聚合酶链反应检测革兰阴性细菌16S rRNA
作者：李聪智 谭德明
单位：湖南医科大学附属湘雅医院(长沙 410008)
关键词：细菌分型技术；聚合酶链反应；基因，结构，细菌
湖南医学990203 摘 要
【目的】寻找诊断细菌感染病原更为敏感和有效的方法。【方法】根据细菌16S rRNA基因的高度保守性，设计合成革兰阴性细菌的共同引物，采用聚合酶链反应检测已知的革兰阴性细菌9株，革兰阳性菌4株。【结果】革兰阴性菌检测阳性率为100%，(检测革兰阳性细菌4株结果均为阴性)。采用倍比稀释法检出大肠杆菌的最低浓度为4 CFU/ml。【结论】所用引物具有良好的特异性和敏感性，能达到初步鉴定细菌种属的目的。
16S rRNA Gene Detection of Gram-negative Bacteria by PCR
, 百拇医药
LI Congzhi， TAN Deming
Department of Infectious Diseases,Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha,410008
Abstract
【Objective】To find out a sensitive and effective method for diagnosis of pathogens in bacterial infection.【Methods】According to the highly conservative nature of bacteria 16S rRNA gene,a set of primers with broad range for Gram-negative bacteria was designed.Nine known strains of Gram-negative bacteria were detected by polymerase chain reaction(PCR).【Results】All 9 strains of Gram-negative bacteria were positive,while 4 strains of Gram-positive were negative.The lowest concentration of Escherichia coli detected by serial dilution was 4 CFU/ml.【Conclusions】This set of PCR primers with broad range has high specificity and sensitivity,achieving a preliminary identification of bacteria species.
, 百拇医药
Key words bacterial typing techniques; polymerase chain reaction; genes,structural,bacterial;
目前对细菌感染病原诊断的主要方法为细菌培养，但存在费时及阳性率低的情况[1]，影响其早期诊断及抗生素的及时、有效使用。细菌16S rRNA基因具有高度保守性，不同科、种、属间的细菌16S rRNA基因同源性达97%以上[2]。根据这一特性，作者设计合成革兰阴性细菌共同引物，用于聚合酶链反应，旨在探索细菌感染病原诊断更为敏感和有效的方法。
1 材料与方法
1.1 引物的设计合成 选择革兰阴性细菌16S rRNA基因核苷酸保守区，设计合成一对共同引物，引物序列：顺义、5′-GCATCAGGTCAAGTCATC-3′(1167-1184),反义、5′-CCCGGCTTCGTATTCAC-3′(1351-1392)，扩增片段大小约225个碱基。引物由上海细胞生物学研究所癌基因室合成。
, 百拇医药
1.2 菌株 检测细菌13株，革兰阴性细菌9株，革兰阳性菌4株。细菌由本院交叉感染科及湖南医科大学微生物学教研室提供。
1.3 细菌DNA提取 挑取菌落于100 μl无菌亚沸水中混匀，反复冻融3次，加200 μl裂解液(0.1% SDS；20 mM EDTA；150 mM NaCl；50 mM Tris-Cl pH 8.0；溶菌酶100 μg),混匀后置37 ℃下30 min，加蛋白酶K 40 μg ,混匀后置37 ℃下30 min，煮沸5 min，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液(溶积比例为25∶24∶1)，15 000 r/min 离心10 min，取上清液加入2倍体积无水乙醇、1/10体积3M醋酸钠、15 μl TRNA(2 mg/ml)、RNA酶100 μg ，混匀后置-20 ℃下2 h，置4 ℃下15 000 r/min 离心20 min，沉淀物用70%冷乙醇洗1次，去掉上清液，沉淀物干燥后用20 μl无菌亚沸水溶解后备用。
1.4 DNA扩增及产物分析 取上述DNA液10 μl加PCR混合液(10×PCR缓冲液5 μl，10 mM dNTP 1 μl，TaqDNA聚合酶5 U，顺义引物和反义引物各25 pmol)，加无菌亚沸水至总体积为50 μl，混匀后加无菌石蜡油2滴，置PCR扩增仪按94 ℃下30 s，55 ℃下1 min，72 ℃下1 min，循环30次，最后置72 ℃下7 min完成扩增。取PCR产物9 μl于2.5%琼脂糖电泳,紫外灯下观察结果。1.5 敏感性检测 按倍比稀释法将大肠杆菌悬液依次稀释成102，103，104，105，106，107，108，109，取上述细菌悬液500 μl倒入营养琼脂培养皿中培养过夜，计算各稀释度菌落数，分别对上述各种稀释度的细菌悬液进行PCR扩增，方法同前。
