天疱疮抗体的纯化与鉴定
作者：杨卫兵 刁庆春 叶庆佾
单位：第三军医大学附属西南医院皮肤科 重庆，400038
关键词：天疱疮；抗独特型抗体；亲和层析；IgG亚类
第三军医大学学报990222 The purification and identification of pemphigus antibodies
提要 目的：为纯化天疱疮患者血清中的天疱疮抗体，研究其在天疱疮发病机制中的意义。方法：利用PI-1天疱疮抗独特型抗体，通过亲和层析法纯化了1例天疱疮患者血清中的天疱疮抗体；用间接免疫荧光法(IIF)、SDS-PAGE、免疫双向琼脂扩散试验对纯化的天疱疮抗体进行鉴定。结果：纯化的天疱疮抗体经鉴定为IgG4亚类，分子量约为15×103u，其IIF图像为表皮细胞间均一亮绿的线状荧光。结论：PI-1天疱疮抗独特型单抗特异性地针对于天疱疮抗体IgG4亚类，为进一步对纯化的天疱疮抗体(IgG4亚类)在天疱疮发病机理中的意义打下了基础。
, 百拇医药
中图法分类号 R753.2
天疱疮是一种自身免疫性大疱性皮肤病，患者血清中的IgG4亚类可能是天疱疮的病原性抗体[1]。抗独特型抗体已应用于多种自身免疫性疾病的临床诊断和实验性治疗[2]，但在天疱疮方面的应用，国内外尚未见有关文献报道。本研究利用我科建立的PI-1天疱疮抗独特型单克隆抗体[3]，对患者血清中的天疱疮抗体，进行纯化和鉴定，期望能有助于今后对天疱疮发病机制的研究。
1 材料与方法
1.1 材料
天疱疮患者血清：患者女性，16岁，经临床、病理和直接免疫荧光(DIF)、间接免疫荧光(IIF)确诊为活动期寻常型天疱疮(PV)。收集其血清备用。
PI-1杂瘤细胞株：本科研制，于液氮冻存。
, 百拇医药
主要试剂：RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司；HRP标记兔抗鼠IgG，华美生物制品公司；CNBr-Activated Sepharose 4B,Pharmacia公司；低分子量蛋白电泳标准品，军事医学科学院；羊抗人IgG荧光抗体，华美生物制品公司；鼠抗人IgG各亚类标准品，重庆医科大学。
1.2 方法
1.2.1 PI-1天疱疮抗独特型单克隆抗体的生产及其效价的检测 取本科研制的，经液氮冻存的PI-1杂交瘤细胞株1支，于37℃水浴快速复温，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液按常规进行传代培养。取8～12周龄的Balb/c小鼠，腹腔内注入(1～2)×106个细胞/ml的处于对数生长期的PI-1杂交瘤细胞，待小鼠腹部胀大后，收集腹水。
分别以天疱疮患者血清和正常人血清(均以0.02 mol/L pH7.4 PBS稀释100倍)包被酶联板孔，检测PI-1单抗的效价。阴性对照孔一抗为SP2/0瘤细胞小鼠腹水(1∶500稀释)，阳性对照孔一抗为小鼠免疫血清(即建立PI-1杂交瘤细胞时的小鼠免疫血清，以1∶10 000稀释)。
, 百拇医药
1.2.2 亲和层析法纯化天疱疮抗体 参照产品说明及有关资料。先将PI-1单抗和天疱疮患者血清分别以0.22 μm的微孔滤膜过滤，以除去溶液中的颗粒性物质；以1 mmol/L HCl(pH2～3)溶液激活CNBr-Activated Sepharose 4B的活性基团；将Sepharose 4B与PI1天疱疮抗独特型单抗混匀，于室温下平缓搅拌2 h，使二者充分偶联，于布氏漏斗上用大量0.1 mol/L NaHCO3、0.5 mol/L NaCl缓冲液(pH8.3)反复过滤冲洗，至流出液于波长280 nm的D492值≤0.02，以充分洗脱未偶联的蛋白质；将偶联后的Sepharose 4B置于1 mol/L乙醇胺溶液(pH8.0)中，于室温中静置2 h，封闭Sepharose 4B中未偶联蛋白的活性基团；然后先后用0.1 mol/L醋酸钠(含0.5 mol/L NaCl,pH4.0)、0.5 mol/L Tris-HCl(含0.5 mol/L NaCl,pH8.0)缓冲液于布氏漏斗上过滤冲洗，以进一步洗脱未偶联的蛋白质和封闭剩余的活性基团，如此反复处理3遍；将以上处理后的Sepharose 4B装入层析柱中，用0.1 mol/L NaHCO3、0.5 mol/L NaCl缓冲液(pH8.3)缓冲液进行平衡；加入天疱疮患者血清于层析柱中，多次少量上柱，上柱完毕后于室温保持2 h，使天疱疮患者血清与PI-1抗独特型单抗充分反应；用0.1 mol/L NaHCO3、0.5 mol/L NaCl缓冲液(pH8.3)缓慢洗柱，至流出液于波长280 nm的D≤0.02；然后用3 mol/L硫氰酸钾溶液洗脱，当流出液于280 nm的D值出现峰值时，收集洗脱液；合并洗脱液装入透析袋中，以生理盐水透析平衡，浓缩后用Lowry法检测蛋白浓度。层析柱可反复使用多次。
