骨组织工程中骨髓基质细胞的定向分化
作者：胡罢生 魏宽海 裴国献
单位：第一军医大学南方医院创伤骨科，广州，510515
关键词：骨组织工程；骨髓基质细胞；基因转染；成骨细胞
摘要摘要：骨组织工程中成骨细胞有四种来源：骨、骨外膜、骨髓和骨外组织，其中以骨髓为最优。因为骨髓基质细胞具有多向分化潜能，因此有必要选择最佳的培养条件来促进其增殖并定向分化为成骨细胞。可通过使用物理、化学和生物等多种手段来达到此目的，其中以BMP、b-FGF和TGF-β的作用最为显著和直接。也可将各种生长因子的基因转入骨髓基质细胞，使其稳定有效地表达，通过自分泌和旁分泌作用来达到同样的目的。
中图分类号：R683
将组织工程方法应用于临床已成为骨缺损修复的趋势。组织工程全过程包括种子细胞的选择和培养、种子细胞和生物材料复合后联合培养、复合体植入体内三个步骤。其中，种子细胞的获取和培养无疑是基础和最为重要的环节。
, 百拇医药
理想的骨组织工程种子细胞应具备下列特点：(1)取材容易，对机体的损伤小。(2)在体外培养过程中具有较强的传代繁殖能力并易定向分化为成骨细胞。(3)植入机体后能适应受区的环境并保持成骨活性。目前，作为种子细胞的成骨细胞有4种来源：骨、骨外膜、骨髓和骨外组织。综合相比之下，以骨髓为最优[1]。
骨髓分造血和基质两大系统，其成骨能力来源于基质系统。骨髓基质细胞具有多向分化潜能，可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、网状细胞和肌细胞等多方向转化。Friedenstein等[2]研究表明，从鼠骨髓悬液中得到的细胞克隆异位植入后仅有30%成骨，并且在成骨的样品中只有50%产生含有功能性骨髓的骨，其余集落形成结缔组织或没有任何组织形成。出现这种情况主要是因为骨髓内确定性骨祖细胞(DOPC)数量有限。研究表明：从骨髓内得到的有核细胞数为(46±32)109/L吸出物，而其中碱性磷酸酶(ALP)阳性细胞数仅约为有核细胞数的4.3×10-5，且数量随供体年龄增大而减少[3]。用ALP抗体与细胞孵育后，用流式细胞仪将细胞分离为ALP强阳性、弱阳性和阴性三类，发现ALP强阳性的细胞中DOPC的量为原始骨髓的2～100倍[4]。但用这种方法提纯细胞将丢失将近50%的DOPC，而从一个部位每次骨髓的抽出量不应超过2 ml，否则将因吸出物中血量的增加而引起有核细胞数明显减少[5]。所以，用流式细胞仪来纯化细胞的方法不可取。
, 百拇医药
因此，为了提高骨髓的成骨效率,有必要选择合适的培养条件，以促进骨髓基质细胞分裂增殖并定向分化为确定性骨祖细胞。可通过使用物理、化学和生物等多种手段来达到此目的。而其中以生物因素的作用最为显著和直接。生物因素的调节作用包括全身性调节和局部调节两大方面。前者主要包括钙磷调节激素、维生素和β-甘油磷酸钠等；后者为各种细胞因子，包括骨生长因子(SGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、转化生长因子-β(TGF-β)、酸性和碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)肿瘤坏死因子(TNF)、白介素和造血因子(G-CSF、GM-CSF)等。
全身性因素中，各自的调节效果不一。地塞米松作用后，骨髓基质细胞ALP活性增强，骨钙素、骨涎蛋白和骨桥蛋白的合成均明显增加，但4周后，只有ALP活性增加，其它几种蛋白质的合成则下降。说明地塞米松可促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化，早期以促进基质合成为主，后期以促进钙化为主[6]。但是，地塞米松在促进成骨的同时，能激活骨髓基质细胞表面的糖皮质激素受体，使其向脂肪细胞分化，从而会减少向DOPC分化的相对比例[7]。1,25-(OH)2VitD3在促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化的同时，可抑制其向脂肪细胞转化。这主要是因为1,25-(OH)2VitD3通过降低脂肪细胞晚期基因标志物：ap2和脂肪的mRNA水平而抑制由糖皮质激素诱导的脂肪生成[8]。如果在取骨髓前短期使用大剂量的1，25-(OH)2VitD3，可大大促进骨髓基质细胞转化为成骨细胞，从而显著提高吸出物中的成骨细胞量[9]。
, 百拇医药
维生素C促进体外培养细胞合成胶原，形成钙化，亦能调节ATP及ALP活性，并影响其合成[10]。β-甘油磷酸钠可提供磷离子作为碱性磷酸酶的底物，从而加速结节钙化。
局部调节因素中，各种因子的作用不一。现就较为重要且研究较多的几种因子加以介绍。
1 骨形态发生蛋白(BMP)
