显微注射法建成HLA-B27转基因大鼠*
作者：杨少锋 周秩林 张玉勋 乔贵林 吴启富 刘 毅 殷 震
单位：第一军医大学1中医系； 动物研究所，广州，510515 ;解放军军事兽医研究所，长春，130062
关键词：显微注射；HLA-B27；基因；转基因大鼠；强直性脊柱炎
第一军医大学学报990205 摘要：目的 构建带HLA-B27基因的转基因大鼠，进一步研究HLA-B27 与强直性脊柱炎(AS)的发病原因及其机理。方法 应用转基因技术，把已克隆的人类AS基因HLA-B27基因组DNA导入Wistar大鼠受精卵中，并移植到假孕母鼠输卵管内，21 d后，出生27只原代大鼠。结果 经过PCR检测阳性后，再继续进行Southern印迹分析，确认3只大鼠为带HLA-B27基因转基因大鼠，整合率为11.11 %，其中1只转基因大鼠出现外周关节炎及脊柱强直表现。结论 本研究进一步表明HLA-B27 与AS的强相关性，为研究AS病因病理及治疗打下了基础。
, 百拇医药
中图分类号：Q571; Q461
Establishment of HLA-B27 gene transgenic rats
Yang Shaofeng1, Zhou Yilin1, Zhang Yuxun2, Qiao Guilin3, Wu Qifu1, Liu Yi1, Yin Zhen3
1Department of TCM, 2Institute of Zoology, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 3Institute of Military Veterinary Medicine of PLA, Changchun , 130062Abstract: Objective To generate transgenic rats carrying HLA-B27 gene, and study the relationship between the HLA-B27 gene and the pathogenesis of ankylosing spondylitis (AS). Methods The cloned genomic DNA of human AS gene, HLA-B27, was injected by microinjection technique into the fertilized ovum of Wistar rats, which was then transplanted into the oviduct of pseudopregnant female rats. 27 transgenic rats (first generation) were born after 21 days. Results In these 27 rats, only 3 carried HLA-B27 gene, confirmed by PCR and Southern blotting technique. The integrity rate was 11.11% (3/27). Of these transgenic rats, only one rat showed peripheral arthritis and manifestations of AS. Conclusion This paper suggested that HLA-B27 gene has evident correlation with AS and this study has laid a foundation for the further study of the etiology, pathology and therapy of AS.
, 百拇医药
Key words: microinjection; HLA-B27gene; transgenic rats; ankylosing spondylitis
强直性脊柱炎(AS)是一种主要侵犯中轴关节以骶髂关节及肌腱端病变为临床特点的自身免疫性疾病。其病因及发病机制尚不明确，近二十年来的研究表明，人类白细胞抗原HLA-B27 与AS发病密切相关，90%以上AS病人HLA-B27 阳性，流行病学调查HLA-B27 阳性家族的遗传性亦得到了肯定，HLA-B27 与AS的起病、发生、发展、预防及治疗究竟有哪些联系，我们构建HLA-B27 转基因大鼠模型，为进一步研究它提供了有力的保证。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 实验基因质粒PHLA-B27由美国得克萨斯州 Joel D. Taurong 教授惠赠，经Eco RI单酶切，回收6.5 kb片段，再经超高速离心、过滤、除菌，纯化后溶于TE液中，浓度为2 mg/L，保存于-20 ℃供用。
1.2 实验动物 Wistar大鼠由农牧大学实验动物中心提供。
1.3 主要仪器 显微注射仪为德国Leitz公司产品，高速台式离心机(上海产)，恒温摇床(南京产)，稳压、稳流电泳仪，PCR-DNA扩增仪(北京产)。
1.4 主要试剂和酶 孕马血清促性腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、846麻醉针剂购自农牧大学军事兽医研究所；限制性内切酶购自宝生物工程有限公司；RNA酶购自东方科技公司；蛋白胨、酵母浸出物为GIBO公司产品；Taq DNA聚合酶、4×d NTP购自Promega公司；透明质酸酶购自Sigma公司；PCR引物由宝生物工程有限公司合成；DIG DNA探针标记及检测试剂盒为Boehringer Mannbeim公司产品。
, 百拇医药
1.5 M2和M16液的配制、雌鼠超排卵、公鼠的结扎、受精卵的显微注射方法及大鼠尾巴基因组DNA的提取 参见文献[ 1 ]。
