肺部良、恶性病变中p53蛋白与AgNOR的检测及相关性研究
作者：张 平 曹仁贤
单位：湖南省衡阳医学院第一附属医院(衡阳 421001)
关键词：肺肿瘤；原癌基因蛋白类；核仁组织区
湖南医学990206 摘 要
【目的】为探讨肺部良、恶性病变中p53蛋白的表达与核仁组成区银染色(AgNOR)的检测及相关性。【方法】采用链霉素亲生物素-过氧化物酶免疫组化方法和AgNOR法对45例肺癌和30例肺部良性病变进行了检测。【结果】p53蛋白在肺癌组织中表达总阳性率达80%，肺部良性病变组织呈阴性。在p53蛋白阳性肺癌组织中AgNOR细胞核颗粒均数为(9.63±0.70)，而肺部良性病变组织中其颗粒均数(1.92±0.29)，两组比较差异有显著性(P<0.01)。【结论】p53蛋白可作为肺癌细胞的肿瘤标志物之一，为肺癌诊断提供参考。AgNOR定量能区别肺部良、恶性病变，并与p53蛋白表达呈正相关。
, 百拇医药
Exprssion of p53 Protein and Detection of AgNOR in the Benign and
Malignant Pathological Process of Lung and Their Correlation
ZHANG Ping, CAO Renxian
The First Affiliated Hospital,Hengyang Medical College,Hengyang,421001
Abstract
【Objective】To investigate the correlation between the expression of p53 protein and detection by means of silver staining of nucleolus organizer region (AgNOR) in the benign and malignant pathological process of lung.【Methods】Streptavidin-peroxidase immunohistochemical and AgNOR techniques were used to detect 45 patients of lung cancer and 30 patients of lung benign disease.【Results】The total positive rate of p53 protein expression reached 80% in lung cancer tissuses,but tissues from all lung benign diseases presented negative expression.The mean value of nucleus grains with AgNOR in lung cancer tissuse with positive expression of p53 protein was 9.63±0.70,and that in tissues of lung benign diseases was 1.92±0.29,respectively;the difference between two groups was significant (P<0.01).【Conclusions】p53 protein which had a high expressing frequency in lung cancer tissuses can be considered as a good specific tumor marker for lung cancer cells.Therefore it can be used as a reference index of lung cancer diagnosis.AgNOR quantitation can distinguish benign pathological process of lung from the malignant.
, 百拇医药
Key words lung neoplasms; proto-oncogene proteins; nucleolus organizer region
随着人们对肿瘤的发生及发展的新认识，发现很多癌基因和抑癌基因参与正常细胞向癌细胞的转化过程，抑癌基因p53在肿瘤发生过程中起重要作用。核仁组成区相关蛋白(AgNOR)是与rRNA的转录密切相关的一种酸性蛋白，AgNOR颗粒数量，大小、形态与细胞增殖及rRNA的活性程度相关，不仅可反应细胞和细胞核的活性，而且还可反映肿瘤的恶性特点[1]。本文应用免疫组织化学方法和AgNOR法，探讨肺部良、恶性病变中p53蛋白的表达及其与AgNOR的相关性。
1 材料和方法
1.1 材料来源 收集本院近年来手术切除和纤维支气管镜活检病理证实标本75例。取材后用10%福尔马林固定，石腊包埋，制成4～5 um厚切片，经HE染色组织学观察。肺癌组45例：鳞状细胞癌20例，腺癌14例，大细胞未分化癌4例，小细胞未分化癌7例。对照组30例：其中肺结核18例，炎性假瘤8例，支气扩张4例。
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1.2 免疫组织化学染色 采用链霉素亲生物素-过氧化物酶免疫组化方法(S-P)。S-P试剂盒为Maxin公司产品。p53蛋白的单克隆抗体Do-7为美国DAKD公司产品，操作方法按S-P试剂盒说明步骤进行。以细胞呈棕色为阳性。同时设以PBS代替一抗作空白对照，用已知阳性切片作阳性对照。