通常认为BMP来源于骨及骨源性细胞，是骨代谢的旁分泌产物，也是特异性的骨生长因子。BMP的靶细胞为血管周围具有分化能力的间充质细胞，靶细胞在吞噬了BMP后，在结构和功能上发生变化，定向分化为不同功能特点的成骨细胞，再通过软骨内成骨或膜内成骨形成新骨。骨髓基质细胞也为未分化的间充质细胞，BMP可使骨髓基质细胞增殖减慢，但促进向成骨细胞分化。具体表现为分泌活动增强：碱性磷酸酶的mRNA水平及活性增高，骨桥蛋白、骨涎蛋白、骨钙素和Ⅰ型胶原的mRNA水平及蛋白合成增加。更为有利的是，BMP在促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化的同时，可抑制其向其它细胞如脂肪细胞或骨骼肌细胞分化[11]。BMP为唯一具有异位成骨能力的生长因子，可诱导IOPC向DOPC分化。利用它的这种特性将其与细胞和材料复合后联合植入体内，可使总的成骨量增加。BMP对骨髓基质细胞的作用具有时间依赖性[12]和剂量依赖性。
, 百拇医药
2 转化生长因子-β(TGF-β)
TGF-β对骨髓基质细胞的作用基本倾向于作用效果和细胞种属及密度有关；与细胞的分化阶段有关，早期促进增殖、晚期促进分化；与它的剂量有关，低浓度时主要为促进增殖，并有轻微的诱导分化能力，高浓度时则为抑制增殖，促进分化[13]。TGF-β不仅能抑制骨髓基质细胞向脂肪细胞分化，而且对由糖皮质激素和b-FGF所诱导的骨髓基质细胞向脂肪细胞分化也有抑制作用[14]。TGF-β虽无异位成骨能力，但它能增加BMP诱导成骨的量。TGF-β主要通过促进间充质细胞分裂增殖，为BMP提供丰富的靶细胞；促进软骨细胞、骨细胞的分裂增殖；促进骨细胞产生Ⅰ型胶原，抑制软骨细胞产生Ⅱ型胶原；促进骨连接素、骨桥蛋白及ALP的合成；增强基质钙化以及对周围的成骨细胞的趋化作用等，而增加BMP的诱导成骨能力[15]。
3 碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)
, 百拇医药
b-FGF对骨髓基质细胞的作用也有争议，但主要认为它表现为促增殖作用。b-FGF作用后骨髓基质细胞ALP活性降低，细胞合成DNA加速，克隆直径增大。但是，b-FGF在促进增殖的同时，能维持骨髓基质细胞特殊的功能状态，即保持其成骨特性。Marth等[16]在含10% FBS的培养液中分别加入b-FGF、TGF-β、EGF、PDGF、IGF、GH和地塞米松各种因子进行比较，发现b-FGF 对骨髓基质细胞的作用效果最明显。b-FGF是一种毛细血管增殖刺激剂，能促进毛细血管向骨移植物中长入，加速需要血供的软骨内化骨，从而可增加成骨量，加快成骨速度[17]。使用b-FGF的主要缺点为，b-FGF能促进骨髓基质细胞转化为脂肪细胞，特别是与糖皮质激素联合应用时生成脂肪细胞的量更多。但这种缺点可通过和TGF-β联合应用而克服[15]。
因为各种因素各有其优缺点，所以目前倾向于多种因素联合使用或序贯使用。但最终目的无非是两个：(1)促进分裂增殖，增加细胞数量；(2)促进细胞向成骨细胞分化。联合使用，虽然可同时达到上述两个目的，但它们的效果也因相互作用而部分抵消。所以，以序贯使用不同因素为最好。国内外众多学者已经在这方面进行了许多尝试。Fromigue等[18]研究发现单独作用于骨髓基质细胞时，BMP-2促进分化，TGF-β2促进增殖；将BMP-2与TGF-β2联合使用，发现它们的作用部分相互抵消，都不如单独作用时明显。继而，他们通过两种途径来研究序贯方法，发现先用BMP-2作用9 d，会取消随后TGF-β2的促增殖作用；而先用TGF-β2处理10 d，不影响BMP-2的促分化作用。因此，在序贯使用多种因素时，应先使用促增殖的，后使用促分化的。
, 百拇医药
基因疗法的兴起和使用，给组织工程研究者一个启示：能否利用基因工程方法将各种生长因子的基因转入成骨细胞，使细胞在增殖分化的同时表达所需的生长因子，继而通过自分泌或旁分泌途径来进一步促进其增殖和分化。王宏训等[19]从骨膜中分离培养出成骨细胞，用脂质体转染技术将BMP-2基因转入，发现转染的成骨细胞可有效表达BMP-2。Lieberman等[20]通过腺病毒将BMP-2基因转入培养的骨髓基质细胞系中后，1周内可有效表达；在此基础上，他们将转染后的治疗性细胞与脱钙骨复合后植入骨缺损模型处，X线及组织观察均可见骨缺损修复，且新生骨为含有骨髓的正常骨结构。转入促进血管生成的物质，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)的基因可促进血管的长入，利于成骨和改善局部血液循环。使用转基因方法的关键环节在于，如何有效地对转入基因进行调控，使之在不同阶段能适时表达和适量表达，从而在达到最佳的效果的同时，又能防止不良结果(如过度增殖等)的发生。
到目前为止，还未形成一套理想的骨髓基质细胞的获取和培养方法。为满足组织工程安全性和可靠性的要求，需要使用新的技术与产品进行更有效的培养。如采用流动装置将培养由静态转为动态，以便能及时换液而有效地去除废物、供给营养等，而不仅仅是简单地加入各种生长因子。
, 百拇医药
参考文献
1 魏宽海，裴国献.组织工程化骨组织中成骨细胞来源的选择.国外医学·创伤与外科基本问题分册，1998，19(3)：155
