一种改良幽门螺杆菌液体培养方法
作者：郭刚 邹全明 张卫军 解庆华
单位：第三军医大学医学检验系临床微生物学教研室 重庆，400038
关键词：幽门螺杆菌；液体培养
第三军医大学学报990217 An improved culture method of Helicobacter pylori in liquid media
提要 目的：探索一种简便的液体培养方法培养幽门螺杆菌(Hp)。方法：采用组织培养瓶，装少量含有10%小牛血清、0.5%淀粉、10 mg/L万古霉素和2 500 U/L多粘菌素B的脑心浸液肉汤，在厌氧罐中通过抽气换气建立微需氧环境，37℃振荡培养，平板菌落计数法检测生长情况。结果：培养24～48 h，液体中活菌水平超过108CFU/ml，涂片染色细菌形态典型。结论：此Hp液体培养方法简便可行，细菌生长良好，能满足对Hp的毒力因子、菌体成分的研究需要。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R446.5
目前幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)已被公认为是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，并且与胃癌的发生密切相关[1]。Hp的检测技术发展很快，但是Hp的液体培养问题一直未彻底解决。虽然国外报道了几种方法用于Hp的液体培养[2，3]，但操作复杂，国内未见该方面的报道。为此，我们在国外报道方法的基础上进行改良，建立了一种生长良好且简便实用的Hp液体培养方法。
1 材料与方法
1.1 菌种
幽门螺杆菌Hp 971004、Hp 980403及Hp 980406株均由我室从临床胃病患者的胃镜活检组织分离培养所得，经染色、脲酶试验以及PCR鉴定，液氮保存。胃镜标本来自我校附属医院胃镜室。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 Hp的固体培养 菌株分别接种于脑心浸液血琼脂平板，培养基含TMP 5 mg/L，万古霉素10 mg/L，多粘菌素B2500 U/L，接种后置玻璃厌氧罐，采用抽气换气法建立微需氧环境(10%CO2，5%O2，5%H2以及80%N2)，37℃孵箱培养。
1.2.2 液体培养及检测 将已培养48 h的Hp平板取出刮取菌苔，混悬于无菌生理盐水，以麦氏标准比浊管第一管为标准配成浓度3×108/ml的菌悬液，迅速取10 μl转种于装有10 ml液体培养基(脑心浸液肉汤，含10%小牛血清、0.5%淀粉以及100 mg/L的万古霉素和2 500 U/L的多粘菌素B)的100 ml组织培养瓶，轻微塞上棉塞，水平放入厌氧罐并抽气换气建立微需氧环境，然后将罐子放入盖子稍经改良的恒温振荡培养箱(THZ-C，江苏太仓实验设备厂)，37℃振荡培养(100 r/min)，每天开罐抽气换气，并涂片行革兰氏染色镜检以及采用平板菌落计数法[4]检测细菌活菌数，监测生长情况。
, 百拇医药
2 结果
三株细菌均在此液体培养基中生长良好，其中Hp 971004和Hp 980406两株经24 h的振荡培养即已达到较高活菌浓度(>108CFU/ml)，Hp 980403株经48 h培养活菌浓度也达到此水平，见图1。此时涂片染色见细菌形态典型，呈螺杆状，偶见长条细丝状。活菌水平维持2～3 d后开始下降，涂片染色见部分菌体形态不典型，着色较淡，有革兰氏阴性球形体出现，见图2。随着培养天数的增加活菌数的减少，球形体数量开始增多。
图1 三株幽门螺杆菌在脑心浸液肉汤中的生长曲线
, 百拇医药 图2 幽门螺杆菌液体培养细菌形态 (革兰氏染色×1 000)
a:培养2 d后的细菌形态典型，呈螺杆状；b:培养4 d后的细菌着色淡，形态不典型，有球形体出现
3 讨论
Hp的分离培养方法已非常成熟，但由于其苛刻的气体条件而使其液体培养受到了很大限制。我们综合国外文献报道的方法和我们实验室的工作经验建立的这一培养方法充分体现气液接触面大的特点，将小量液体培养基装入组织培养瓶，水平放入微氧气罐，使液体表面积大增，再经振荡，气体能充分弥散于液体中，较好地促进Hp的生长。国外资料报道几种液体培养基(如布氏肉汤、哥伦比亚肉汤、MH肉汤以及脑心浸液肉汤)均能满足Hp的生长条件，但以脑心浸液肉汤加上小牛血清生长最好[5，6]，这与我们的结果一致(资料待发表)。此外，加入0.5%的淀粉能有效吸附细菌生长过程中的代谢毒性产物，有利于Hp的生长。对Hp液体培养的另一制约因素是污染。我们在肉汤中按固体培养基中抗生素的浓度加入万古霉素和多粘菌素B，较好地控制了污染的发生，未对Hp的生长造成影响。
, 百拇医药
从培养的第4天开始，液体中活菌数开始下降，涂片染色观察到随着活菌数的减少，Hp形态也发生着改变。由典型的纤细螺杆状向球形状转变，这可能是由于代谢产物的堆积和营养成份的消耗造成生存环境的恶化所致。
近几年，Hp的疫苗已成为研究的热点，而各种毒力因子、菌体成份及免疫原的制备均需要通过液体培养Hp来获得。本方法尚局限于小量培养，要进行大批量Hp液体发酵培养尚需进一步的摸索和完善。
(感谢新桥医院消化科张朋彬博士在收集标本中所提供的大力帮助!)
