尼卡地平诱导大鼠肾小球系膜细胞凋亡的作用及其分子机理的探讨
作者：柴华旗 江黎明 叶 锋 陈孝文
单位：广东医学院附属医院肾内科，湛江 524001
关键词：尼卡地平；系膜细胞；凋亡；Bcl-2蛋白
广东医学院学报990203 摘要 目的：探讨尼卡地平对大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响及其分子机理。方法：常规分离培养大鼠肾小球系膜细胞，DNA电泳、Ho 33342染色、流式细胞仪等方法观察尼卡地平对细胞凋亡及其调控蛋白Bcl-2，Bax，Fas，FasL表达的影响。结果：尼卡地平在体外可诱导大鼠肾小球系膜细胞凋亡并伴Bcl-2蛋白表达下降。结论：尼卡地平能通过诱导Bcl-2下调，使大鼠肾小球系膜细胞凋亡，因而该药可能是治疗系膜细胞增殖肾炎的有效药物。
In vitro the role of nicardipine inducing apoptosis of
, 百拇医药
mesangial cell and its molecular mechanisms in rat
Chai Huaqi，Jiang Liming，Ye Feng，et al
Department of Nephrology，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang，524001
Abstract Objective：To explore the effects of nicardipine on apoptosis of rat mesangial cells and its molecular mechanisms.Methods:Apoptosis induced by nicardipine was assessed by DNA gel electrophoresis，Ho 33342 staining and Bcl-2，Bax，Fas，FasL proteins were observed by flow cytometer.Results:Nicardipine could induce apoptosis of rat meangial cells.The apoptosis was associated with downregulation of Bcl-2 protein.Conclusion:Nicardipine can induce the apoptosis of rat mesangial cell in vitro and may be an effective drug for mesangial proliferative glomerulonephritis.
, 百拇医药
Key words: Nicardipine；Mesangial cell；Apoptosis；Bcl-2 protein
系膜增殖性肾小球肾炎是人类原发性肾小球疾病最常见的病理类型，在许多其他肾小球疾病中也均有不同程度的系膜细胞增多。目前认为系膜细胞的增多不仅取决于系膜细胞增殖的程度，而且取决于系膜细胞凋亡的多少。在大鼠抗Thy1.1系膜增生性肾小球肾炎中，增生的系膜细胞通过凋亡使其减少，系膜增生消退，肾小球结构及功能均恢复正常[1]。由此可见系膜细胞的凋亡可能在系膜增殖性肾炎中有重要作用。因此，研究药物诱导系膜细胞凋亡对系膜增殖性肾炎的治疗及转归有重要的意义。
1 材料与方法
1.1主要试剂及仪器 RPMI1640培养基(GIBCO)，新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，兔抗大鼠Fas(M-20)，FasL(N-20)，Bcl-2(N-19)，Bax(N-20)多克隆抗体、羊抗兔IgG-FITC(中山生物技术公司)，带计算机分析系统的流式细胞仪(CoulterElectronic公司)，其他未特别注明的试剂，均购自Sigma公司。
, http://www.100md.com
1.2 肾小球系膜细胞的培养和鉴定 将雄性SD大鼠(80～100g)拉颈处死，无菌条件下取出肾脏，剪开并剥下肾包膜，去髓质，将肾皮质剪成约2 mm小块，放于80目钢网上研磨，过100目筛网，最后在200目筛网上收集肾小球。1000 r/min，离心2 min，再用RPMI 1 640洗1次，经0.1%Ⅳ型胶原酶消化30 min，镜下观察肾小球纯度达99%，将肾小球置培养瓶内，加入含15%新生小牛血清、400U/L胰岛素、2 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L的谷氨酰胺、青霉素105U/L、链霉素0.1g/L的RPMI 1640培养液，在37℃，5%CO2，100%湿度培养，待细胞长满瓶后加入PA(嘌呤霉素核苷)，待细胞再长满瓶后为第一代细胞，常规传代换液。肾小球系膜细胞在相差显微镜下为星型和梭型，免疫组化证实这样培养的细胞在3代后，几乎均为结蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性。
