抗CD3/CD45双特异抗体激活的效应细胞对白血病细胞的杀伤效应
作者：吴秉毅 郭坤元 陈一方 严定安 王小宁
单位：第一军医大学1珠江医院血液科，广州，510282；分子免疫研究所，广州，510515
关键词：双特异性性抗体；杀伤效应；白血病
第一军医大学学报990203 摘要： 目的 探讨双特异性抗体用于白血病自体干细胞移植体外净化的可能性。方法 以抗CD3/CD45双特异性抗体激活外周血单个核细胞，以HL60为靶，用LDH方法测定杀伤效应。结果 靶效比例不同时，抗CD3/CD45激活的效应细胞对HL60细胞都表现出杀伤效应。结论 抗CD3/CD45可能用于骨髓/造血干细胞移植的体外净化。
中图分类号： R733.7; R392.9
The cytolysis of HL-60 cells induced by anti-CD3/CD45 bispecific antibody by activated-mononuclear cells
, 百拇医药
Wu Bingyi1, Guo Kunyuan1, Cheng Yifang1, Yang Dingan1,Wang Xiaoning2
1Department of Hematology, Zhujiang Hospital , First Military Medical University, Guangzhou,510280; 2Institute of Molecular Immunology, Fist Military Medical University,Guangzhou,510515Abstract: Objective To determine the possibility of use of anti-CD3/CD45 bispecific antibody to purge leukemia cells from auto-stem cells, cytolysis of HL-60 cells induced by anti-CD3/CD45-activated mononuclear cells were studied. Material and Methods HL-60 cells and anti-CD3/CD45-activated mononuclear cells were co-cultured , and were measured to indicate the cytolysis of leukemia cells. Results The cytolysis of HL60 cells by anti-CD3/CD45-activated mononuclear cells were observed at different stages of the culture, different times, and different ratios of HL-60 to mononuclear cells. Conclusions Anti-CD3/CD45 bispecific antibody may be used to purge leukemia cells from auto-stem cells .
, 百拇医药
Key words: bispecific antibody; cytolysis ;leukemia
耐药白血病细胞是白血病化疗及移植后复发的主要原因。双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAB)能特异介导效应细胞杀伤靶细胞，为清除体内残留白血病细胞提供了新途径。为研究BsAB及其激活的细胞对白血病细胞的效应，我们用抗CD3/CD45 BsAB激活的单个核细胞对白血病HL60细胞的作用进行了初步研究，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 抗CD3/CD45双特异性抗体的制备 参照文献[1]。
1.2 HL60细胞、抗CD3/CD45双特异性抗体激活的单个核细胞的制备 HL-60取自军事医学科学院，本科保存。细胞复苏后用含10%小牛血清RPMI 1640培养基培养，收集对数生长期细胞备用。正常人外周肝素抗凝血用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，加入抗 CD3/CD45 BsAB 制备抗CD3/CD45激活单个核细胞。
, http://www.100md.com
1.3 抗CD3/CD45激活的单个核细胞对HL60细胞的杀伤作用 将抗CD3/CD45激活的单个核细胞与HL-60细胞按不同比例加入96孔培养板(重复3孔)培养不同时间测上清LDH酶活性(计算3孔平均值)，同时设立空白组为自然释放组，用1% NP-40溶解细胞作最大稀放组。按下述公式计算抗CD3/CD45双特异性抗体对HL-60细胞的杀伤率。杀伤率(%)＝LDH(实验孔-对照组-自然释放)/LDH(最大释放-自然释放)×100%
2 结果和讨论
2.1 当激活的单个核细胞(效应细胞)与HL-60细胞(靶细胞)比例固定(效：靶＝10：1)、抗CD3/CD45 BsAB在 10~160 μg/L时，效应细胞对靶细胞的杀伤随BsAB浓度增加亦增强，表现出明显的剂量依赖关系。当抗 CD3/CD45 为160 μg/L时，对HL-60细胞杀伤率为76.7%,进一步增加抗CD3/CD45浓度,对HL-60细胞的杀伤作用无明显增加。
, 百拇医药