2 Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gersimor UV et al. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet, 1987, 20(3): 263
3 Majors AK, Boehm CA, Nitto H et al. Characterization of human bone marrow stromal cells with respect to osteoblastic differentiation. J Orthop Res, 1997, 15(4): 546
, 百拇医药
4 Herbertson A, Aubin JE. Cell sorting enriches osteogenic population in rat bone marrow stromal cell cultures. Bone, 1997, 21(6): 491
5 Mudchler GF, Boehm C, Easley K et al. Aspiration to obtain osteoblast progenitor cells from human bone marrow: the influnce of aspiration volume. J Bone Joint Surg Am, 1997, 79(11): 1699
6 Cheng SL, Zhang SF, Avioli LV et al. Expression of bone matrix protein during dexamethasone-induced mineralization of human bone marrow stromal cells. J Cell Biochem, 1996, 61(2): 182
, 百拇医药
7 Yamaguchi T, Chattopadhyay N, Kifor O et al. Extracellular calcium (Ca2+(0))-sensing receptor in a murine bone marrow-derived stromal cell line (ST2): potential mediator of the actions of Ca2+(0) on the function of ST2 cells. Endocrinology, 1998, 139(8): 3561
8 Kelly KA, Gimble JM. 1,25-Dihydroxy vitamin D3 inhibits adipocyte differention and gene expression in murine bone marrow stromal cell clones and primary cultures. Endocrinology, 1998, 139(5): 2622
, http://www.100md.com
9 Erben RG, Scutt AM, Miao D et al. Short-term treatment of rats with high dose 1,25-Dihydroxy vitamin D3 stimulates bone formation and increases the number of osteoblast precursor cells in bone marrow. Endocrinology, 1997, 138(11): 4629
10 Maniatopoulos C, Sodek J, Melcher AH et al. Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Tissue Res,1998, 254:317
11 Wu X, Robinson CE, Fong HW et al. Analysis of the native murine bone morphogenetic protein serine threonine kinase type Ⅰ receptor (ALK-3). J Cell Physiol, 1996,168(2): 453
, 百拇医药
12 Puleo DA. Dependence of mesenchymal cell responses on duration of exposure to bone morphogenetic protein-2 in vitro. J Cell Physiol, 1997,173(1): 93
13 Bonewald LF, Mundy GR. Role of transforming growth beta in bone remodeling. Clin Orthop, 1990,250:261