1.3 肾小球系膜细胞凋亡的诱导 取8～15代的肾小球系膜细胞，待其长满后先用含0.5%新生小牛血清RPMI 1640培养液同步化24 h，再加入终浓度为1.25～100μ mol/L尼卡地平(以DMSO溶解，使用时DMSO终浓度<0.5%)，对照组1加入0.5%的DMSO(终浓度)，对照组2未加任何药物，作用24 h后，胰酶，EDTA消化收集细胞。
, 百拇医药
1.4 肾小球系膜细胞DNA提取和电泳 收集细胞后离心，去上清，PBS洗2次，加入细胞裂解液、蛋白酶K，55℃消化2 h，加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)，混匀后，10 000 r/min，离心10 min，等体积氯仿再抽提1次；上清加入2倍体积无水乙醇，-20℃过夜。15 000 r/ min，离心25 min，弃上清，，25 μL TE溶解。在1.5%琼脂糖90 V，电泳90 min，以自动凝胶荧光成象系统摄象分析。
1.5 Ho 33342染色 将生长有细胞的玻璃条取出，10 mmol/L PBS(pH 7.4)洗1次，4%多聚甲醛固定，Ho 33342(5 mg/L)染色，4℃，20 min，荧光显微镜下观察。以细胞核发生核固缩或有凋亡小体、核碎裂为判断凋亡的标准。
1.6 凋亡相关调控蛋白的检测 取1 mL收集的细胞(约106个细胞)，0.5%多聚甲醛4℃固定过夜，离心(2 000 r/min，5 min)去上清，加0.1%Triton X-100渗透5 min，离心去上清，PBS洗1次，加PBS 1 mL，匀分装为5管，留1管作空白对照，余四管分别加入兔抗大鼠Bcl-2，Bax，Fas，FasL多克隆抗体，混匀后，4℃孵育30 min，PBS洗1次，加羊抗兔IgG-FITC，4℃孵育 30 min；PBS 洗 2 次后，细胞悬浮于0.5 mL PBS中，用流式细胞仪检测阳性细胞数，空白管为对照，每项至少检测 5 000个细胞。
, 百拇医药
1.7 统计学处理方法 用多个样本均数间的q检验。
2 结果
2.1DNA片断电泳 在尼卡地平(5×10-5～10×10-5 mol/L)作用24 h后，DNA电泳显示分子量为180～220 bp倍数的梯形条带。而对照组则为基本完整的DNA带(见图1)。说明尼卡地平可诱导大鼠肾小球系膜细胞发生凋亡。
图1 肾小球系膜细胞的DNA电泳(尼卡地平 24 h)
1～4： 尼卡地平浓度分别为10，5，2.5，1.25×10-5 mol/L
5：对照组 1 6：对照组 2 M：DNA分子标准
, http://www.100md.com
2.2 Ho 33342染色 尼卡地平处理24 h后，可见到较多细胞的细胞核发生固缩而浓染，形态不规则，并可见到凋亡小体和核碎片。(10，5，2.5，1.25)×10-5 mol/L时，凋亡比例分别为32%，21%，11%，5%左右。两对照组凋亡比例均小于2%。
2.3 Bcl-2，Bax，Fas，FasL蛋白表达情况 加尼卡地平作用 24 h，结果见表1。在各种凋亡相关基因的表达中，DMSO与空白对照比较无差异。Bcl-2的蛋白表达受尼卡地平作用而明显减少，且呈剂量依赖性。在尼卡地平浓度为 5×10-5～10×10-5 mol/L时，所有基因的表达均明显减少。
表1 尼卡地平对凋亡相关基因蛋白表达的影响 (
±s,%) 组别
, http://www.100md.com n
Bcl-2
Bax
Fas
FasL
对照组1
3
76.43±9.91
44.47±14.49
64.8±12.06
49.17±15.63
对照组2
3
, http://www.100md.com
72.43±2.93
43.6±8.97
61±7.73
49±7.8
A组
3
60.4±9.72*
62.5±17.34
84，23±3.99
64，1±10.6
B组
3
, http://www.100md.com
39.37±8.66** ＃＃
44.7±10.08
69.9±4.07
59±10.45
C组
3
18.97±12.77** ＃＃
24.34±18.81**
41.03±25.3**
19.97±13.66**＃＃
, 百拇医药
D组
3
14.77±0.55**＃＃