1.3 AgNOR染色 将配制好的胶体银染色液(将明胶溶于1%甲酸中，浓度为2%，再与50%的硝酸银(按1∶2混合而成)滴于切片上，染色在恒温箱内进行(避光、调温)，温度控制在30 ℃，时间30 min。经水洗、脱水、透明后树胶封片。将切片置于多功能医用图像工作站(德中贸易有限公司2000型)光镜下观察，用彩色480线性CCD摄相机采集图像，通过计算机图像分析，将每例计数100个细胞再换算成每个细胞核内AgNOR颗粒的均数，采用t检验作统计学处理。
2 结果
2.1 免疫组化染色结果 p53蛋白在各型肺癌组织细胞中表达情况见附表(封四图1)。总阳性率为80%，肺部良性病变组织呈阴性。根据染色、阳性细胞的部位p53蛋白存在三种分布形态：细胞核型、细胞浆型、细胞膜型。
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图1 肺癌组织p53蛋白的表达(SP组化×400)
附表 p53蛋白在各型肺癌组织细胞中的表达(例，%) 组织学类型
n
阳性
核阳性
胞浆阳性
膜阳性
阳性率
鳞状细胞癌
20
17
6(35.29)
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10(58.82)
1(5.88)
85.00
腺 癌
14
11
4(36.36)
7(63.64)
0(0)
78.57
大细胞癌
4
3
, 百拇医药
1(33.33)
2(66.67)
0(0)
75.00
小细胞癌
7
5
2(40.00)
3(60.00)
0(0)
71.42
合 计
45
, 百拇医药
36
13(36.12)
22(61.11)
1(2.77)
80.00
2.2 p53蛋白表达与AgNOR关系 显微镜下p53蛋白表达阳性的癌组织中，细胞核内均见呈黑色的AgNOR颗粒，其形态以核仁状、不规则状为多见，颗粒细小。每核7～12个，多达20个，总颗粒均数(9.63±0.70)(见封四图2)。部分p53表达阴性的肺癌组织中，癌细胞核内仍可见AgNOR颗粒，每核4～8个，总颗粒均数(6.42±0.35)。而肺部良性病变组织中细胞核内AgNOR颗粒较大，呈圆型，界线清晰，多位于核中央，每核颗粒在1～3个之间(见封四图3)，总颗粒均数为(1.92±0.29)，与p53蛋白表达阳性比较差异有显著性(P<0.01)。
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图2 肺癌标本细胞核AgNOR分布(银染×400)
图3 肺部良性病变细胞核AgNOR分布(银染×200)
3 讨论
近年来人们从分子生物学探讨肿瘤的发生过程，发现了许多肿瘤基因和肿瘤抑制基因的变异参与这个过程的不同阶段，原癌基因ras和抑制基因p53的变化在细胞癌变过程中起关键作用，特别是抑癌基因p53在人类恶性肿瘤中的检出，显示出它的广谱泛瘤性和稳定性[2]。
p53基因是53kD的核内磷蛋白，在正常细胞中与细胞周期的调节有关，最近将p53基因蛋白分为野生型(wildtype)及突变型(mutant)，前者由于半衰期短在正常细胞中含量低，用免疫组化方法难以检出，当p53基因发生点突变时，p53蛋白构象改变，稳定性增强，且能与一些癌蛋白形成稳定的复合物，使半衰期大大延长，含量比正常增多，显示表达增强。因此免疫组织化学方法检测到的是突变型p53蛋白[3]。本文用免疫组织化学法检测p53蛋白在45例肺癌组织中的过度表达阳性率为80%，其中鳞状细胞癌为85%，腺癌为78.57%，大、小细胞癌为75%和71.42%，与姜奕等[4]报道相近。肺部良性病变及正常支气管粘膜上皮为阴性。这进一步表明p53表达是肺癌的肿瘤标志物之一。观察各类肺癌p53蛋白染色阳性在细胞的部位情况，可见突变型p53可以同时存在于细胞核和细胞浆中，但各类肺癌在不同部位所占的比例不同。在细胞核中，腺癌占36.36%，鳞状上皮细胞癌占35.29%，大、小细胞癌分别占33.33%和40.00%，而细胞浆中表现阳性者平均达61.11%。因此有人认为细胞浆内p53蛋白过度表达具有更高的恶性度，因为正常细胞浆内p53分子较少，不能用免疫组织化学法检出[5]。
, 百拇医药
AgNOR是同rRNA转录密切相关的一种酸性蛋白[6]，具有较强的嗜银性，它可以反应细胞的转录活性及蛋白质合成的活跃状态。因此，研究AgNOR的数目可为研究细胞增生和分化的基因调控提供信息。文献报道[7]，AgNOR数量随着肿瘤恶性程度增加而增加，肿瘤的恶性程度越高，细胞转录活性及蛋白质合成就越活跃，但不能区别肺癌细胞的类型。本文结果表明，p53蛋白表达阳性的癌组织中，AgNOR颗粒均数明显高于对照组，并证实p53蛋白表达与AgNOR检测呈正相关。在一些p53阴性的肺癌病例中，AgNOR计数均值仍高于对照组，可能这一部分肺癌p53基因丢失或未发生突变所致，尚需进一步研究证实。
笔者认为，抑癌基因p53突变可能是导致肿瘤增生异常活跃的因素之一，在肺癌发生中是一种比较常见的基因改变，在肺癌组织中表达的阳性率高，为肺癌细胞的肿瘤标志物之一，可作为肺癌诊断的一个参考指标。在肺部良、恶性病变AgNOR定量与p53蛋白表达呈正相关，这对于某些p53阴性肺肿瘤，同时结合AgNOR检测对其诊断有很大意义。