14 Locklin RM, Williamson MC, Beresford JN et al. In vitro effects of growth factors and dexamethasone on rat marrow stromal cells. Clin Orthop, 1995,313:27
, 百拇医药
15 Mcdonald BR, Gowen M. Cytokines and bone. Br J Rheumat, 1992, 31(1):149
16 Marth I, Muraglia A, Campanile G et al. Fibroblasts growth factor-2 supports ex vivo expansion and maintenance of osteogenic precursors from human bone marrow. Endocrinology, 1997, 138(10): 4456
17 刘晋才.细胞因子与骨和软骨的修复.中华骨科杂志, 1998, 18(4):243
18 Fromigue O, Marie PJ, Lomri A. Bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta2 interact to modulate human bone marrow stromal cell proliferation and differentiation. J Cell Biochem, 1998, 68(4): 411
19 王宏训,朱盛修,乔 健. 骨膜成骨细胞分离培养及其BMP-2 cDNA基因转染的初步研究. 中华显微外科杂志, 1996, 19(4):273
20 Lieberman JR, Le LQ, Wu L et al. Reginal gene therapy with a BMP-2-producing murine stromal cell line induces heterotopic and orthotopic bone formation in rodents. J Orthop Res. 1998,16(3): 330
(收稿日期：1998-11-09), 百拇医药
单位：第一军医大学南方医院创伤骨科，广州，510515
关键词：骨组织工程；骨髓基质细胞；基因转染；成骨细胞
摘要摘要：骨组织工程中成骨细胞有四种来源：骨、骨外膜、骨髓和骨外组织，其中以骨髓为最优。因为骨髓基质细胞具有多向分化潜能，因此有必要选择最佳的培养条件来促进其增殖并定向分化为成骨细胞。可通过使用物理、化学和生物等多种手段来达到此目的，其中以BMP、b-FGF和TGF-β的作用最为显著和直接。也可将各种生长因子的基因转入骨髓基质细胞，使其稳定有效地表达，通过自分泌和旁分泌作用来达到同样的目的。
中图分类号：R683
将组织工程方法应用于临床已成为骨缺损修复的趋势。组织工程全过程包括种子细胞的选择和培养、种子细胞和生物材料复合后联合培养、复合体植入体内三个步骤。其中，种子细胞的获取和培养无疑是基础和最为重要的环节。
, 百拇医药
理想的骨组织工程种子细胞应具备下列特点：(1)取材容易，对机体的损伤小。(2)在体外培养过程中具有较强的传代繁殖能力并易定向分化为成骨细胞。(3)植入机体后能适应受区的环境并保持成骨活性。目前，作为种子细胞的成骨细胞有4种来源：骨、骨外膜、骨髓和骨外组织。综合相比之下，以骨髓为最优[1]。
骨髓分造血和基质两大系统，其成骨能力来源于基质系统。骨髓基质细胞具有多向分化潜能，可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、网状细胞和肌细胞等多方向转化。Friedenstein等[2]研究表明，从鼠骨髓悬液中得到的细胞克隆异位植入后仅有30%成骨，并且在成骨的样品中只有50%产生含有功能性骨髓的骨，其余集落形成结缔组织或没有任何组织形成。出现这种情况主要是因为骨髓内确定性骨祖细胞(DOPC)数量有限。研究表明：从骨髓内得到的有核细胞数为(46±32)109/L吸出物，而其中碱性磷酸酶(ALP)阳性细胞数仅约为有核细胞数的4.3×10-5，且数量随供体年龄增大而减少[3]。用ALP抗体与细胞孵育后，用流式细胞仪将细胞分离为ALP强阳性、弱阳性和阴性三类，发现ALP强阳性的细胞中DOPC的量为原始骨髓的2～100倍[4]。但用这种方法提纯细胞将丢失将近50%的DOPC，而从一个部位每次骨髓的抽出量不应超过2 ml，否则将因吸出物中血量的增加而引起有核细胞数明显减少[5]。所以，用流式细胞仪来纯化细胞的方法不可取。
, 百拇医药