, 百拇医药
2 结果
2.1 PCR的扩增 PCR法共检测细菌13株，革兰阴性细菌9株，其中大肠杆菌2株，不动杆菌、变形杆菌、克雷伯杆菌、福氏痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒甲杆菌、绿脓杆菌各1株。上述细菌样本经扩增后，其获得的PCR产物在琼脂糖上电泳为225碱基的核酸带。同样的方法检测革兰阳性细菌4株，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌各1株，结果均为阴性(图1)。
图1 M为PGEM-3ZF(+)HaeⅢ Markers；1、4、5、7、8、9、10号标本为革兰阴性细菌，结果为阳性；2、3号标本为革兰阳性细菌，结果为阴性；6号标本为阴性对照，扩增片段225 bp
2.2 PCR检测的敏感性 对各个不同稀释度大肠杆菌悬液的培养结果所对应的细菌数分别为82×107 ；32×105 ；56×103；408；31；4；2；0。对上述不同稀释度大肠杆菌悬液经PCR扩增在102～107之间时结果仍为阳性，按此最低稀释度107计算细菌数为4CFU/ml(图2)。
, 百拇医药
图2 倍比稀释法检测大肠杆菌：M为PGEM-3ZF(+)HaeⅢ Markers；1、2、3、5、6、7、8、9号标本依次稀释倍数为102、103、104、105、106、107、108、109；至107以前为阳性，8、9号标本为阴性，4号标本为阴性对照
3 讨论
近来随着分子生物学和基因诊断技术的不断改进，在分子水平检测微生物，是感染性疾病诊断的飞跃。PCR扩增为临床提供了早期、快速和敏感的检测手段[3]。据报道该法检测细菌最低浓度为0.3 CFU/ml[4]，而细菌培养所需最低细菌数为105 CFU/ml[5]，但PCR一般是对单种细菌进行有目的扩增，而在病原菌未明的情况下，难以做到遂一检测。细菌16 Sr RNA基因核苷酸序列具有高度保守性，其核苷酸片段长度适宜，但它的保守性又是相对的，在保守区之间存在9～10个变异区[6]，不同科、种、属间都具有一定的变异。基于这一特性，选择革兰阴性细菌16S rRNA基因保守区设计合成其共同引物，用于对该类细菌的检测。本文结果显示，使用这对革兰阴性细菌引物扩增该类细菌可获得大小约225个碱基的特异性片段，而对革兰阳性细菌则扩增结果为阴性。通过倍比稀释法PCR检出细菌最低浓度为4 CFU/ml，比报道中的细菌培养敏感性高，PCR检测细菌阳性率明显高于细菌培养阳性。本资料表明，使用这对引物具有特异性及敏感性高的特点，能初步达到鉴定细菌种属的目的，为临床诊断及选用合适的抗生素提供一些帮助。但环境中的细菌无处不在，在临床应用中如何控制细菌污染是关键措施。严格无菌操作，选择恰当的扩增循环次数，作好DNA提取、扩增和产物分析的隔离以及一次性吸头的使用等各项措施，可提高诊断的正确性和可靠性。
, 百拇医药
参考文献
1 Bingen EN，Lambert-Zechovske,P Mariani-kurkdjiav C，et al.Bacterial counts in cerebrospinal fluid of children with meningitis.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，1990，9(1):278～281
2 Jonas D，Rosenbaum A，Weyrich S，et al.Enzyme-linked immunoassay for detection of PCR-amplified DAN of legionellae in bronchoaveolar fluid.J Clin Microbiol，1995，33(5):1247～1257
3 Teng K，Li M，Yu W，et al.Comparison of PCR with culture for detection of ureaplasma urealyticum in clinical samples from patients with urogenited infections.J Clin Microbiol，1994，32(9):2232～2234
, 百拇医药
4 Yamamoto H，Hashimoto Y，Ezaki t.Comparison of detection methods for legionella species in environmental water by colony isolation fluorescent antibody staining and polymerase chain reaction. Microbiol Immunol，1993，37(2): 617～622
5 Leonard J，lascolea JR，Ddryja D.Quatitation of bacterial in cerebrospinal fluid and blood of children with meningitis and its diagnostic significance.J Clin Microbiol，1984，19(2):187～190
6 Dauga CF，Grimont PAD，Grimont.Nucleotide sequences of 16S rRNA from ten serratia species.Microbiology，1990，141(4):1139～1149
(19980526 收稿), 百拇医药