, 百拇医药
1.2.3 纯化天疱疮抗体的鉴定 ①SDS-PAGE：浓缩胶和分离胶浓并分别为5%和12%；采用垂直板电泳槽对2批亲和层析法纯化的天疱疮抗体进行电泳，浓缩胶中电压为80V，分离胶中电压为150V，电泳完毕后用银盐对凝胶进行染色。蛋白标准品的分子量分别为94.7×103u,66.2×103u,43.0×103u,31.0×103u,20.1×103u,14.4×103u；②间接免疫荧光(IIF)检测：取环切后的正常人包皮，作冰冻切片，以此为底物；一抗为亲和层析法纯化的天疱疮抗体。阴性对照和阳性对照的一抗分别为正常人和天疱疮患者血清；③免疫双向琼脂扩散试验：以1.5%琼脂加热后制板，其孔径为2 mm，孔距为3～5 mm，于中孔加入纯化的天疱疮抗体，周围各孔分别加入各抗体亚类鉴定标准试剂。于37℃湿盒中扩散24 h，观察抗原抗体沉淀线的位置，确定纯化天疱疮抗体的亚类。
2 结果
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2.1 PI-1单抗的生产及其检测
液氮冻存的PI-1杂交瘤细胞复苏后，于Balb/c小鼠腹腔中分泌抗体，用间接ELISA法测定抗体的效价为1∶16000；而SP2/0瘤细胞腹水1∶500稀释为阴性(D492值为0.01～0.05)。以正常人血清包被酶联板，PI-1单抗与之不反应(D492值为0.07～0.14)。
2.2 天疱疮抗体的纯化
PI-1天疱疮抗独特型单抗与CNBr-Activated Sepharose 4B偶联，亲和层析法纯化天疱疮患者血清中的PI-1单抗特异性的天疱疮抗体，Lowry法测得纯化的天疱疮抗体浓度为0.69 mg/ml，稀释为0.5 mg/ml。
2.3 纯化天疱疮抗体的鉴定
, 百拇医药 亲和层析法纯化的2批天疱疮抗体经SDS-PAGE后，用硝酸银对凝胶进行染色，结果均在分子量约为50×103u、27×103u处各得一条清晰的染色带，见图1，纯化的天疱疮抗体经双向琼脂免疫扩散试验，可见在IgG4处有一清晰的沉淀线，见图2，说明了纯化的天疱疮抗体为IgG4亚类；纯化天疱疮抗体的IIF图像为表皮细胞间有均一亮绿的线状荧光，天疱疮患者血清的IIF图像也为表皮细胞间的线状荧光，而这种图像以正常人血清检测为阴性。
图1 纯化PAb的SDS-PAGE
图2 纯化天疱疮抗体的IgG亚类测定
3 讨论
, 百拇医药
天疱疮抗原位于桥粒区，是一类桥粒性钙依赖性细胞粘附分子，寻常型天疱疮(PV)和落叶型天疱疮(PF)的抗原分别为Dsg1、Dsg3，二者介导细胞的粘附功能，天疱疮是一种抗钙粘附素的自身免疫性疾病[4]。天疱疮抗体成分单一，主要为IgG。本研究首次利用PI-1天疱疮抗独特型单克隆抗体，特异性地将“纯”的天疱疮抗体从天疱疮患者的血清中纯化出来。
对纯化天疱疮抗体的鉴定结果表明：通过亲和层析法纯化的天疱疮抗体，经SDS-PACE后，与分子量标准品相对照，在分子量约为50×103u和27×103u处各得一条清晰的蛋白染色带，二者分别为纯化天疱疮抗体的重链和轻链，纯化天疱疮抗体的分子量约为154×103u，达到了电泳纯；天疱疮患者血清作用于复层鳞状上皮棘层细胞间的天疱疮抗原，其IIF图像为棘层细胞间的线状荧光，本研究纯化的天疱疮抗体的IIF图像亦为表皮细胞间均一亮绿的线状荧光，且后者的荧光图像更为清晰、特异性更强。
, 百拇医药
研究表明[5，6]，天疱疮抗体IgG4亚类可能是天疱疮的致病性抗体，但天疱疮抗体各亚类在天疱疮发病机制中的意义尚未清楚。本研究利用天疱疮的抗独特型单抗纯化的天疱疮抗体，测定其亚类为IgG4，符合上述结果，说明了PI-1天疱疮抗独特型单抗是特异性地针对于天疱疮抗体IgG4，但本研究纯化的天疱疮抗体IgG4亚类是否导致棘层细胞松解有待实验证明。
