技术的发展为实验动物遗传质量监测提供了新的直接的监测方法。特别是多位点小卫星探针DNA指纹技术，国际上已越来越多地应用于实验动物的遗传质量监测，但国内在这方面的研究刚刚起步。本研究采用HRP标记多位点人源α-珠蛋白3′-HVR探针和Southern杂交技术，对8种近交系、封闭群及突变系小鼠进行DNA指纹分析，以便建立其遗传监测方法。
1 材料与方法
1.1 动物
选用第三军医大学实验动物中心生产的2月龄、体重约20 g的SPF级BALB/c、615、DBA/2、TA1、T739、C.B-17SCID、BALB/c-nu/nu、KM等品系小鼠各3只，颈椎脱臼法处死，取肺组织备用。
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1.2 基因组DNA的制备
取各品系小鼠肺组织(100 mg左右)，以SDS和蛋白酶K56℃水浴消化5h，以酚、酚∶氯仿∶异戊醇和氯仿∶异戊醇分三步提取DNA；以冰冻无水乙醇沉淀DNA，70%冰冻乙醇洗涤，TE溶解。
1.3 基因组DNA的浓度测定
以3ml 0.4 mol/L NaOH作空白对照，另于装有3ml 0.4 mol/L NaOH的比色杯中加入3μl基因组DNA液，使其稀释1000倍，采用752分光光度计于260 nm和280 nm处分别测定Dλ值，DNA浓度=D260×40 μg/ml×1 000；纯度=D260/D280。
1.4 酶切
以Hae Ⅲ酶酶切12 μgDNA样品，反应体系为60 μl，酶切后以冰冻乙醇进一步沉淀、纯化DNA，加入TE溶解，用于电泳[1，2]。
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1.5 电泳
制做0.6%的25 cm×20 cm的琼脂胶，取20 μlDNA样品和2μl载样缓冲液(0.25%溴酚蓝，0.25%二甲基青蓝，25%FiColl 400)，加入凝胶点样孔中，50V，电泳24 h[3]。
1.6 转膜
采用真空转移法进行。DNA的脱嘌呤、碱变性、中和及转移等过程均在真空转移器中完成。用20×SSC真空转移1h，将电泳分离后凝胶中的DNA片段原位转移至带正电荷的尼龙膜上[4]。
1.7 杂交
采用ECL试剂盒(Enhanced Chemiluminescene, Amersham Life Science公司产品，RPN3000)进行探针标记及检测。ECL试剂盒主要采用HRP进行探针标记，化学发光法进行检测。
, 百拇医药
1.7.1 标记探针 采用α-珠蛋白3′-HVR人源探针(公安部刑侦所提供)放入沸水中5 min，然后立即置入冰水中5 min，再加入等体积的标记试剂HRP和戊二醛，混匀，振荡，置37℃水浴15 min。
1.7.2 杂交 将转膜完毕的尼龙膜正面朝里卷成筒状装入预杂交管中，倒入预杂交液，放入杂交箱中，42℃预杂交1 h，然后倒入标记好的探针，42℃杂交12 h。
1.8 洗膜
取出杂交完毕的膜于干净瓷盘中，用6mol/L尿素、0.5×SSC、0.4%SDS的混合液洗涤2次，每25 min，然后用2×SSC洗涤两次，每次5min[5]。
1.9 显影
采用化学发光法进行显影检测。取出洗完的膜于干净滤纸上吸干，置于调平的水平平台上，将ECL显影液Ⅰ和Ⅱ各10 ml混匀后，倒入膜中，停留2～3min，吸干，用保鲜膜包好，置于暗盒中，在暗室内放好ECL胶片。2h后取出胶片，显影，定影。
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2 结果
从图1可以看出，3'HVR探针在各品系小鼠中均产生了具有多态性的HaeⅢ酶切DNA指纹图谱。不同品系间的DNA指纹图谱存在差异，品系内基本相同。
图1 8种品系小鼠α-珠蛋白3′-HVR探针Southern杂交DNA指纹图
1～3号：TA1小鼠；4～6号：DBA/2小鼠；7～8号：BALB/c-nu/nu裸鼠；9、10号：T739小鼠；11、12号：C.B-17-SCID小鼠；13～15号：BALB/C小鼠；16～18号：KM小鼠；19号：615小鼠。
Fig 1 DNA fingerprint map of Southern hybridization by α-globin 3′-HVR probe for 8 strains of mice
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No.1～3:TA1 mouse; No.4～6: DBA/2 mouse; No.7、8: BALB/c-nu/nu nude mouse; No.9、10: T739 mouse; No.11、12: C.B-17-SCID Immuological deficient mouse; No.13～15: BALB/c mouse; No.16～18: KM mouse; No.19: 615 mouse