13.8±10.4**＃＃
25.73±15.44** ＃＃
18.27±9.8**＃＃
与DMSO组相比 *P<0.05，** P<0.001 与空白组相比 ＃P<0.05，＃＃ P<0.001
A、B、C、D组分别为尼卡地平(1.25，2.5，5，10)×10-5 mol/L3 讨论
, http://www.100md.com 目前尼卡地平在肾脏病临床中主要用于糖尿病肾病、防治环孢霉素的毒副作用及造影剂中毒。较早的研究表明，尼卡地平在较大剂量(10μ mol/L)时可抑制血小板源性生长因子所介导的系膜细胞增殖[2]，因此这种抑制增殖的作用可能不单纯是阻断钙通道所致，我们推测可能有凋亡或其他机制参与其中。为此，我们设计了该实验研究尼卡地平是否能诱导大鼠肾小球系膜细胞凋亡及其分子机制。
细胞凋亡在机体细胞数量自稳调节中的作用在近年来受到越来越多的重视。目前普遍认为，机体某种细胞数量的平衡，不仅取决于该细胞的增殖情况，而且与细胞凋亡的关系更为密切。细胞凋亡时细胞DNA在内源性核酸内切酶的作用下发生节段性碎裂；细胞核在形态上表现为核皱缩、浓染、碎裂及凋亡小体形成，DNA电泳出现呈180～200 bp整倍数的“阶梯”现象。本文的DNA电泳及Ho 333342染色结果表明，尼卡地平确有诱导大鼠系膜细胞凋亡的作用。
过去一般认为细胞发生凋亡时需先有细胞内钙的升高，再激活钙依赖性核酸内切酶使细胞产生凋亡的一系列表现。尼卡地平作为一种钙通道拮抗剂，有降低细胞内钙的作用。因此，一般认为它有抑制细胞凋亡的作用。但最近的研究表明在细胞内钙减少时，以及无钙依赖性核酸内切酶的细胞同样可发生细胞的凋亡[3]。这说明细胞内钙的升高，并非细胞发生凋亡所必需，且最近Balakumaran报道尼卡地平在体内能诱导大鼠胸腺细胞凋亡[4]。
, 百拇医药
Bcl-2 是研究得最早也最充分的凋亡相关基因，属凋亡抑制基因。目前认为，细胞内质网钙水平下降将应激信号激活，应激信号可激活死亡相关基因。Bcl-2蛋白主要定位于内质网、线粒体及细胞核的核膜上，其功能可使这种钙的失衡恢复正常，从而抑制凋亡的发生[5]。Bax是一种凋亡促进基因，与Bcl-2 共有21%的同源性，可与Bcl-2 结合形成异源二聚体，妨碍Bcl-2同源二聚体的形成；或通过与Bcl-2竞争结合位点而发挥促凋亡作用[6，7]。我们观察到Bcl-2的蛋白表达呈剂量依赖性下调，同时Bax的表达并不减少，甚至略有上调。此两者的失衡可能是尼卡地平诱导该细胞凋亡的主要分子机制。
Fas和FasL是另一对凋亡促进基因。当FasL或Fas抗体与Fas结合后可诱导表达Fas的细胞发生凋亡。Gonzalez[8]等发现培养的肾小球系膜细胞可同时表达Fas和FasL；用抗Fas抗体可诱导人系膜细胞发生凋亡，并认为系膜细胞同时表达这两种凋亡促进基因可能对其自身凋亡的调节有重要作用。但在我们的研究中，尼卡地平仅在浓度为12.5μ mol/L时，这两种基因的表达略有上调，但无统计学意义(P>0.05)，而且此时该细胞的凋亡比例仅5%左右，因此它们可能不是尼卡地平诱导大鼠系膜细胞发生凋亡的主要分子机制。同时我们认为系膜细胞FasL的表达可能对其自身凋亡的调节作用不大。因为我们的对照组及常规培养中，系膜细胞的自发凋亡并不比其它细胞高。
, 百拇医药
这可能与系膜细胞在单层贴壁培养状态下，表达FASL的细胞不能与表达FAS的细胞充分接触有关，一般认为只有在FASL与FAS结合后，才可能产生FAS/FASL所诱等的凋亡。
当尼卡地平浓度为100μ mol/L作用24 h后，所有基因蛋白表达水平均下降。这可能是由于细胞发和凋亡时，较多细胞产生凋亡小体，致使细胞表面胞浆的各种抗原的量较正常细胞相对减少，单个细胞抗原的平均荧光强度较弱，易被计算机识别为阴性细胞之故。
4 参考文献
1 Baker AJ，Mooney A，Hughes J，et al.Mesangial cell apoptosis：The major mechanism for resolution of glomerular hypercellularity in experimental mesangial proliferative nephritis.J Clin Invest，1994，94：2105～2116
, 百拇医药
2 高远赋，王晓燕，姜新猷，等.钙拮抗剂对系膜细胞增值的抑制作用.J Nephrol Dial Transplant，1997，6(2)：134～138
3 Kondo S，Yin D，Morimura T，et al.Combination therapy with cisplatin and nifedipine induces apoptosis in cisplatin-sensitive and cisplatin-resistant human glioblastom cells.Br J Cancer，1995，71(2)：282～289