Amagai等[7]分别用PV和PF抗原Dsg3和Dsg1的重组蛋白PVIg、PFIg吸附PV患者血清中的天疱疮抗体后，发现：用PVIg吸附后的PV血清只与表皮细胞的较上层反应；而PFIg吸附后的PV血清则只与表皮细胞的较低层反应，且正好处于水疱发生位置。因此指出，针对于Dsg3的抗体可能是PV的致病性抗体，而针对于Dsg1的抗体在PV则是非致病性的。本研究纯化的PV患者血清中的天疱疮抗体为IgG4亚类，但IIF表明，这些IgG4亚类天疱疮抗体与表皮细胞全层反应。因此针对于Dsg3的天疱疮抗体与IgG4亚类间有何联系，有待于进一步研究。
, 百拇医药
本研究利用PI-1天疱疮抗独特型单抗，特异性地纯化了天疱疮患者血清中的天疱疮抗体，进一步证明纯化的天疱疮抗体为IgG4，说明PI-1单抗特异性地针对于天疱疮抗体IgG4亚类，为进一步研究IgG4在天疱疮发病机制中的意义提供了一种较好的手段。
作者简介：杨卫兵，男，30岁，主治医师，医学硕士，现在桂林第181医院皮肤科 桂林，541002
参考文献
1 Bhol K, Natarakan K, Nagarwalla N, et al. Correlation of peptide specificity and IgG subclass with pathogenic and nonpathogenic autoantibodies in pemphigus:a model for autoimmunity. Proc Natl Acda Sci USA,1995,92(11):5239
, http://www.100md.com
2 邓军(综述).抗独特型抗体在自身免疫性疾病中的研究进展.国外医学：皮肤性病学分册，1996，22(4)：213
3 张春明，刁庆春，叶庆佾.天疱疮抗独特型单克隆抗体的研制和鉴定.中华皮肤科杂志，1996，29(4)：229
4 Amagi M. Adhesion molecules I: Keratinocyte-keratinocyte interaction cadherins and pemphigus. J Invest Dermatol,1995,104(1):146
5 Tremeau M C, Oksman F, Bazex J. Immunoglobulin G subclass distribution of anti-intercellular aubstance antibodies in pemphigus. Ann Dermatol Venerol,1995,122(6～7)：409
, 百拇医药
6 Emery D J, Diaz L A, Fairley J A, et al. Pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus autoantibodies react with the extracellular domain of desmoglein-1. J Invest Dermatol,1995,104(3):323
7 Amagai M, Koch P J, Nishikawa T. Pemphigus vulgaris antigen(desmoglein 3) is localized in the lower epidermis,the site of blister formation inpatients. J Invest Dermatol,1996,106(2):351
(收稿：1998-01-08；修回：1998-11-06), 百拇医药
单位：第三军医大学附属西南医院皮肤科 重庆，400038
关键词：天疱疮；抗独特型抗体；亲和层析；IgG亚类
第三军医大学学报990222 The purification and identification of pemphigus antibodies