3 讨论
不同品系小鼠的基因型不同，同一近交系小鼠的不同个体基因型相同，封闭群小鼠个体间具有一定遗传差异[6]，本实验采用人源α-珠蛋白3′-HVR探针，应用ECL试剂盒，以HRP标记进行Southern杂交，以化学发光法进行检测，其结果表明，近交系小鼠间的DNA指纹图不同，同一近交系不同个体间的DNA指纹图相同，同一封闭群小鼠的个体间的DNA指纹图具有差异，与其不同遗传类别小鼠的基因型变化相符，表明该方法可应用于实验小鼠的遗传质量监测，同时表明所检测的5种近交系小鼠未发生遗传污染或基因突变。
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T细胞缺陷的BALB/c-nu/nu无胸腺裸小鼠、T、B细胞联合免疫缺陷的C.B-17SCID小鼠，与BALB/c小鼠具有相似遗传背景，BALB/c裸小鼠是将nu/nu基因，通过回交导入普通BALB/c小鼠体内所致，而C.B-17SCID小鼠是BALB/c小鼠的同源近交系C.B-17的单个隐性突变基因Scid所致。因此，BALB/c-nu/nu小鼠、C.B-17SCID小鼠与BALB/c小鼠相比较，除突变基因不同外，其遗传背景基本相同[6]。应用α-珠蛋白3′-HVR探针进行检测，未能发现三品系间的DNA指纹差异，说明三品系的遗传背景及基因型基本相同。
人源3′-HVR探针位于人α-珠蛋白基因族3′-端的高变区(3′-Hypervariable region,HVR)，由一系列17bp长的重复序列串联而成，其核心序列为5′-GNGGG (N) ACAG-3′，估计重复次数在70～450之间，使得3′-HVR多态信息量(Polymorphism information content, PIC)高达90%，是人类第16号染色体最重要的遗传标志之一[7]。本实验采用的核心序列探针用于公安系统刑侦检定已有多年[8]。首次将其用于小鼠的DNA指纹分析，实验结果也说明3′-HVR探针同样适用于小鼠的DNA指纹图分析。
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本试验进行了Hae Ⅲ和Hinf Ⅰ两种限制性内切酶的筛选，尽管两种酶均适宜于小鼠DNA指纹分析，但以Hae Ⅲ限制性内切酶为佳，与Kunieda的结果一致[1]。
对于DNA指纹图分析国内外报道多应用32P标记探针，由于放射性同位素有一定危害，实验防护条件要求较严，实验周期长。本实验的ECL(加强化学发光)标记方法为非同位素标记，不需要实验保护，操作方法简便，探针标记20 min可以完成，不需要纯化可直接使用，且能保存很长时间，不仅避免了同位素污染和半衰期短等缺点，灵敏度接近32P标记检测，且谱带比32P标记探针的DNA指纹图更加清楚、图带精细、易判定[7]。
国家自然科学基金资助项目，No.3960007 全军“九五”医药卫生科研基金资助项目，No.96M083 重庆市攻关项目
, http://www.100md.com
作者简介：陈丙波，男，34岁，副教授，硕士
参考文献
1 Kunieda T, Nomura N, Ishizaki R, et al. Identification of inbred rat strains by using DNA fingerprinting method. Lab Anim Sci,1995,43(6):603
2 薄 侃，蔡有余，蓝 翎，等.DNA指纹在近交系小鼠中的应用与研究.遗传，1997，19(增刊)：39
3 Russell R J, Festing M F, Deeny A A, et al. DNA fingerprinting for genetic monitoring of inbred laboratory rats and mice. Lab Anim Sci,1993,43(5):460
, 百拇医药
4 孟安明，齐顺章，丁汝染，等.枫泾猪、香猪和长白猪的DNA指纹图分析.遗传，1995，17(3)：19
5 卢圣栋.现代分子生物学技术.北京：高等教育出版社，1993.198～206
6 魏 泓.医学实验动物学.成都：四川省科学技术出版社，1998.412～416
7 鲁晓宣，茅一萍，张 军，等.中国人α-珠蛋白基因3′-HVR多态分布的研究.遗传，1995，17(3)：13
8 公安部二所编.法医物证检验技术及应用.北京：人民法院出版社，1997.250～308
(收稿：1998-04-16；修回：1998-10-16), http://www.100md.com