4 Balakumaran A，Campbell GA，Moslen MT.Calcium channel blockers induce thymic apoptosis in vivo in rats.Toxicology and Applied Pharmacology，1996；139：122～127
, http://www.100md.com
5 Berridge MJ，Bootman MD，Lipp P.Calcium-a life and death signal.Nature，1998，395：645～648
6 Oltvai ZN，Milliman CL，Korsmeyer SJ.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homology，Bas，that accelerates programmed cell death.Cell，1993，74：609～619
7 Aguilar SM，Rottenberg ME，Lewin N，et al.Bcl-2，Bax and P53 expression in B-CLL in relation to in vitro survival and clinical progression.Int J Cangcer，1996，69：114～119
8 Gonzalez CS，Lopea MJ，Gomez GC，et al.Anti-Fas antibodies induced cytolysis and apoptosis in cultured human meangial cells.Kidney Int，1996，49：1064～1070
收稿日期： 1999-03-03, http://www.100md.com
单位：广东医学院附属医院肾内科，湛江 524001
关键词：尼卡地平；系膜细胞；凋亡；Bcl-2蛋白
广东医学院学报990203 摘要 目的：探讨尼卡地平对大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响及其分子机理。方法：常规分离培养大鼠肾小球系膜细胞，DNA电泳、Ho 33342染色、流式细胞仪等方法观察尼卡地平对细胞凋亡及其调控蛋白Bcl-2，Bax，Fas，FasL表达的影响。结果：尼卡地平在体外可诱导大鼠肾小球系膜细胞凋亡并伴Bcl-2蛋白表达下降。结论：尼卡地平能通过诱导Bcl-2下调，使大鼠肾小球系膜细胞凋亡，因而该药可能是治疗系膜细胞增殖肾炎的有效药物。
In vitro the role of nicardipine inducing apoptosis of
, 百拇医药
mesangial cell and its molecular mechanisms in rat
Chai Huaqi，Jiang Liming，Ye Feng，et al
Department of Nephrology，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang，524001
Abstract Objective：To explore the effects of nicardipine on apoptosis of rat mesangial cells and its molecular mechanisms.Methods:Apoptosis induced by nicardipine was assessed by DNA gel electrophoresis，Ho 33342 staining and Bcl-2，Bax，Fas，FasL proteins were observed by flow cytometer.Results:Nicardipine could induce apoptosis of rat meangial cells.The apoptosis was associated with downregulation of Bcl-2 protein.Conclusion:Nicardipine can induce the apoptosis of rat mesangial cell in vitro and may be an effective drug for mesangial proliferative glomerulonephritis.