国家重点科技攻关计划项目，NO.96-901-01-54
作者简介：郭刚，男，29岁，硕士
参考文献
1 范学工，夏华向.幽门螺杆菌感染——基础与临床.长沙：湖南科学技术出版社，1997.19～25
, 百拇医药
2 Xia H X, English L, Leane C T, et al. Enhanced cultivation of Helicobacter pylori in liquid media. J Clin Pathol,1993,46(8):750
3 Deshpande M, Calenoff E, Daniels L, et al. Rapid large-scale growth of Helicobacter pylori in flasks and fermentors. Appl Environ Microbiol,1995,61(6):2431
4 Norris J R. Methods on Microbilogy. London: Academic Press,1969.611～628
5 Lin Y L, Lee N, Chan E C, et al. Determination of optimal liquid medium for enzyme expression by Helicobactor pylori. J Clin Pathol,1996,49(4):818
6 Shahamat M, Mai UEH, Yamamoto H, et al. Evaluation of liquid media for growth of Helicobacter pylori. J Clin Microbiol,1991,29(12):2835
(收稿：1998-06-23；修回：1998-12-09), 百拇医药
单位：第三军医大学医学检验系临床微生物学教研室 重庆，400038
关键词：幽门螺杆菌；液体培养
第三军医大学学报990217 An improved culture method of Helicobacter pylori in liquid media
提要 目的：探索一种简便的液体培养方法培养幽门螺杆菌(Hp)。方法：采用组织培养瓶，装少量含有10%小牛血清、0.5%淀粉、10 mg/L万古霉素和2 500 U/L多粘菌素B的脑心浸液肉汤，在厌氧罐中通过抽气换气建立微需氧环境，37℃振荡培养，平板菌落计数法检测生长情况。结果：培养24～48 h，液体中活菌水平超过108CFU/ml，涂片染色细菌形态典型。结论：此Hp液体培养方法简便可行，细菌生长良好，能满足对Hp的毒力因子、菌体成分的研究需要。
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中图法分类号 R446.5
目前幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)已被公认为是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，并且与胃癌的发生密切相关[1]。Hp的检测技术发展很快，但是Hp的液体培养问题一直未彻底解决。虽然国外报道了几种方法用于Hp的液体培养[2，3]，但操作复杂，国内未见该方面的报道。为此，我们在国外报道方法的基础上进行改良，建立了一种生长良好且简便实用的Hp液体培养方法。
1 材料与方法
1.1 菌种
幽门螺杆菌Hp 971004、Hp 980403及Hp 980406株均由我室从临床胃病患者的胃镜活检组织分离培养所得，经染色、脲酶试验以及PCR鉴定，液氮保存。胃镜标本来自我校附属医院胃镜室。
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1.2 方法
1.2.1 Hp的固体培养 菌株分别接种于脑心浸液血琼脂平板，培养基含TMP 5 mg/L，万古霉素10 mg/L，多粘菌素B2500 U/L，接种后置玻璃厌氧罐，采用抽气换气法建立微需氧环境(10%CO2，5%O2，5%H2以及80%N2)，37℃孵箱培养。