单位：陈丙波 魏泓 罗刚 牛荣 第三军医大学实验动物中心 重庆，400038；刘春 唐晓喻 修崇贤 重庆市公安局刑侦所DNA实验室 重庆，400042
关键词：DNA指纹分析；遗传监测；实验小鼠
第三军医大学学报990208
提要 目的：探讨3′-HVR探针及Southern杂交技术应用于实验小鼠遗传质量监测的可行性。方法：采用人源α-珠蛋白3′-HVR探针，应用ECL试剂盒，以HRP标记进行Southern杂交，以化学发光法进行检测，对5种近交系小鼠(BALB/c、DBA/2、T739、TA1、615)、1种封闭群小鼠(KM)及2种免疫缺陷小鼠(BALB/c-nu/nu及C.B-17SCID)进行DNA指纹分析。结果：其不同近交小鼠的DNA指纹图各异，而同种近交系的不同个体的DNA指纹图相同，封闭群KM小鼠不同个体之间的DNA指纹图存在一定差异。BALB/c-nu/nu小鼠、CB-17SCID小鼠不同个体之间的DNA指纹图相同，并且与BALB/c小鼠的一致。结论：该探针及其Southern杂交技术可用于实验小鼠的遗传质量监测。
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中图法分类号 Q523
Use of probe α-globin 3'-HVR in fingerprinting in laboratory mice
Chen Bingbo, Liu Chun, Wei Hong, Luo Gang, Niu Rong, Tang Xiaoyu, Xiu Chongxian
(Laboratory Animal Center, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To explore the possibility of using the probe α-globin 3'-HVR and Southern blot hybridization in monitoring genetic quality of laboratory mice. Methods: Fingerprinting of 5 strains of inbred mice (BALB/c, DBA/2, T739, TA1 and 615), 1 closed colony KM mice and 2 immunological deficient mice (BALA/c-nu/nu mice and C.B-17SCID mice) was conducted using a nonisotopically HRP labeled human origin minisatellite probe α-globin 3'-HVR and southern blot hybridization. Results: Typical hypervariable patterns of DNA fingerprint were obtained in inbred mouse strains. The patterns were completely different among the 5 strains of mice and those of the samples from the same strain were completely identical. The patterns obtained from various individuals of closed colony KM mice had some variations. BALA/c-nu/nu mice and C.B-17SCID mice produced the same DNA fingerprint patterns with BALA/c mice. Conclusion: HRP labeled human origin minisatellite α-globin 3'-HVR probe and southern blot hybridization are useful to monitor genetic quality of laboratory mice
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Key words DNA fingerprinting; genetic monitoring; laboratory mouse
实验动物遗传质量监测是保证实验动物遗传质量的主要途径及方法。常规实验动物遗传质量监测方法主要有：毛色基因检测、下颌骨形态测量、皮肤移植、生化标志分析等，这些方法均是遗传表型监测，不能反映遗传物质本身。分子生物学技术的发展为实验动物遗传质量监测提供了新的直接的监测方法。特别是多位点小卫星探针DNA指纹技术，国际上已越来越多地应用于实验动物的遗传质量监测，但国内在这方面的研究刚刚起步。本研究采用HRP标记多位点人源α-珠蛋白3′-HVR探针和Southern杂交技术，对8种近交系、封闭群及突变系小鼠进行DNA指纹分析，以便建立其遗传监测方法。