1.6 转基因大鼠的制备 参照Hogan等叙述的操作步骤完成[2]。通过显微注射技术，将HLA-B27 基因注入大鼠受精卵的雄原核内。将注射存活的受精卵移植到假孕母鼠输卵管内，胚胎在供体母鼠子宫内发育，21 d后出生，幼鼠哺乳4周后断奶，雌、雄大鼠分笼饲养。
1.7 转基因大鼠的PCR检测 从仔鼠尾巴中抽提基因组DNA进行PCR分析。为排除内源性干扰，提高PCR检测特异性，根据文献[3]报道方法，在外显子3中设计上、下游引物。上游引物序列为P1 ：5，CGGCGGTCCAGGAGCT，下游引物序列为P2：5`GGGTCTCACACCCTCCAGAAT。两引物之间cDNA片段约为140 bp。PCR反应体系为：97。C预变性10 min后进入循环，反应条件为96℃变性10 s，66 ℃退火20 s，70 ℃延伸25 s，共30个循环，最后延伸10 min。所得产物在 1.7%琼脂糖凝胶上电泳检测结果[3]。
, 百拇医药
1.8 探针的标记方法 质粒pHLA-B27 经XbaI、Eco RI双酶切后，回收700 bp片段，用随机引物法标记探针[3]，标记及检测方法按试剂盒说明书进行。
1.9 Southern印迹试验 将从大鼠尾巴提取基因组DNA 20 μg，用Eco RI酶切过夜，在0.7 %的琼脂糖凝胶上电泳，凝胶的变性、中和、转膜按文献[4]进行，杂交及检测按DIG检测试剂盒说明书方法进行操作。
2 结果
2.1 本次转基因实验共注射受精卵187枚，存活142枚，分别移入5只假孕母鼠体内，生产仔鼠27只，死亡5只，存活22只，其中雄性13只、雌性9只。
2.2 22只注射DNA原代鼠尾巴提取DNA经PCR检测，结果7只呈阳性反应，其中雄性4只、雌性3只，( 图1 )。
, 百拇医药
图1 转基因大鼠的PCR检测结果
Fig.1 PCR results of HLA-B27 transgenic rats
2.3 转基因大鼠的Southern blotting检测方法 分别取7份PCR反应呈阳性鼠尾巴DNA基因组20μg，用EcoRI酶切，在0.7%的琼脂糖凝胶上电泳，将其转移至硝酸纤维素膜上，以DIG标记的约700 bp片段为探针，进行杂交检测，结果有3份呈阳性反应 ( 图2 ) , 由此确认有3只大鼠为“建成者HLA—B27 ”转基因大鼠。其中雄性2只，雌性1只。其中有1只大鼠出现外周关节炎及脊柱强直表现。
图2 转基因大鼠的Southern blotting检测结果
, 百拇医药
Fig.2 Southern blothing test results of HLA-B27 Transgenic rats
3 讨论
应用显微注射技术建成转基因小鼠于1980年在美国耶鲁大学由Gorden等[6]构建成功后，已广泛地在全世界展开。转基因技术已广泛地应用于医药领域，并取得了重大的进展。转基因动物的研制，转基因动物的表达受到多种原因影响，其中有顺式作用和反式作用因子的影响、染色体整合部位的影响，而HLA-B27 基因对AS的发病起着决定性的作用。目前已发现HLA-B2702 、HLA-B2704 、HLA-B2705 、HLA-B2706这四种亚型和AS密切相关[7]。在国际上，美国得克萨斯州Taurog、明尼苏达州David及荷兰阿姆斯特丹Ivanyi分别成功地把人HLA-B27 基因转入小鼠，并能使转基因鼠固定地表达，发生类似AS表现的损害，表现为脊柱强直、外周关节炎等临床症状。我们建成转基因大鼠亦发现有AS样临床表现，更加支持HLA-B27 为AS遗传易感基因；本实验显微注射受精卵的存活率为75.93%(142/187)、幼仔出生率为19.01%(27/142)、整合率为11.11%(3/27)，与国内外报道相一致，为进一步地研究AS的病因病理奠定了基础。
, http://www.100md.com
参考文献
1田小利，陈兰英，扈荣良主编. 转基因动物原理、技术与应用，长春:吉林科学技术出版社,1994.22～63
2 Hogan B, Costranini F, Lacy E. Manipulation embryo, a laboratory manual. New York:Cold Spring Harbor Labortory, 1986.153～181
3 Dominguez O, Coto E, Martinez-Naves E et al. Molecular typing of HLA-B27 alleles Immunogenetics. USA:1992.277～282
4 Sambrook J, Ffritsch E, Maniatis T. Molecular Cloning a Laboratory Manual. USA:1992.56-67
, 百拇医药
5 Taurog JD, Lowen L, Forman J et al. HLA-B27 in inbred and non-inbred transgenic mice-cell surface expression and recognition as an alloantigen in the absence of human β2-microglobulin. J immunol, 1998, 141 (6):4020
6 Gorden JW, Scangos GA, Plotkin DJ et al. Genetic transformation of mousr embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci USA,1980,77(1):7380
7 Woodrow JC. Genetics of the Spondyloarthropathies. Curr Opin Rheumatol,1991,3(4):586
(收稿日期：1999-03-17), http://www.100md.com
单位：第一军医大学1中医系； 动物研究所，广州，510515 ;解放军军事兽医研究所，长春，130062
关键词：显微注射；HLA-B27；基因；转基因大鼠；强直性脊柱炎