因此，为了提高骨髓的成骨效率,有必要选择合适的培养条件，以促进骨髓基质细胞分裂增殖并定向分化为确定性骨祖细胞。可通过使用物理、化学和生物等多种手段来达到此目的。而其中以生物因素的作用最为显著和直接。生物因素的调节作用包括全身性调节和局部调节两大方面。前者主要包括钙磷调节激素、维生素和β-甘油磷酸钠等；后者为各种细胞因子，包括骨生长因子(SGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、转化生长因子-β(TGF-β)、酸性和碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)肿瘤坏死因子(TNF)、白介素和造血因子(G-CSF、GM-CSF)等。
全身性因素中，各自的调节效果不一。地塞米松作用后，骨髓基质细胞ALP活性增强，骨钙素、骨涎蛋白和骨桥蛋白的合成均明显增加，但4周后，只有ALP活性增加，其它几种蛋白质的合成则下降。说明地塞米松可促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化，早期以促进基质合成为主，后期以促进钙化为主[6]。但是，地塞米松在促进成骨的同时，能激活骨髓基质细胞表面的糖皮质激素受体，使其向脂肪细胞分化，从而会减少向DOPC分化的相对比例[7]。1,25-(OH)2VitD3在促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化的同时，可抑制其向脂肪细胞转化。这主要是因为1,25-(OH)2VitD3通过降低脂肪细胞晚期基因标志物：ap2和脂肪的mRNA水平而抑制由糖皮质激素诱导的脂肪生成[8]。如果在取骨髓前短期使用大剂量的1，25-(OH)2VitD3，可大大促进骨髓基质细胞转化为成骨细胞，从而显著提高吸出物中的成骨细胞量[9]。
, 百拇医药
维生素C促进体外培养细胞合成胶原，形成钙化，亦能调节ATP及ALP活性，并影响其合成[10]。β-甘油磷酸钠可提供磷离子作为碱性磷酸酶的底物，从而加速结节钙化。
局部调节因素中，各种因子的作用不一。现就较为重要且研究较多的几种因子加以介绍。
1 骨形态发生蛋白(BMP)
通常认为BMP来源于骨及骨源性细胞，是骨代谢的旁分泌产物，也是特异性的骨生长因子。BMP的靶细胞为血管周围具有分化能力的间充质细胞，靶细胞在吞噬了BMP后，在结构和功能上发生变化，定向分化为不同功能特点的成骨细胞，再通过软骨内成骨或膜内成骨形成新骨。骨髓基质细胞也为未分化的间充质细胞，BMP可使骨髓基质细胞增殖减慢，但促进向成骨细胞分化。具体表现为分泌活动增强：碱性磷酸酶的mRNA水平及活性增高，骨桥蛋白、骨涎蛋白、骨钙素和Ⅰ型胶原的mRNA水平及蛋白合成增加。更为有利的是，BMP在促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化的同时，可抑制其向其它细胞如脂肪细胞或骨骼肌细胞分化[11]。BMP为唯一具有异位成骨能力的生长因子，可诱导IOPC向DOPC分化。利用它的这种特性将其与细胞和材料复合后联合植入体内，可使总的成骨量增加。BMP对骨髓基质细胞的作用具有时间依赖性[12]和剂量依赖性。
, 百拇医药
2 转化生长因子-β(TGF-β)
TGF-β对骨髓基质细胞的作用基本倾向于作用效果和细胞种属及密度有关；与细胞的分化阶段有关，早期促进增殖、晚期促进分化；与它的剂量有关，低浓度时主要为促进增殖，并有轻微的诱导分化能力，高浓度时则为抑制增殖，促进分化[13]。TGF-β不仅能抑制骨髓基质细胞向脂肪细胞分化，而且对由糖皮质激素和b-FGF所诱导的骨髓基质细胞向脂肪细胞分化也有抑制作用[14]。TGF-β虽无异位成骨能力，但它能增加BMP诱导成骨的量。TGF-β主要通过促进间充质细胞分裂增殖，为BMP提供丰富的靶细胞；促进软骨细胞、骨细胞的分裂增殖；促进骨细胞产生Ⅰ型胶原，抑制软骨细胞产生Ⅱ型胶原；促进骨连接素、骨桥蛋白及ALP的合成；增强基质钙化以及对周围的成骨细胞的趋化作用等，而增加BMP的诱导成骨能力[15]。
3 碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)
, 百拇医药
b-FGF对骨髓基质细胞的作用也有争议，但主要认为它表现为促增殖作用。b-FGF作用后骨髓基质细胞ALP活性降低，细胞合成DNA加速，克隆直径增大。但是，b-FGF在促进增殖的同时，能维持骨髓基质细胞特殊的功能状态，即保持其成骨特性。Marth等[16]在含10% FBS的培养液中分别加入b-FGF、TGF-β、EGF、PDGF、IGF、GH和地塞米松各种因子进行比较，发现b-FGF 对骨髓基质细胞的作用效果最明显。b-FGF是一种毛细血管增殖刺激剂，能促进毛细血管向骨移植物中长入，加速需要血供的软骨内化骨，从而可增加成骨量，加快成骨速度[17]。使用b-FGF的主要缺点为，b-FGF能促进骨髓基质细胞转化为脂肪细胞，特别是与糖皮质激素联合应用时生成脂肪细胞的量更多。但这种缺点可通过和TGF-β联合应用而克服[15]。