1 材料与方法
1.1 动物
选用第三军医大学实验动物中心生产的2月龄、体重约20 g的SPF级BALB/c、615、DBA/2、TA1、T739、C.B-17SCID、BALB/c-nu/nu、KM等品系小鼠各3只，颈椎脱臼法处死，取肺组织备用。
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1.2 基因组DNA的制备
取各品系小鼠肺组织(100 mg左右)，以SDS和蛋白酶K56℃水浴消化5h，以酚、酚∶氯仿∶异戊醇和氯仿∶异戊醇分三步提取DNA；以冰冻无水乙醇沉淀DNA，70%冰冻乙醇洗涤，TE溶解。
1.3 基因组DNA的浓度测定
以3ml 0.4 mol/L NaOH作空白对照，另于装有3ml 0.4 mol/L NaOH的比色杯中加入3μl基因组DNA液，使其稀释1000倍，采用752分光光度计于260 nm和280 nm处分别测定Dλ值，DNA浓度=D260×40 μg/ml×1 000；纯度=D260/D280。
1.4 酶切
以Hae Ⅲ酶酶切12 μgDNA样品，反应体系为60 μl，酶切后以冰冻乙醇进一步沉淀、纯化DNA，加入TE溶解，用于电泳[1，2]。
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1.5 电泳
制做0.6%的25 cm×20 cm的琼脂胶，取20 μlDNA样品和2μl载样缓冲液(0.25%溴酚蓝，0.25%二甲基青蓝，25%FiColl 400)，加入凝胶点样孔中，50V，电泳24 h[3]。
1.6 转膜
采用真空转移法进行。DNA的脱嘌呤、碱变性、中和及转移等过程均在真空转移器中完成。用20×SSC真空转移1h，将电泳分离后凝胶中的DNA片段原位转移至带正电荷的尼龙膜上[4]。
1.7 杂交
采用ECL试剂盒(Enhanced Chemiluminescene, Amersham Life Science公司产品，RPN3000)进行探针标记及检测。ECL试剂盒主要采用HRP进行探针标记，化学发光法进行检测。
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1.7.1 标记探针 采用α-珠蛋白3′-HVR人源探针(公安部刑侦所提供)放入沸水中5 min，然后立即置入冰水中5 min，再加入等体积的标记试剂HRP和戊二醛，混匀，振荡，置37℃水浴15 min。
1.7.2 杂交 将转膜完毕的尼龙膜正面朝里卷成筒状装入预杂交管中，倒入预杂交液，放入杂交箱中，42℃预杂交1 h，然后倒入标记好的探针，42℃杂交12 h。
1.8 洗膜
取出杂交完毕的膜于干净瓷盘中，用6mol/L尿素、0.5×SSC、0.4%SDS的混合液洗涤2次，每25 min，然后用2×SSC洗涤两次，每次5min[5]。
1.9 显影
采用化学发光法进行显影检测。取出洗完的膜于干净滤纸上吸干，置于调平的水平平台上，将ECL显影液Ⅰ和Ⅱ各10 ml混匀后，倒入膜中，停留2～3min，吸干，用保鲜膜包好，置于暗盒中，在暗室内放好ECL胶片。2h后取出胶片，显影，定影。
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2 结果
从图1可以看出，3'HVR探针在各品系小鼠中均产生了具有多态性的HaeⅢ酶切DNA指纹图谱。不同品系间的DNA指纹图谱存在差异，品系内基本相同。
图1 8种品系小鼠α-珠蛋白3′-HVR探针Southern杂交DNA指纹图
1～3号：TA1小鼠；4～6号：DBA/2小鼠；7～8号：BALB/c-nu/nu裸鼠；9、10号：T739小鼠；11、12号：C.B-17-SCID小鼠；13～15号：BALB/C小鼠；16～18号：KM小鼠；19号：615小鼠。
Fig 1 DNA fingerprint map of Southern hybridization by α-globin 3′-HVR probe for 8 strains of mice
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No.1～3:TA1 mouse; No.4～6: DBA/2 mouse; No.7、8: BALB/c-nu/nu nude mouse; No.9、10: T739 mouse; No.11、12: C.B-17-SCID Immuological deficient mouse; No.13～15: BALB/c mouse; No.16～18: KM mouse; No.19: 615 mouse