第一军医大学学报990205 摘要：目的 构建带HLA-B27基因的转基因大鼠，进一步研究HLA-B27 与强直性脊柱炎(AS)的发病原因及其机理。方法 应用转基因技术，把已克隆的人类AS基因HLA-B27基因组DNA导入Wistar大鼠受精卵中，并移植到假孕母鼠输卵管内，21 d后，出生27只原代大鼠。结果 经过PCR检测阳性后，再继续进行Southern印迹分析，确认3只大鼠为带HLA-B27基因转基因大鼠，整合率为11.11 %，其中1只转基因大鼠出现外周关节炎及脊柱强直表现。结论 本研究进一步表明HLA-B27 与AS的强相关性，为研究AS病因病理及治疗打下了基础。
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中图分类号：Q571; Q461
Establishment of HLA-B27 gene transgenic rats
Yang Shaofeng1, Zhou Yilin1, Zhang Yuxun2, Qiao Guilin3, Wu Qifu1, Liu Yi1, Yin Zhen3
1Department of TCM, 2Institute of Zoology, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 3Institute of Military Veterinary Medicine of PLA, Changchun , 130062Abstract: Objective To generate transgenic rats carrying HLA-B27 gene, and study the relationship between the HLA-B27 gene and the pathogenesis of ankylosing spondylitis (AS). Methods The cloned genomic DNA of human AS gene, HLA-B27, was injected by microinjection technique into the fertilized ovum of Wistar rats, which was then transplanted into the oviduct of pseudopregnant female rats. 27 transgenic rats (first generation) were born after 21 days. Results In these 27 rats, only 3 carried HLA-B27 gene, confirmed by PCR and Southern blotting technique. The integrity rate was 11.11% (3/27). Of these transgenic rats, only one rat showed peripheral arthritis and manifestations of AS. Conclusion This paper suggested that HLA-B27 gene has evident correlation with AS and this study has laid a foundation for the further study of the etiology, pathology and therapy of AS.
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Key words: microinjection; HLA-B27gene; transgenic rats; ankylosing spondylitis
强直性脊柱炎(AS)是一种主要侵犯中轴关节以骶髂关节及肌腱端病变为临床特点的自身免疫性疾病。其病因及发病机制尚不明确，近二十年来的研究表明，人类白细胞抗原HLA-B27 与AS发病密切相关，90%以上AS病人HLA-B27 阳性，流行病学调查HLA-B27 阳性家族的遗传性亦得到了肯定，HLA-B27 与AS的起病、发生、发展、预防及治疗究竟有哪些联系，我们构建HLA-B27 转基因大鼠模型，为进一步研究它提供了有力的保证。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 实验基因质粒PHLA-B27由美国得克萨斯州 Joel D. Taurong 教授惠赠，经Eco RI单酶切，回收6.5 kb片段，再经超高速离心、过滤、除菌，纯化后溶于TE液中，浓度为2 mg/L，保存于-20 ℃供用。
1.2 实验动物 Wistar大鼠由农牧大学实验动物中心提供。
1.3 主要仪器 显微注射仪为德国Leitz公司产品，高速台式离心机(上海产)，恒温摇床(南京产)，稳压、稳流电泳仪，PCR-DNA扩增仪(北京产)。
1.4 主要试剂和酶 孕马血清促性腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、846麻醉针剂购自农牧大学军事兽医研究所；限制性内切酶购自宝生物工程有限公司；RNA酶购自东方科技公司；蛋白胨、酵母浸出物为GIBO公司产品；Taq DNA聚合酶、4×d NTP购自Promega公司；透明质酸酶购自Sigma公司；PCR引物由宝生物工程有限公司合成；DIG DNA探针标记及检测试剂盒为Boehringer Mannbeim公司产品。
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1.5 M2和M16液的配制、雌鼠超排卵、公鼠的结扎、受精卵的显微注射方法及大鼠尾巴基因组DNA的提取 参见文献[ 1 ]。