因为各种因素各有其优缺点，所以目前倾向于多种因素联合使用或序贯使用。但最终目的无非是两个：(1)促进分裂增殖，增加细胞数量；(2)促进细胞向成骨细胞分化。联合使用，虽然可同时达到上述两个目的，但它们的效果也因相互作用而部分抵消。所以，以序贯使用不同因素为最好。国内外众多学者已经在这方面进行了许多尝试。Fromigue等[18]研究发现单独作用于骨髓基质细胞时，BMP-2促进分化，TGF-β2促进增殖；将BMP-2与TGF-β2联合使用，发现它们的作用部分相互抵消，都不如单独作用时明显。继而，他们通过两种途径来研究序贯方法，发现先用BMP-2作用9 d，会取消随后TGF-β2的促增殖作用；而先用TGF-β2处理10 d，不影响BMP-2的促分化作用。因此，在序贯使用多种因素时，应先使用促增殖的，后使用促分化的。
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基因疗法的兴起和使用，给组织工程研究者一个启示：能否利用基因工程方法将各种生长因子的基因转入成骨细胞，使细胞在增殖分化的同时表达所需的生长因子，继而通过自分泌或旁分泌途径来进一步促进其增殖和分化。王宏训等[19]从骨膜中分离培养出成骨细胞，用脂质体转染技术将BMP-2基因转入，发现转染的成骨细胞可有效表达BMP-2。Lieberman等[20]通过腺病毒将BMP-2基因转入培养的骨髓基质细胞系中后，1周内可有效表达；在此基础上，他们将转染后的治疗性细胞与脱钙骨复合后植入骨缺损模型处，X线及组织观察均可见骨缺损修复，且新生骨为含有骨髓的正常骨结构。转入促进血管生成的物质，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)的基因可促进血管的长入，利于成骨和改善局部血液循环。使用转基因方法的关键环节在于，如何有效地对转入基因进行调控，使之在不同阶段能适时表达和适量表达，从而在达到最佳的效果的同时，又能防止不良结果(如过度增殖等)的发生。
到目前为止，还未形成一套理想的骨髓基质细胞的获取和培养方法。为满足组织工程安全性和可靠性的要求，需要使用新的技术与产品进行更有效的培养。如采用流动装置将培养由静态转为动态，以便能及时换液而有效地去除废物、供给营养等，而不仅仅是简单地加入各种生长因子。
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参考文献
1 魏宽海，裴国献.组织工程化骨组织中成骨细胞来源的选择.国外医学·创伤与外科基本问题分册，1998，19(3)：155
2 Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gersimor UV et al. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet, 1987, 20(3): 263
3 Majors AK, Boehm CA, Nitto H et al. Characterization of human bone marrow stromal cells with respect to osteoblastic differentiation. J Orthop Res, 1997, 15(4): 546
, 百拇医药
4 Herbertson A, Aubin JE. Cell sorting enriches osteogenic population in rat bone marrow stromal cell cultures. Bone, 1997, 21(6): 491
5 Mudchler GF, Boehm C, Easley K et al. Aspiration to obtain osteoblast progenitor cells from human bone marrow: the influnce of aspiration volume. J Bone Joint Surg Am, 1997, 79(11): 1699
6 Cheng SL, Zhang SF, Avioli LV et al. Expression of bone matrix protein during dexamethasone-induced mineralization of human bone marrow stromal cells. J Cell Biochem, 1996, 61(2): 182
, 百拇医药
7 Yamaguchi T, Chattopadhyay N, Kifor O et al. Extracellular calcium (Ca2+(0))-sensing receptor in a murine bone marrow-derived stromal cell line (ST2): potential mediator of the actions of Ca2+(0) on the function of ST2 cells. Endocrinology, 1998, 139(8): 3561