提要 目的：为纯化天疱疮患者血清中的天疱疮抗体，研究其在天疱疮发病机制中的意义。方法：利用PI-1天疱疮抗独特型抗体，通过亲和层析法纯化了1例天疱疮患者血清中的天疱疮抗体；用间接免疫荧光法(IIF)、SDS-PAGE、免疫双向琼脂扩散试验对纯化的天疱疮抗体进行鉴定。结果：纯化的天疱疮抗体经鉴定为IgG4亚类，分子量约为15×103u，其IIF图像为表皮细胞间均一亮绿的线状荧光。结论：PI-1天疱疮抗独特型单抗特异性地针对于天疱疮抗体IgG4亚类，为进一步对纯化的天疱疮抗体(IgG4亚类)在天疱疮发病机理中的意义打下了基础。
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中图法分类号 R753.2
天疱疮是一种自身免疫性大疱性皮肤病，患者血清中的IgG4亚类可能是天疱疮的病原性抗体[1]。抗独特型抗体已应用于多种自身免疫性疾病的临床诊断和实验性治疗[2]，但在天疱疮方面的应用，国内外尚未见有关文献报道。本研究利用我科建立的PI-1天疱疮抗独特型单克隆抗体[3]，对患者血清中的天疱疮抗体，进行纯化和鉴定，期望能有助于今后对天疱疮发病机制的研究。
1 材料与方法
1.1 材料
天疱疮患者血清：患者女性，16岁，经临床、病理和直接免疫荧光(DIF)、间接免疫荧光(IIF)确诊为活动期寻常型天疱疮(PV)。收集其血清备用。
PI-1杂瘤细胞株：本科研制，于液氮冻存。
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主要试剂：RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司；HRP标记兔抗鼠IgG，华美生物制品公司；CNBr-Activated Sepharose 4B,Pharmacia公司；低分子量蛋白电泳标准品，军事医学科学院；羊抗人IgG荧光抗体，华美生物制品公司；鼠抗人IgG各亚类标准品，重庆医科大学。
1.2 方法
1.2.1 PI-1天疱疮抗独特型单克隆抗体的生产及其效价的检测 取本科研制的，经液氮冻存的PI-1杂交瘤细胞株1支，于37℃水浴快速复温，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液按常规进行传代培养。取8～12周龄的Balb/c小鼠，腹腔内注入(1～2)×106个细胞/ml的处于对数生长期的PI-1杂交瘤细胞，待小鼠腹部胀大后，收集腹水。
分别以天疱疮患者血清和正常人血清(均以0.02 mol/L pH7.4 PBS稀释100倍)包被酶联板孔，检测PI-1单抗的效价。阴性对照孔一抗为SP2/0瘤细胞小鼠腹水(1∶500稀释)，阳性对照孔一抗为小鼠免疫血清(即建立PI-1杂交瘤细胞时的小鼠免疫血清，以1∶10 000稀释)。
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1.2.2 亲和层析法纯化天疱疮抗体 参照产品说明及有关资料。先将PI-1单抗和天疱疮患者血清分别以0.22 μm的微孔滤膜过滤，以除去溶液中的颗粒性物质；以1 mmol/L HCl(pH2～3)溶液激活CNBr-Activated Sepharose 4B的活性基团；将Sepharose 4B与PI1天疱疮抗独特型单抗混匀，于室温下平缓搅拌2 h，使二者充分偶联，于布氏漏斗上用大量0.1 mol/L NaHCO3、0.5 mol/L NaCl缓冲液(pH8.3)反复过滤冲洗，至流出液于波长280 nm的D492值≤0.02，以充分洗脱未偶联的蛋白质；将偶联后的Sepharose 4B置于1 mol/L乙醇胺溶液(pH8.0)中，于室温中静置2 h，封闭Sepharose 4B中未偶联蛋白的活性基团；然后先后用0.1 mol/L醋酸钠(含0.5 mol/L NaCl,pH4.0)、0.5 mol/L Tris-HCl(含0.5 mol/L NaCl,pH8.0)缓冲液于布氏漏斗上过滤冲洗，以进一步洗脱未偶联的蛋白质和封闭剩余的活性基团，如此反复处理3遍；将以上处理后的Sepharose 4B装入层析柱中，用0.1 mol/L NaHCO3、0.5 mol/L NaCl缓冲液(pH8.3)缓冲液进行平衡；加入天疱疮患者血清于层析柱中，多次少量上柱，上柱完毕后于室温保持2 h，使天疱疮患者血清与PI-1抗独特型单抗充分反应；用0.1 mol/L NaHCO3、0.5 mol/L NaCl缓冲液(pH8.3)缓慢洗柱，至流出液于波长280 nm的D≤0.02；然后用3 mol/L硫氰酸钾溶液洗脱，当流出液于280 nm的D值出现峰值时，收集洗脱液；合并洗脱液装入透析袋中，以生理盐水透析平衡，浓缩后用Lowry法检测蛋白浓度。层析柱可反复使用多次。