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Key words: Nicardipine；Mesangial cell；Apoptosis；Bcl-2 protein
系膜增殖性肾小球肾炎是人类原发性肾小球疾病最常见的病理类型，在许多其他肾小球疾病中也均有不同程度的系膜细胞增多。目前认为系膜细胞的增多不仅取决于系膜细胞增殖的程度，而且取决于系膜细胞凋亡的多少。在大鼠抗Thy1.1系膜增生性肾小球肾炎中，增生的系膜细胞通过凋亡使其减少，系膜增生消退，肾小球结构及功能均恢复正常[1]。由此可见系膜细胞的凋亡可能在系膜增殖性肾炎中有重要作用。因此，研究药物诱导系膜细胞凋亡对系膜增殖性肾炎的治疗及转归有重要的意义。
1 材料与方法
1.1主要试剂及仪器 RPMI1640培养基(GIBCO)，新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，兔抗大鼠Fas(M-20)，FasL(N-20)，Bcl-2(N-19)，Bax(N-20)多克隆抗体、羊抗兔IgG-FITC(中山生物技术公司)，带计算机分析系统的流式细胞仪(CoulterElectronic公司)，其他未特别注明的试剂，均购自Sigma公司。
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1.2 肾小球系膜细胞的培养和鉴定 将雄性SD大鼠(80～100g)拉颈处死，无菌条件下取出肾脏，剪开并剥下肾包膜，去髓质，将肾皮质剪成约2 mm小块，放于80目钢网上研磨，过100目筛网，最后在200目筛网上收集肾小球。1000 r/min，离心2 min，再用RPMI 1 640洗1次，经0.1%Ⅳ型胶原酶消化30 min，镜下观察肾小球纯度达99%，将肾小球置培养瓶内，加入含15%新生小牛血清、400U/L胰岛素、2 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L的谷氨酰胺、青霉素105U/L、链霉素0.1g/L的RPMI 1640培养液，在37℃，5%CO2，100%湿度培养，待细胞长满瓶后加入PA(嘌呤霉素核苷)，待细胞再长满瓶后为第一代细胞，常规传代换液。肾小球系膜细胞在相差显微镜下为星型和梭型，免疫组化证实这样培养的细胞在3代后，几乎均为结蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性。
1.3 肾小球系膜细胞凋亡的诱导 取8～15代的肾小球系膜细胞，待其长满后先用含0.5%新生小牛血清RPMI 1640培养液同步化24 h，再加入终浓度为1.25～100μ mol/L尼卡地平(以DMSO溶解，使用时DMSO终浓度<0.5%)，对照组1加入0.5%的DMSO(终浓度)，对照组2未加任何药物，作用24 h后，胰酶，EDTA消化收集细胞。
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1.4 肾小球系膜细胞DNA提取和电泳 收集细胞后离心，去上清，PBS洗2次，加入细胞裂解液、蛋白酶K，55℃消化2 h，加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)，混匀后，10 000 r/min，离心10 min，等体积氯仿再抽提1次；上清加入2倍体积无水乙醇，-20℃过夜。15 000 r/ min，离心25 min，弃上清，，25 μL TE溶解。在1.5%琼脂糖90 V，电泳90 min，以自动凝胶荧光成象系统摄象分析。
1.5 Ho 33342染色 将生长有细胞的玻璃条取出，10 mmol/L PBS(pH 7.4)洗1次，4%多聚甲醛固定，Ho 33342(5 mg/L)染色，4℃，20 min，荧光显微镜下观察。以细胞核发生核固缩或有凋亡小体、核碎裂为判断凋亡的标准。