3 讨论
不同品系小鼠的基因型不同，同一近交系小鼠的不同个体基因型相同，封闭群小鼠个体间具有一定遗传差异[6]，本实验采用人源α-珠蛋白3′-HVR探针，应用ECL试剂盒，以HRP标记进行Southern杂交，以化学发光法进行检测，其结果表明，近交系小鼠间的DNA指纹图不同，同一近交系不同个体间的DNA指纹图相同，同一封闭群小鼠的个体间的DNA指纹图具有差异，与其不同遗传类别小鼠的基因型变化相符，表明该方法可应用于实验小鼠的遗传质量监测，同时表明所检测的5种近交系小鼠未发生遗传污染或基因突变。
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T细胞缺陷的BALB/c-nu/nu无胸腺裸小鼠、T、B细胞联合免疫缺陷的C.B-17SCID小鼠，与BALB/c小鼠具有相似遗传背景，BALB/c裸小鼠是将nu/nu基因，通过回交导入普通BALB/c小鼠体内所致，而C.B-17SCID小鼠是BALB/c小鼠的同源近交系C.B-17的单个隐性突变基因Scid所致。因此，BALB/c-nu/nu小鼠、C.B-17SCID小鼠与BALB/c小鼠相比较，除突变基因不同外，其遗传背景基本相同[6]。应用α-珠蛋白3′-HVR探针进行检测，未能发现三品系间的DNA指纹差异，说明三品系的遗传背景及基因型基本相同。
人源3′-HVR探针位于人α-珠蛋白基因族3′-端的高变区(3′-Hypervariable region,HVR)，由一系列17bp长的重复序列串联而成，其核心序列为5′-GNGGG (N) ACAG-3′，估计重复次数在70～450之间，使得3′-HVR多态信息量(Polymorphism information content, PIC)高达90%，是人类第16号染色体最重要的遗传标志之一[7]。本实验采用的核心序列探针用于公安系统刑侦检定已有多年[8]。首次将其用于小鼠的DNA指纹分析，实验结果也说明3′-HVR探针同样适用于小鼠的DNA指纹图分析。
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本试验进行了Hae Ⅲ和Hinf Ⅰ两种限制性内切酶的筛选，尽管两种酶均适宜于小鼠DNA指纹分析，但以Hae Ⅲ限制性内切酶为佳，与Kunieda的结果一致[1]。
对于DNA指纹图分析国内外报道多应用32P标记探针，由于放射性同位素有一定危害，实验防护条件要求较严，实验周期长。本实验的ECL(加强化学发光)标记方法为非同位素标记，不需要实验保护，操作方法简便，探针标记20 min可以完成，不需要纯化可直接使用，且能保存很长时间，不仅避免了同位素污染和半衰期短等缺点，灵敏度接近32P标记检测，且谱带比32P标记探针的DNA指纹图更加清楚、图带精细、易判定[7]。
国家自然科学基金资助项目，No.3960007 全军“九五”医药卫生科研基金资助项目，No.96M083 重庆市攻关项目
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作者简介：陈丙波，男，34岁，副教授，硕士
参考文献
1 Kunieda T, Nomura N, Ishizaki R, et al. Identification of inbred rat strains by using DNA fingerprinting method. Lab Anim Sci,1995,43(6):603
2 薄 侃，蔡有余，蓝 翎，等.DNA指纹在近交系小鼠中的应用与研究.遗传，1997，19(增刊)：39
3 Russell R J, Festing M F, Deeny A A, et al. DNA fingerprinting for genetic monitoring of inbred laboratory rats and mice. Lab Anim Sci,1993,43(5):460
, 百拇医药
4 孟安明，齐顺章，丁汝染，等.枫泾猪、香猪和长白猪的DNA指纹图分析.遗传，1995，17(3)：19
5 卢圣栋.现代分子生物学技术.北京：高等教育出版社，1993.198～206
6 魏 泓.医学实验动物学.成都：四川省科学技术出版社，1998.412～416
7 鲁晓宣，茅一萍，张 军，等.中国人α-珠蛋白基因3′-HVR多态分布的研究.遗传，1995，17(3)：13
8 公安部二所编.法医物证检验技术及应用.北京：人民法院出版社，1997.250～308
(收稿：1998-04-16；修回：1998-10-16), http://www.100md.com