单位：湖南医科大学附属湘雅医院(长沙 410008)
关键词：细菌分型技术；聚合酶链反应；基因，结构，细菌
湖南医学990203 摘 要
【目的】寻找诊断细菌感染病原更为敏感和有效的方法。【方法】根据细菌16S rRNA基因的高度保守性，设计合成革兰阴性细菌的共同引物，采用聚合酶链反应检测已知的革兰阴性细菌9株，革兰阳性菌4株。【结果】革兰阴性菌检测阳性率为100%，(检测革兰阳性细菌4株结果均为阴性)。采用倍比稀释法检出大肠杆菌的最低浓度为4 CFU/ml。【结论】所用引物具有良好的特异性和敏感性，能达到初步鉴定细菌种属的目的。
16S rRNA Gene Detection of Gram-negative Bacteria by PCR
, 百拇医药
LI Congzhi， TAN Deming
Department of Infectious Diseases,Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha,410008
Abstract
【Objective】To find out a sensitive and effective method for diagnosis of pathogens in bacterial infection.【Methods】According to the highly conservative nature of bacteria 16S rRNA gene,a set of primers with broad range for Gram-negative bacteria was designed.Nine known strains of Gram-negative bacteria were detected by polymerase chain reaction(PCR).【Results】All 9 strains of Gram-negative bacteria were positive,while 4 strains of Gram-positive were negative.The lowest concentration of Escherichia coli detected by serial dilution was 4 CFU/ml.【Conclusions】This set of PCR primers with broad range has high specificity and sensitivity,achieving a preliminary identification of bacteria species.
, 百拇医药
Key words bacterial typing techniques; polymerase chain reaction; genes,structural,bacterial;
目前对细菌感染病原诊断的主要方法为细菌培养，但存在费时及阳性率低的情况[1]，影响其早期诊断及抗生素的及时、有效使用。细菌16S rRNA基因具有高度保守性，不同科、种、属间的细菌16S rRNA基因同源性达97%以上[2]。根据这一特性，作者设计合成革兰阴性细菌共同引物，用于聚合酶链反应，旨在探索细菌感染病原诊断更为敏感和有效的方法。
1 材料与方法
1.1 引物的设计合成 选择革兰阴性细菌16S rRNA基因核苷酸保守区，设计合成一对共同引物，引物序列：顺义、5′-GCATCAGGTCAAGTCATC-3′(1167-1184),反义、5′-CCCGGCTTCGTATTCAC-3′(1351-1392)，扩增片段大小约225个碱基。引物由上海细胞生物学研究所癌基因室合成。
, 百拇医药
1.2 菌株 检测细菌13株，革兰阴性细菌9株，革兰阳性菌4株。细菌由本院交叉感染科及湖南医科大学微生物学教研室提供。
1.3 细菌DNA提取 挑取菌落于100 μl无菌亚沸水中混匀，反复冻融3次，加200 μl裂解液(0.1% SDS；20 mM EDTA；150 mM NaCl；50 mM Tris-Cl pH 8.0；溶菌酶100 μg),混匀后置37 ℃下30 min，加蛋白酶K 40 μg ,混匀后置37 ℃下30 min，煮沸5 min，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液(溶积比例为25∶24∶1)，15 000 r/min 离心10 min，取上清液加入2倍体积无水乙醇、1/10体积3M醋酸钠、15 μl TRNA(2 mg/ml)、RNA酶100 μg ，混匀后置-20 ℃下2 h，置4 ℃下15 000 r/min 离心20 min，沉淀物用70%冷乙醇洗1次，去掉上清液，沉淀物干燥后用20 μl无菌亚沸水溶解后备用。
1.4 DNA扩增及产物分析 取上述DNA液10 μl加PCR混合液(10×PCR缓冲液5 μl，10 mM dNTP 1 μl，TaqDNA聚合酶5 U，顺义引物和反义引物各25 pmol)，加无菌亚沸水至总体积为50 μl，混匀后加无菌石蜡油2滴，置PCR扩增仪按94 ℃下30 s，55 ℃下1 min，72 ℃下1 min，循环30次，最后置72 ℃下7 min完成扩增。取PCR产物9 μl于2.5%琼脂糖电泳,紫外灯下观察结果。1.5 敏感性检测 按倍比稀释法将大肠杆菌悬液依次稀释成102，103，104，105，106，107，108，109，取上述细菌悬液500 μl倒入营养琼脂培养皿中培养过夜，计算各稀释度菌落数，分别对上述各种稀释度的细菌悬液进行PCR扩增，方法同前。
, 百拇医药
2 结果