1.6 凋亡相关调控蛋白的检测 取1 mL收集的细胞(约106个细胞)，0.5%多聚甲醛4℃固定过夜，离心(2 000 r/min，5 min)去上清，加0.1%Triton X-100渗透5 min，离心去上清，PBS洗1次，加PBS 1 mL，匀分装为5管，留1管作空白对照，余四管分别加入兔抗大鼠Bcl-2，Bax，Fas，FasL多克隆抗体，混匀后，4℃孵育30 min，PBS洗1次，加羊抗兔IgG-FITC，4℃孵育 30 min；PBS 洗 2 次后，细胞悬浮于0.5 mL PBS中，用流式细胞仪检测阳性细胞数，空白管为对照，每项至少检测 5 000个细胞。
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1.7 统计学处理方法 用多个样本均数间的q检验。
2 结果
2.1DNA片断电泳 在尼卡地平(5×10-5～10×10-5 mol/L)作用24 h后，DNA电泳显示分子量为180～220 bp倍数的梯形条带。而对照组则为基本完整的DNA带(见图1)。说明尼卡地平可诱导大鼠肾小球系膜细胞发生凋亡。
图1 肾小球系膜细胞的DNA电泳(尼卡地平 24 h)
1～4： 尼卡地平浓度分别为10，5，2.5，1.25×10-5 mol/L
5：对照组 1 6：对照组 2 M：DNA分子标准
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2.2 Ho 33342染色 尼卡地平处理24 h后，可见到较多细胞的细胞核发生固缩而浓染，形态不规则，并可见到凋亡小体和核碎片。(10，5，2.5，1.25)×10-5 mol/L时，凋亡比例分别为32%，21%，11%，5%左右。两对照组凋亡比例均小于2%。
2.3 Bcl-2，Bax，Fas，FasL蛋白表达情况 加尼卡地平作用 24 h，结果见表1。在各种凋亡相关基因的表达中，DMSO与空白对照比较无差异。Bcl-2的蛋白表达受尼卡地平作用而明显减少，且呈剂量依赖性。在尼卡地平浓度为 5×10-5～10×10-5 mol/L时，所有基因的表达均明显减少。
表1 尼卡地平对凋亡相关基因蛋白表达的影响 (
±s,%) 组别, http://www.100md.com n
Bcl-2
Bax
Fas
FasL
对照组1
3
76.43±9.91
44.47±14.49
64.8±12.06
49.17±15.63
对照组2
3
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72.43±2.93
43.6±8.97
61±7.73
49±7.8
A组
3
60.4±9.72*
62.5±17.34
84，23±3.99
64，1±10.6
B组
3
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39.37±8.66** ＃＃
44.7±10.08
69.9±4.07
59±10.45
C组
3
18.97±12.77** ＃＃
24.34±18.81**
41.03±25.3**
19.97±13.66**＃＃
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D组
3
14.77±0.55**＃＃
13.8±10.4**＃＃
25.73±15.44** ＃＃
18.27±9.8**＃＃
与DMSO组相比 *P<0.05，** P<0.001 与空白组相比 ＃P<0.05，＃＃ P<0.001
A、B、C、D组分别为尼卡地平(1.25，2.5，5，10)×10-5 mol/L3 讨论