1.6 转基因大鼠的制备 参照Hogan等叙述的操作步骤完成[2]。通过显微注射技术，将HLA-B27 基因注入大鼠受精卵的雄原核内。将注射存活的受精卵移植到假孕母鼠输卵管内，胚胎在供体母鼠子宫内发育，21 d后出生，幼鼠哺乳4周后断奶，雌、雄大鼠分笼饲养。
1.7 转基因大鼠的PCR检测 从仔鼠尾巴中抽提基因组DNA进行PCR分析。为排除内源性干扰，提高PCR检测特异性，根据文献[3]报道方法，在外显子3中设计上、下游引物。上游引物序列为P1 ：5，CGGCGGTCCAGGAGCT，下游引物序列为P2：5`GGGTCTCACACCCTCCAGAAT。两引物之间cDNA片段约为140 bp。PCR反应体系为：97。C预变性10 min后进入循环，反应条件为96℃变性10 s，66 ℃退火20 s，70 ℃延伸25 s，共30个循环，最后延伸10 min。所得产物在 1.7%琼脂糖凝胶上电泳检测结果[3]。
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1.8 探针的标记方法 质粒pHLA-B27 经XbaI、Eco RI双酶切后，回收700 bp片段，用随机引物法标记探针[3]，标记及检测方法按试剂盒说明书进行。
1.9 Southern印迹试验 将从大鼠尾巴提取基因组DNA 20 μg，用Eco RI酶切过夜，在0.7 %的琼脂糖凝胶上电泳，凝胶的变性、中和、转膜按文献[4]进行，杂交及检测按DIG检测试剂盒说明书方法进行操作。
2 结果
2.1 本次转基因实验共注射受精卵187枚，存活142枚，分别移入5只假孕母鼠体内，生产仔鼠27只，死亡5只，存活22只，其中雄性13只、雌性9只。
2.2 22只注射DNA原代鼠尾巴提取DNA经PCR检测，结果7只呈阳性反应，其中雄性4只、雌性3只，( 图1 )。
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图1 转基因大鼠的PCR检测结果
Fig.1 PCR results of HLA-B27 transgenic rats
2.3 转基因大鼠的Southern blotting检测方法 分别取7份PCR反应呈阳性鼠尾巴DNA基因组20μg，用EcoRI酶切，在0.7%的琼脂糖凝胶上电泳，将其转移至硝酸纤维素膜上，以DIG标记的约700 bp片段为探针，进行杂交检测，结果有3份呈阳性反应 ( 图2 ) , 由此确认有3只大鼠为“建成者HLA—B27 ”转基因大鼠。其中雄性2只，雌性1只。其中有1只大鼠出现外周关节炎及脊柱强直表现。
图2 转基因大鼠的Southern blotting检测结果
, 百拇医药
Fig.2 Southern blothing test results of HLA-B27 Transgenic rats
3 讨论
应用显微注射技术建成转基因小鼠于1980年在美国耶鲁大学由Gorden等[6]构建成功后，已广泛地在全世界展开。转基因技术已广泛地应用于医药领域，并取得了重大的进展。转基因动物的研制，转基因动物的表达受到多种原因影响，其中有顺式作用和反式作用因子的影响、染色体整合部位的影响，而HLA-B27 基因对AS的发病起着决定性的作用。目前已发现HLA-B2702 、HLA-B2704 、HLA-B2705 、HLA-B2706这四种亚型和AS密切相关[7]。在国际上，美国得克萨斯州Taurog、明尼苏达州David及荷兰阿姆斯特丹Ivanyi分别成功地把人HLA-B27 基因转入小鼠，并能使转基因鼠固定地表达，发生类似AS表现的损害，表现为脊柱强直、外周关节炎等临床症状。我们建成转基因大鼠亦发现有AS样临床表现，更加支持HLA-B27 为AS遗传易感基因；本实验显微注射受精卵的存活率为75.93%(142/187)、幼仔出生率为19.01%(27/142)、整合率为11.11%(3/27)，与国内外报道相一致，为进一步地研究AS的病因病理奠定了基础。
, http://www.100md.com
参考文献
1田小利，陈兰英，扈荣良主编. 转基因动物原理、技术与应用，长春:吉林科学技术出版社,1994.22～63
2 Hogan B, Costranini F, Lacy E. Manipulation embryo, a laboratory manual. New York:Cold Spring Harbor Labortory, 1986.153～181
3 Dominguez O, Coto E, Martinez-Naves E et al. Molecular typing of HLA-B27 alleles Immunogenetics. USA:1992.277～282
4 Sambrook J, Ffritsch E, Maniatis T. Molecular Cloning a Laboratory Manual. USA:1992.56-67
, 百拇医药
5 Taurog JD, Lowen L, Forman J et al. HLA-B27 in inbred and non-inbred transgenic mice-cell surface expression and recognition as an alloantigen in the absence of human β2-microglobulin. J immunol, 1998, 141 (6):4020
6 Gorden JW, Scangos GA, Plotkin DJ et al. Genetic transformation of mousr embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci USA,1980,77(1):7380
7 Woodrow JC. Genetics of the Spondyloarthropathies. Curr Opin Rheumatol,1991,3(4):586
(收稿日期：1999-03-17), http://www.100md.com