2.1 PCR的扩增 PCR法共检测细菌13株，革兰阴性细菌9株，其中大肠杆菌2株，不动杆菌、变形杆菌、克雷伯杆菌、福氏痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒甲杆菌、绿脓杆菌各1株。上述细菌样本经扩增后，其获得的PCR产物在琼脂糖上电泳为225碱基的核酸带。同样的方法检测革兰阳性细菌4株，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌各1株，结果均为阴性(图1)。
图1 M为PGEM-3ZF(+)HaeⅢ Markers；1、4、5、7、8、9、10号标本为革兰阴性细菌，结果为阳性；2、3号标本为革兰阳性细菌，结果为阴性；6号标本为阴性对照，扩增片段225 bp
2.2 PCR检测的敏感性 对各个不同稀释度大肠杆菌悬液的培养结果所对应的细菌数分别为82×107 ；32×105 ；56×103；408；31；4；2；0。对上述不同稀释度大肠杆菌悬液经PCR扩增在102～107之间时结果仍为阳性，按此最低稀释度107计算细菌数为4CFU/ml(图2)。
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图2 倍比稀释法检测大肠杆菌：M为PGEM-3ZF(+)HaeⅢ Markers；1、2、3、5、6、7、8、9号标本依次稀释倍数为102、103、104、105、106、107、108、109；至107以前为阳性，8、9号标本为阴性，4号标本为阴性对照
3 讨论
近来随着分子生物学和基因诊断技术的不断改进，在分子水平检测微生物，是感染性疾病诊断的飞跃。PCR扩增为临床提供了早期、快速和敏感的检测手段[3]。据报道该法检测细菌最低浓度为0.3 CFU/ml[4]，而细菌培养所需最低细菌数为105 CFU/ml[5]，但PCR一般是对单种细菌进行有目的扩增，而在病原菌未明的情况下，难以做到遂一检测。细菌16 Sr RNA基因核苷酸序列具有高度保守性，其核苷酸片段长度适宜，但它的保守性又是相对的，在保守区之间存在9～10个变异区[6]，不同科、种、属间都具有一定的变异。基于这一特性，选择革兰阴性细菌16S rRNA基因保守区设计合成其共同引物，用于对该类细菌的检测。本文结果显示，使用这对革兰阴性细菌引物扩增该类细菌可获得大小约225个碱基的特异性片段，而对革兰阳性细菌则扩增结果为阴性。通过倍比稀释法PCR检出细菌最低浓度为4 CFU/ml，比报道中的细菌培养敏感性高，PCR检测细菌阳性率明显高于细菌培养阳性。本资料表明，使用这对引物具有特异性及敏感性高的特点，能初步达到鉴定细菌种属的目的，为临床诊断及选用合适的抗生素提供一些帮助。但环境中的细菌无处不在，在临床应用中如何控制细菌污染是关键措施。严格无菌操作，选择恰当的扩增循环次数，作好DNA提取、扩增和产物分析的隔离以及一次性吸头的使用等各项措施，可提高诊断的正确性和可靠性。
, 百拇医药
参考文献
1 Bingen EN，Lambert-Zechovske,P Mariani-kurkdjiav C，et al.Bacterial counts in cerebrospinal fluid of children with meningitis.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，1990，9(1):278～281
2 Jonas D，Rosenbaum A，Weyrich S，et al.Enzyme-linked immunoassay for detection of PCR-amplified DAN of legionellae in bronchoaveolar fluid.J Clin Microbiol，1995，33(5):1247～1257
3 Teng K，Li M，Yu W，et al.Comparison of PCR with culture for detection of ureaplasma urealyticum in clinical samples from patients with urogenited infections.J Clin Microbiol，1994，32(9):2232～2234
, 百拇医药
4 Yamamoto H，Hashimoto Y，Ezaki t.Comparison of detection methods for legionella species in environmental water by colony isolation fluorescent antibody staining and polymerase chain reaction. Microbiol Immunol，1993，37(2): 617～622
5 Leonard J，lascolea JR，Ddryja D.Quatitation of bacterial in cerebrospinal fluid and blood of children with meningitis and its diagnostic significance.J Clin Microbiol，1984，19(2):187～190
6 Dauga CF，Grimont PAD，Grimont.Nucleotide sequences of 16S rRNA from ten serratia species.Microbiology，1990，141(4):1139～1149
(19980526 收稿), 百拇医药