2.2 当BsAB浓度一定时，抗CD3/CD45激活的单个核细胞对HL60细胞杀伤与靶效比有关，当靶：效< 50:1时，杀伤作用与靶效比例成线性关系；当靶：效>50:1，进一步增加效应细胞，对HL-60的杀伤作用无明显增强。
2.3 抗CD3/CD45激活的单个核细胞与HL-60作用2 h即显示出对HL-60细胞明显的杀伤效应，杀伤效应随作用时间延长而增强，最大杀伤效应在作用16 h之后。
抗CD3/CD45双特异性抗体是由抗CD3单克隆抗体及抗CD45单克隆抗体通过化学交联法制备的杂交分子，既能与T细胞特异性结合，又能与HL-60细胞上CD45抗原结合。我们的实验表明抗CD3/CD45双特异性抗体能使T细胞与HL-60 细胞特异结合，并对HL-60有较强的杀伤作用。抗CD3/CD45激活的细胞对HL-60细胞的细胞毒作用与抗CD3/CD45浓度、靶效比例及作用时间有关。研究表明，CD45抗原在白血病细胞上有较高的表达[2]。因此，CD45有望成为效应细胞杀伤表达CD45的白血病细胞的靶抗原。但CD45也存在与正常细胞膜上，因此，抗CD3/CD45激活的效应细胞在发挥效应时可能会杀伤正常细胞。我们的研究也证实这一点。但CD45在造血干、祖细胞上无表达，因此，抗CD3/CD45激活的效应细胞不会对干、祖细胞发挥效应。可见抗CD3/CD45激活的效应细胞可用于骨髓/造血干细胞移植的体外净化及白血病化疗缓解后体内残留白血病细胞的清除。但有待于进一步研究证实。
, 百拇医药
参考文献
1 Martin GJ, Harry MM , Andrew WT et al. Preparation and performance of bispecific F(ab'r)2 antibody containing thioeter-linked Fab'r fragments. J Immuno, 1987 ,139:2367
2 Di Noto R，Schiavone EM,Ferrara F et al. Expression and A-driven modulation of adhesion molecules in promyelocytic leukemia. Leukemia, 1994,8(11):1900
(收稿日期：1998-07-27), http://www.100md.com
单位：第一军医大学1珠江医院血液科，广州，510282；分子免疫研究所，广州，510515
关键词：双特异性性抗体；杀伤效应；白血病
第一军医大学学报990203 摘要： 目的 探讨双特异性抗体用于白血病自体干细胞移植体外净化的可能性。方法 以抗CD3/CD45双特异性抗体激活外周血单个核细胞，以HL60为靶，用LDH方法测定杀伤效应。结果 靶效比例不同时，抗CD3/CD45激活的效应细胞对HL60细胞都表现出杀伤效应。结论 抗CD3/CD45可能用于骨髓/造血干细胞移植的体外净化。
中图分类号： R733.7; R392.9
The cytolysis of HL-60 cells induced by anti-CD3/CD45 bispecific antibody by activated-mononuclear cells
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Wu Bingyi1, Guo Kunyuan1, Cheng Yifang1, Yang Dingan1,Wang Xiaoning2
1Department of Hematology, Zhujiang Hospital , First Military Medical University, Guangzhou,510280; 2Institute of Molecular Immunology, Fist Military Medical University,Guangzhou,510515Abstract: Objective To determine the possibility of use of anti-CD3/CD45 bispecific antibody to purge leukemia cells from auto-stem cells, cytolysis of HL-60 cells induced by anti-CD3/CD45-activated mononuclear cells were studied. Material and Methods HL-60 cells and anti-CD3/CD45-activated mononuclear cells were co-cultured , and were measured to indicate the cytolysis of leukemia cells. Results The cytolysis of HL60 cells by anti-CD3/CD45-activated mononuclear cells were observed at different stages of the culture, different times, and different ratios of HL-60 to mononuclear cells. Conclusions Anti-CD3/CD45 bispecific antibody may be used to purge leukemia cells from auto-stem cells .