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1.2.3 纯化天疱疮抗体的鉴定 ①SDS-PAGE：浓缩胶和分离胶浓并分别为5%和12%；采用垂直板电泳槽对2批亲和层析法纯化的天疱疮抗体进行电泳，浓缩胶中电压为80V，分离胶中电压为150V，电泳完毕后用银盐对凝胶进行染色。蛋白标准品的分子量分别为94.7×103u,66.2×103u,43.0×103u,31.0×103u,20.1×103u,14.4×103u；②间接免疫荧光(IIF)检测：取环切后的正常人包皮，作冰冻切片，以此为底物；一抗为亲和层析法纯化的天疱疮抗体。阴性对照和阳性对照的一抗分别为正常人和天疱疮患者血清；③免疫双向琼脂扩散试验：以1.5%琼脂加热后制板，其孔径为2 mm，孔距为3～5 mm，于中孔加入纯化的天疱疮抗体，周围各孔分别加入各抗体亚类鉴定标准试剂。于37℃湿盒中扩散24 h，观察抗原抗体沉淀线的位置，确定纯化天疱疮抗体的亚类。
2 结果
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2.1 PI-1单抗的生产及其检测
液氮冻存的PI-1杂交瘤细胞复苏后，于Balb/c小鼠腹腔中分泌抗体，用间接ELISA法测定抗体的效价为1∶16000；而SP2/0瘤细胞腹水1∶500稀释为阴性(D492值为0.01～0.05)。以正常人血清包被酶联板，PI-1单抗与之不反应(D492值为0.07～0.14)。
2.2 天疱疮抗体的纯化
PI-1天疱疮抗独特型单抗与CNBr-Activated Sepharose 4B偶联，亲和层析法纯化天疱疮患者血清中的PI-1单抗特异性的天疱疮抗体，Lowry法测得纯化的天疱疮抗体浓度为0.69 mg/ml，稀释为0.5 mg/ml。
2.3 纯化天疱疮抗体的鉴定
, 百拇医药 亲和层析法纯化的2批天疱疮抗体经SDS-PAGE后，用硝酸银对凝胶进行染色，结果均在分子量约为50×103u、27×103u处各得一条清晰的染色带，见图1，纯化的天疱疮抗体经双向琼脂免疫扩散试验，可见在IgG4处有一清晰的沉淀线，见图2，说明了纯化的天疱疮抗体为IgG4亚类；纯化天疱疮抗体的IIF图像为表皮细胞间有均一亮绿的线状荧光，天疱疮患者血清的IIF图像也为表皮细胞间的线状荧光，而这种图像以正常人血清检测为阴性。
图1 纯化PAb的SDS-PAGE
图2 纯化天疱疮抗体的IgG亚类测定
3 讨论
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天疱疮抗原位于桥粒区，是一类桥粒性钙依赖性细胞粘附分子，寻常型天疱疮(PV)和落叶型天疱疮(PF)的抗原分别为Dsg1、Dsg3，二者介导细胞的粘附功能，天疱疮是一种抗钙粘附素的自身免疫性疾病[4]。天疱疮抗体成分单一，主要为IgG。本研究首次利用PI-1天疱疮抗独特型单克隆抗体，特异性地将“纯”的天疱疮抗体从天疱疮患者的血清中纯化出来。
对纯化天疱疮抗体的鉴定结果表明：通过亲和层析法纯化的天疱疮抗体，经SDS-PACE后，与分子量标准品相对照，在分子量约为50×103u和27×103u处各得一条清晰的蛋白染色带，二者分别为纯化天疱疮抗体的重链和轻链，纯化天疱疮抗体的分子量约为154×103u，达到了电泳纯；天疱疮患者血清作用于复层鳞状上皮棘层细胞间的天疱疮抗原，其IIF图像为棘层细胞间的线状荧光，本研究纯化的天疱疮抗体的IIF图像亦为表皮细胞间均一亮绿的线状荧光，且后者的荧光图像更为清晰、特异性更强。