, 百拇医药
参考文献
1 鄢淑琴.核仁形成体区及其在肿瘤研究中的价值.肿瘤防治研究，1991，18(4)：260
2 战忠利，梁 莉，张连郁，等.肺未分化癌p53基因蛋白的表达和预后相关性的研究.中国肿瘤临床，1995，22(12)：876
3 Harris CC,Hollstein M.Clinical implications of the p53 tumor suppressor gene.N Engl J Med,1993,329:1318
4 姜 奕，何安光，戴晓淳.肺癌抑癌基因p53产物的免疫组织化学研究.中华结核和呼吸杂志，1994，17(1)：45
5 Iggo R,Gatter K,Bartek J,et al.Increased expression of mutant forms of p53 oncogene in primary lung cancer.Lancet,1990,335:675
6 Editori Al.Nucleolar organizer regions as diagnostic diacriminants for malignancy.J Pathol,1988,155(1):95
7 张 平，蒋太山，谌三祥.原发性肺癌核仁组成区定量分析及临床意义.衡阳医学院学报，1992，20(4)：388
(19980717 收稿), 百拇医药
单位：湖南省衡阳医学院第一附属医院(衡阳 421001)
关键词：肺肿瘤；原癌基因蛋白类；核仁组织区
湖南医学990206 摘 要
【目的】为探讨肺部良、恶性病变中p53蛋白的表达与核仁组成区银染色(AgNOR)的检测及相关性。【方法】采用链霉素亲生物素-过氧化物酶免疫组化方法和AgNOR法对45例肺癌和30例肺部良性病变进行了检测。【结果】p53蛋白在肺癌组织中表达总阳性率达80%，肺部良性病变组织呈阴性。在p53蛋白阳性肺癌组织中AgNOR细胞核颗粒均数为(9.63±0.70)，而肺部良性病变组织中其颗粒均数(1.92±0.29)，两组比较差异有显著性(P<0.01)。【结论】p53蛋白可作为肺癌细胞的肿瘤标志物之一，为肺癌诊断提供参考。AgNOR定量能区别肺部良、恶性病变，并与p53蛋白表达呈正相关。
, 百拇医药
Exprssion of p53 Protein and Detection of AgNOR in the Benign and
Malignant Pathological Process of Lung and Their Correlation
ZHANG Ping, CAO Renxian
The First Affiliated Hospital,Hengyang Medical College,Hengyang,421001
Abstract
【Objective】To investigate the correlation between the expression of p53 protein and detection by means of silver staining of nucleolus organizer region (AgNOR) in the benign and malignant pathological process of lung.【Methods】Streptavidin-peroxidase immunohistochemical and AgNOR techniques were used to detect 45 patients of lung cancer and 30 patients of lung benign disease.【Results】The total positive rate of p53 protein expression reached 80% in lung cancer tissuses,but tissues from all lung benign diseases presented negative expression.The mean value of nucleus grains with AgNOR in lung cancer tissuse with positive expression of p53 protein was 9.63±0.70,and that in tissues of lung benign diseases was 1.92±0.29,respectively;the difference between two groups was significant (P<0.01).【Conclusions】p53 protein which had a high expressing frequency in lung cancer tissuses can be considered as a good specific tumor marker for lung cancer cells.Therefore it can be used as a reference index of lung cancer diagnosis.AgNOR quantitation can distinguish benign pathological process of lung from the malignant.