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Key words: bispecific antibody; cytolysis ;leukemia
耐药白血病细胞是白血病化疗及移植后复发的主要原因。双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAB)能特异介导效应细胞杀伤靶细胞，为清除体内残留白血病细胞提供了新途径。为研究BsAB及其激活的细胞对白血病细胞的效应，我们用抗CD3/CD45 BsAB激活的单个核细胞对白血病HL60细胞的作用进行了初步研究，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 抗CD3/CD45双特异性抗体的制备 参照文献[1]。
1.2 HL60细胞、抗CD3/CD45双特异性抗体激活的单个核细胞的制备 HL-60取自军事医学科学院，本科保存。细胞复苏后用含10%小牛血清RPMI 1640培养基培养，收集对数生长期细胞备用。正常人外周肝素抗凝血用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，加入抗 CD3/CD45 BsAB 制备抗CD3/CD45激活单个核细胞。
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1.3 抗CD3/CD45激活的单个核细胞对HL60细胞的杀伤作用 将抗CD3/CD45激活的单个核细胞与HL-60细胞按不同比例加入96孔培养板(重复3孔)培养不同时间测上清LDH酶活性(计算3孔平均值)，同时设立空白组为自然释放组，用1% NP-40溶解细胞作最大稀放组。按下述公式计算抗CD3/CD45双特异性抗体对HL-60细胞的杀伤率。杀伤率(%)＝LDH(实验孔-对照组-自然释放)/LDH(最大释放-自然释放)×100%
2 结果和讨论
2.1 当激活的单个核细胞(效应细胞)与HL-60细胞(靶细胞)比例固定(效：靶＝10：1)、抗CD3/CD45 BsAB在 10~160 μg/L时，效应细胞对靶细胞的杀伤随BsAB浓度增加亦增强，表现出明显的剂量依赖关系。当抗 CD3/CD45 为160 μg/L时，对HL-60细胞杀伤率为76.7%,进一步增加抗CD3/CD45浓度,对HL-60细胞的杀伤作用无明显增加。
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2.2 当BsAB浓度一定时，抗CD3/CD45激活的单个核细胞对HL60细胞杀伤与靶效比有关，当靶：效< 50:1时，杀伤作用与靶效比例成线性关系；当靶：效>50:1，进一步增加效应细胞，对HL-60的杀伤作用无明显增强。
2.3 抗CD3/CD45激活的单个核细胞与HL-60作用2 h即显示出对HL-60细胞明显的杀伤效应，杀伤效应随作用时间延长而增强，最大杀伤效应在作用16 h之后。
抗CD3/CD45双特异性抗体是由抗CD3单克隆抗体及抗CD45单克隆抗体通过化学交联法制备的杂交分子，既能与T细胞特异性结合，又能与HL-60细胞上CD45抗原结合。我们的实验表明抗CD3/CD45双特异性抗体能使T细胞与HL-60 细胞特异结合，并对HL-60有较强的杀伤作用。抗CD3/CD45激活的细胞对HL-60细胞的细胞毒作用与抗CD3/CD45浓度、靶效比例及作用时间有关。研究表明，CD45抗原在白血病细胞上有较高的表达[2]。因此，CD45有望成为效应细胞杀伤表达CD45的白血病细胞的靶抗原。但CD45也存在与正常细胞膜上，因此，抗CD3/CD45激活的效应细胞在发挥效应时可能会杀伤正常细胞。我们的研究也证实这一点。但CD45在造血干、祖细胞上无表达，因此，抗CD3/CD45激活的效应细胞不会对干、祖细胞发挥效应。可见抗CD3/CD45激活的效应细胞可用于骨髓/造血干细胞移植的体外净化及白血病化疗缓解后体内残留白血病细胞的清除。但有待于进一步研究证实。
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参考文献
1 Martin GJ, Harry MM , Andrew WT et al. Preparation and performance of bispecific F(ab'r)2 antibody containing thioeter-linked Fab'r fragments. J Immuno, 1987 ,139:2367
2 Di Noto R，Schiavone EM,Ferrara F et al. Expression and A-driven modulation of adhesion molecules in promyelocytic leukemia. Leukemia, 1994,8(11):1900
(收稿日期：1998-07-27), http://www.100md.com