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研究表明[5，6]，天疱疮抗体IgG4亚类可能是天疱疮的致病性抗体，但天疱疮抗体各亚类在天疱疮发病机制中的意义尚未清楚。本研究利用天疱疮的抗独特型单抗纯化的天疱疮抗体，测定其亚类为IgG4，符合上述结果，说明了PI-1天疱疮抗独特型单抗是特异性地针对于天疱疮抗体IgG4，但本研究纯化的天疱疮抗体IgG4亚类是否导致棘层细胞松解有待实验证明。
Amagai等[7]分别用PV和PF抗原Dsg3和Dsg1的重组蛋白PVIg、PFIg吸附PV患者血清中的天疱疮抗体后，发现：用PVIg吸附后的PV血清只与表皮细胞的较上层反应；而PFIg吸附后的PV血清则只与表皮细胞的较低层反应，且正好处于水疱发生位置。因此指出，针对于Dsg3的抗体可能是PV的致病性抗体，而针对于Dsg1的抗体在PV则是非致病性的。本研究纯化的PV患者血清中的天疱疮抗体为IgG4亚类，但IIF表明，这些IgG4亚类天疱疮抗体与表皮细胞全层反应。因此针对于Dsg3的天疱疮抗体与IgG4亚类间有何联系，有待于进一步研究。
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本研究利用PI-1天疱疮抗独特型单抗，特异性地纯化了天疱疮患者血清中的天疱疮抗体，进一步证明纯化的天疱疮抗体为IgG4，说明PI-1单抗特异性地针对于天疱疮抗体IgG4亚类，为进一步研究IgG4在天疱疮发病机制中的意义提供了一种较好的手段。
作者简介：杨卫兵，男，30岁，主治医师，医学硕士，现在桂林第181医院皮肤科 桂林，541002
参考文献
1 Bhol K, Natarakan K, Nagarwalla N, et al. Correlation of peptide specificity and IgG subclass with pathogenic and nonpathogenic autoantibodies in pemphigus:a model for autoimmunity. Proc Natl Acda Sci USA,1995,92(11):5239
, http://www.100md.com
2 邓军(综述).抗独特型抗体在自身免疫性疾病中的研究进展.国外医学：皮肤性病学分册，1996，22(4)：213
3 张春明，刁庆春，叶庆佾.天疱疮抗独特型单克隆抗体的研制和鉴定.中华皮肤科杂志，1996，29(4)：229
4 Amagi M. Adhesion molecules I: Keratinocyte-keratinocyte interaction cadherins and pemphigus. J Invest Dermatol,1995,104(1):146
5 Tremeau M C, Oksman F, Bazex J. Immunoglobulin G subclass distribution of anti-intercellular aubstance antibodies in pemphigus. Ann Dermatol Venerol,1995,122(6～7)：409
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6 Emery D J, Diaz L A, Fairley J A, et al. Pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus autoantibodies react with the extracellular domain of desmoglein-1. J Invest Dermatol,1995,104(3):323
7 Amagai M, Koch P J, Nishikawa T. Pemphigus vulgaris antigen(desmoglein 3) is localized in the lower epidermis,the site of blister formation inpatients. J Invest Dermatol,1996,106(2):351
(收稿：1998-01-08；修回：1998-11-06), 百拇医药