, 百拇医药
Key words lung neoplasms; proto-oncogene proteins; nucleolus organizer region
随着人们对肿瘤的发生及发展的新认识，发现很多癌基因和抑癌基因参与正常细胞向癌细胞的转化过程，抑癌基因p53在肿瘤发生过程中起重要作用。核仁组成区相关蛋白(AgNOR)是与rRNA的转录密切相关的一种酸性蛋白，AgNOR颗粒数量，大小、形态与细胞增殖及rRNA的活性程度相关，不仅可反应细胞和细胞核的活性，而且还可反映肿瘤的恶性特点[1]。本文应用免疫组织化学方法和AgNOR法，探讨肺部良、恶性病变中p53蛋白的表达及其与AgNOR的相关性。
1 材料和方法
1.1 材料来源 收集本院近年来手术切除和纤维支气管镜活检病理证实标本75例。取材后用10%福尔马林固定，石腊包埋，制成4～5 um厚切片，经HE染色组织学观察。肺癌组45例：鳞状细胞癌20例，腺癌14例，大细胞未分化癌4例，小细胞未分化癌7例。对照组30例：其中肺结核18例，炎性假瘤8例，支气扩张4例。
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1.2 免疫组织化学染色 采用链霉素亲生物素-过氧化物酶免疫组化方法(S-P)。S-P试剂盒为Maxin公司产品。p53蛋白的单克隆抗体Do-7为美国DAKD公司产品，操作方法按S-P试剂盒说明步骤进行。以细胞呈棕色为阳性。同时设以PBS代替一抗作空白对照，用已知阳性切片作阳性对照。
1.3 AgNOR染色 将配制好的胶体银染色液(将明胶溶于1%甲酸中，浓度为2%，再与50%的硝酸银(按1∶2混合而成)滴于切片上，染色在恒温箱内进行(避光、调温)，温度控制在30 ℃，时间30 min。经水洗、脱水、透明后树胶封片。将切片置于多功能医用图像工作站(德中贸易有限公司2000型)光镜下观察，用彩色480线性CCD摄相机采集图像，通过计算机图像分析，将每例计数100个细胞再换算成每个细胞核内AgNOR颗粒的均数，采用t检验作统计学处理。
2 结果
2.1 免疫组化染色结果 p53蛋白在各型肺癌组织细胞中表达情况见附表(封四图1)。总阳性率为80%，肺部良性病变组织呈阴性。根据染色、阳性细胞的部位p53蛋白存在三种分布形态：细胞核型、细胞浆型、细胞膜型。
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图1 肺癌组织p53蛋白的表达(SP组化×400)
附表 p53蛋白在各型肺癌组织细胞中的表达(例，%) 组织学类型
n
阳性
核阳性
胞浆阳性
膜阳性
阳性率
鳞状细胞癌
20
17
6(35.29)
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10(58.82)
1(5.88)
85.00
腺 癌
14
11
4(36.36)
7(63.64)
0(0)
78.57
大细胞癌
4
3
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1(33.33)
2(66.67)
0(0)
75.00
小细胞癌
7
5
2(40.00)
3(60.00)
0(0)
71.42
合 计
45
, 百拇医药
36
13(36.12)
22(61.11)
1(2.77)
80.00
2.2 p53蛋白表达与AgNOR关系 显微镜下p53蛋白表达阳性的癌组织中，细胞核内均见呈黑色的AgNOR颗粒，其形态以核仁状、不规则状为多见，颗粒细小。每核7～12个，多达20个，总颗粒均数(9.63±0.70)(见封四图2)。部分p53表达阴性的肺癌组织中，癌细胞核内仍可见AgNOR颗粒，每核4～8个，总颗粒均数(6.42±0.35)。而肺部良性病变组织中细胞核内AgNOR颗粒较大，呈圆型，界线清晰，多位于核中央，每核颗粒在1～3个之间(见封四图3)，总颗粒均数为(1.92±0.29)，与p53蛋白表达阳性比较差异有显著性(P<0.01)。
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图2 肺癌标本细胞核AgNOR分布(银染×400)
图3 肺部良性病变细胞核AgNOR分布(银染×200)