1.2.2 液体培养及检测 将已培养48 h的Hp平板取出刮取菌苔，混悬于无菌生理盐水，以麦氏标准比浊管第一管为标准配成浓度3×108/ml的菌悬液，迅速取10 μl转种于装有10 ml液体培养基(脑心浸液肉汤，含10%小牛血清、0.5%淀粉以及100 mg/L的万古霉素和2 500 U/L的多粘菌素B)的100 ml组织培养瓶，轻微塞上棉塞，水平放入厌氧罐并抽气换气建立微需氧环境，然后将罐子放入盖子稍经改良的恒温振荡培养箱(THZ-C，江苏太仓实验设备厂)，37℃振荡培养(100 r/min)，每天开罐抽气换气，并涂片行革兰氏染色镜检以及采用平板菌落计数法[4]检测细菌活菌数，监测生长情况。
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2 结果
三株细菌均在此液体培养基中生长良好，其中Hp 971004和Hp 980406两株经24 h的振荡培养即已达到较高活菌浓度(>108CFU/ml)，Hp 980403株经48 h培养活菌浓度也达到此水平，见图1。此时涂片染色见细菌形态典型，呈螺杆状，偶见长条细丝状。活菌水平维持2～3 d后开始下降，涂片染色见部分菌体形态不典型，着色较淡，有革兰氏阴性球形体出现，见图2。随着培养天数的增加活菌数的减少，球形体数量开始增多。
图1 三株幽门螺杆菌在脑心浸液肉汤中的生长曲线
, 百拇医药 图2 幽门螺杆菌液体培养细菌形态 (革兰氏染色×1 000)
a:培养2 d后的细菌形态典型，呈螺杆状；b:培养4 d后的细菌着色淡，形态不典型，有球形体出现
3 讨论
Hp的分离培养方法已非常成熟，但由于其苛刻的气体条件而使其液体培养受到了很大限制。我们综合国外文献报道的方法和我们实验室的工作经验建立的这一培养方法充分体现气液接触面大的特点，将小量液体培养基装入组织培养瓶，水平放入微氧气罐，使液体表面积大增，再经振荡，气体能充分弥散于液体中，较好地促进Hp的生长。国外资料报道几种液体培养基(如布氏肉汤、哥伦比亚肉汤、MH肉汤以及脑心浸液肉汤)均能满足Hp的生长条件，但以脑心浸液肉汤加上小牛血清生长最好[5，6]，这与我们的结果一致(资料待发表)。此外，加入0.5%的淀粉能有效吸附细菌生长过程中的代谢毒性产物，有利于Hp的生长。对Hp液体培养的另一制约因素是污染。我们在肉汤中按固体培养基中抗生素的浓度加入万古霉素和多粘菌素B，较好地控制了污染的发生，未对Hp的生长造成影响。
, 百拇医药
从培养的第4天开始，液体中活菌数开始下降，涂片染色观察到随着活菌数的减少，Hp形态也发生着改变。由典型的纤细螺杆状向球形状转变，这可能是由于代谢产物的堆积和营养成份的消耗造成生存环境的恶化所致。
近几年，Hp的疫苗已成为研究的热点，而各种毒力因子、菌体成份及免疫原的制备均需要通过液体培养Hp来获得。本方法尚局限于小量培养，要进行大批量Hp液体发酵培养尚需进一步的摸索和完善。
(感谢新桥医院消化科张朋彬博士在收集标本中所提供的大力帮助!)
国家重点科技攻关计划项目，NO.96-901-01-54
作者简介：郭刚，男，29岁，硕士
参考文献
1 范学工，夏华向.幽门螺杆菌感染——基础与临床.长沙：湖南科学技术出版社，1997.19～25
, 百拇医药
2 Xia H X, English L, Leane C T, et al. Enhanced cultivation of Helicobacter pylori in liquid media. J Clin Pathol,1993,46(8):750
3 Deshpande M, Calenoff E, Daniels L, et al. Rapid large-scale growth of Helicobacter pylori in flasks and fermentors. Appl Environ Microbiol,1995,61(6):2431
4 Norris J R. Methods on Microbilogy. London: Academic Press,1969.611～628
5 Lin Y L, Lee N, Chan E C, et al. Determination of optimal liquid medium for enzyme expression by Helicobactor pylori. J Clin Pathol,1996,49(4):818
6 Shahamat M, Mai UEH, Yamamoto H, et al. Evaluation of liquid media for growth of Helicobacter pylori. J Clin Microbiol,1991,29(12):2835
(收稿：1998-06-23；修回：1998-12-09), 百拇医药