, http://www.100md.com 目前尼卡地平在肾脏病临床中主要用于糖尿病肾病、防治环孢霉素的毒副作用及造影剂中毒。较早的研究表明，尼卡地平在较大剂量(10μ mol/L)时可抑制血小板源性生长因子所介导的系膜细胞增殖[2]，因此这种抑制增殖的作用可能不单纯是阻断钙通道所致，我们推测可能有凋亡或其他机制参与其中。为此，我们设计了该实验研究尼卡地平是否能诱导大鼠肾小球系膜细胞凋亡及其分子机制。
细胞凋亡在机体细胞数量自稳调节中的作用在近年来受到越来越多的重视。目前普遍认为，机体某种细胞数量的平衡，不仅取决于该细胞的增殖情况，而且与细胞凋亡的关系更为密切。细胞凋亡时细胞DNA在内源性核酸内切酶的作用下发生节段性碎裂；细胞核在形态上表现为核皱缩、浓染、碎裂及凋亡小体形成，DNA电泳出现呈180～200 bp整倍数的“阶梯”现象。本文的DNA电泳及Ho 333342染色结果表明，尼卡地平确有诱导大鼠系膜细胞凋亡的作用。
过去一般认为细胞发生凋亡时需先有细胞内钙的升高，再激活钙依赖性核酸内切酶使细胞产生凋亡的一系列表现。尼卡地平作为一种钙通道拮抗剂，有降低细胞内钙的作用。因此，一般认为它有抑制细胞凋亡的作用。但最近的研究表明在细胞内钙减少时，以及无钙依赖性核酸内切酶的细胞同样可发生细胞的凋亡[3]。这说明细胞内钙的升高，并非细胞发生凋亡所必需，且最近Balakumaran报道尼卡地平在体内能诱导大鼠胸腺细胞凋亡[4]。
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Bcl-2 是研究得最早也最充分的凋亡相关基因，属凋亡抑制基因。目前认为，细胞内质网钙水平下降将应激信号激活，应激信号可激活死亡相关基因。Bcl-2蛋白主要定位于内质网、线粒体及细胞核的核膜上，其功能可使这种钙的失衡恢复正常，从而抑制凋亡的发生[5]。Bax是一种凋亡促进基因，与Bcl-2 共有21%的同源性，可与Bcl-2 结合形成异源二聚体，妨碍Bcl-2同源二聚体的形成；或通过与Bcl-2竞争结合位点而发挥促凋亡作用[6，7]。我们观察到Bcl-2的蛋白表达呈剂量依赖性下调，同时Bax的表达并不减少，甚至略有上调。此两者的失衡可能是尼卡地平诱导该细胞凋亡的主要分子机制。
Fas和FasL是另一对凋亡促进基因。当FasL或Fas抗体与Fas结合后可诱导表达Fas的细胞发生凋亡。Gonzalez[8]等发现培养的肾小球系膜细胞可同时表达Fas和FasL；用抗Fas抗体可诱导人系膜细胞发生凋亡，并认为系膜细胞同时表达这两种凋亡促进基因可能对其自身凋亡的调节有重要作用。但在我们的研究中，尼卡地平仅在浓度为12.5μ mol/L时，这两种基因的表达略有上调，但无统计学意义(P>0.05)，而且此时该细胞的凋亡比例仅5%左右，因此它们可能不是尼卡地平诱导大鼠系膜细胞发生凋亡的主要分子机制。同时我们认为系膜细胞FasL的表达可能对其自身凋亡的调节作用不大。因为我们的对照组及常规培养中，系膜细胞的自发凋亡并不比其它细胞高。
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这可能与系膜细胞在单层贴壁培养状态下，表达FASL的细胞不能与表达FAS的细胞充分接触有关，一般认为只有在FASL与FAS结合后，才可能产生FAS/FASL所诱等的凋亡。
当尼卡地平浓度为100μ mol/L作用24 h后，所有基因蛋白表达水平均下降。这可能是由于细胞发和凋亡时，较多细胞产生凋亡小体，致使细胞表面胞浆的各种抗原的量较正常细胞相对减少，单个细胞抗原的平均荧光强度较弱，易被计算机识别为阴性细胞之故。
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收稿日期： 1999-03-03, http://www.100md.com