3 讨论
近年来人们从分子生物学探讨肿瘤的发生过程，发现了许多肿瘤基因和肿瘤抑制基因的变异参与这个过程的不同阶段，原癌基因ras和抑制基因p53的变化在细胞癌变过程中起关键作用，特别是抑癌基因p53在人类恶性肿瘤中的检出，显示出它的广谱泛瘤性和稳定性[2]。
p53基因是53kD的核内磷蛋白，在正常细胞中与细胞周期的调节有关，最近将p53基因蛋白分为野生型(wildtype)及突变型(mutant)，前者由于半衰期短在正常细胞中含量低，用免疫组化方法难以检出，当p53基因发生点突变时，p53蛋白构象改变，稳定性增强，且能与一些癌蛋白形成稳定的复合物，使半衰期大大延长，含量比正常增多，显示表达增强。因此免疫组织化学方法检测到的是突变型p53蛋白[3]。本文用免疫组织化学法检测p53蛋白在45例肺癌组织中的过度表达阳性率为80%，其中鳞状细胞癌为85%，腺癌为78.57%，大、小细胞癌为75%和71.42%，与姜奕等[4]报道相近。肺部良性病变及正常支气管粘膜上皮为阴性。这进一步表明p53表达是肺癌的肿瘤标志物之一。观察各类肺癌p53蛋白染色阳性在细胞的部位情况，可见突变型p53可以同时存在于细胞核和细胞浆中，但各类肺癌在不同部位所占的比例不同。在细胞核中，腺癌占36.36%，鳞状上皮细胞癌占35.29%，大、小细胞癌分别占33.33%和40.00%，而细胞浆中表现阳性者平均达61.11%。因此有人认为细胞浆内p53蛋白过度表达具有更高的恶性度，因为正常细胞浆内p53分子较少，不能用免疫组织化学法检出[5]。
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AgNOR是同rRNA转录密切相关的一种酸性蛋白[6]，具有较强的嗜银性，它可以反应细胞的转录活性及蛋白质合成的活跃状态。因此，研究AgNOR的数目可为研究细胞增生和分化的基因调控提供信息。文献报道[7]，AgNOR数量随着肿瘤恶性程度增加而增加，肿瘤的恶性程度越高，细胞转录活性及蛋白质合成就越活跃，但不能区别肺癌细胞的类型。本文结果表明，p53蛋白表达阳性的癌组织中，AgNOR颗粒均数明显高于对照组，并证实p53蛋白表达与AgNOR检测呈正相关。在一些p53阴性的肺癌病例中，AgNOR计数均值仍高于对照组，可能这一部分肺癌p53基因丢失或未发生突变所致，尚需进一步研究证实。
笔者认为，抑癌基因p53突变可能是导致肿瘤增生异常活跃的因素之一，在肺癌发生中是一种比较常见的基因改变，在肺癌组织中表达的阳性率高，为肺癌细胞的肿瘤标志物之一，可作为肺癌诊断的一个参考指标。在肺部良、恶性病变AgNOR定量与p53蛋白表达呈正相关，这对于某些p53阴性肺肿瘤，同时结合AgNOR检测对其诊断有很大意义。
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参考文献
1 鄢淑琴.核仁形成体区及其在肿瘤研究中的价值.肿瘤防治研究，1991，18(4)：260
2 战忠利，梁 莉，张连郁，等.肺未分化癌p53基因蛋白的表达和预后相关性的研究.中国肿瘤临床，1995，22(12)：876
3 Harris CC,Hollstein M.Clinical implications of the p53 tumor suppressor gene.N Engl J Med,1993,329:1318
4 姜 奕，何安光，戴晓淳.肺癌抑癌基因p53产物的免疫组织化学研究.中华结核和呼吸杂志，1994，17(1)：45
5 Iggo R,Gatter K,Bartek J,et al.Increased expression of mutant forms of p53 oncogene in primary lung cancer.Lancet,1990,335:675
6 Editori Al.Nucleolar organizer regions as diagnostic diacriminants for malignancy.J Pathol,1988,155(1):95
7 张 平，蒋太山，谌三祥.原发性肺癌核仁组成区定量分析及临床意义.衡阳医学院学报，1992，20(4)：388
(19980717 收稿), 百拇医药