8 Kelly KA, Gimble JM. 1,25-Dihydroxy vitamin D3 inhibits adipocyte differention and gene expression in murine bone marrow stromal cell clones and primary cultures. Endocrinology, 1998, 139(5): 2622
, http://www.100md.com
9 Erben RG, Scutt AM, Miao D et al. Short-term treatment of rats with high dose 1,25-Dihydroxy vitamin D3 stimulates bone formation and increases the number of osteoblast precursor cells in bone marrow. Endocrinology, 1997, 138(11): 4629
10 Maniatopoulos C, Sodek J, Melcher AH et al. Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Tissue Res,1998, 254:317
11 Wu X, Robinson CE, Fong HW et al. Analysis of the native murine bone morphogenetic protein serine threonine kinase type Ⅰ receptor (ALK-3). J Cell Physiol, 1996,168(2): 453
, 百拇医药
12 Puleo DA. Dependence of mesenchymal cell responses on duration of exposure to bone morphogenetic protein-2 in vitro. J Cell Physiol, 1997,173(1): 93
13 Bonewald LF, Mundy GR. Role of transforming growth beta in bone remodeling. Clin Orthop, 1990,250:261
14 Locklin RM, Williamson MC, Beresford JN et al. In vitro effects of growth factors and dexamethasone on rat marrow stromal cells. Clin Orthop, 1995,313:27
, 百拇医药
15 Mcdonald BR, Gowen M. Cytokines and bone. Br J Rheumat, 1992, 31(1):149
16 Marth I, Muraglia A, Campanile G et al. Fibroblasts growth factor-2 supports ex vivo expansion and maintenance of osteogenic precursors from human bone marrow. Endocrinology, 1997, 138(10): 4456
17 刘晋才.细胞因子与骨和软骨的修复.中华骨科杂志, 1998, 18(4):243
18 Fromigue O, Marie PJ, Lomri A. Bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta2 interact to modulate human bone marrow stromal cell proliferation and differentiation. J Cell Biochem, 1998, 68(4): 411
19 王宏训,朱盛修,乔 健. 骨膜成骨细胞分离培养及其BMP-2 cDNA基因转染的初步研究. 中华显微外科杂志, 1996, 19(4):273
20 Lieberman JR, Le LQ, Wu L et al. Reginal gene therapy with a BMP-2-producing murine stromal cell line induces heterotopic and orthotopic bone formation in rodents. J Orthop Res. 1998,16(3): 330
(收稿日期：1998-11-09), 百拇医药